劉科峰，裴婷，劉樹迎，李子卿，平蘇寧，王晶晶，汪泓，盛璞義，李朝紅*

（1湘南學院組織胚胎學教研室，郴州423000；2中山大學中山醫(yī)學院人體解剖與組織胚胎學教研室，廣州510080 ；3中山大學附屬第一醫(yī)院骨外科教研室，廣州510080）

辛伐他汀抑制機械牽張力和氧化低密度脂蛋白所致血管平滑肌細胞全基因組甲基化水平的降低

劉科峰1,2，裴婷2，劉樹迎2，李子卿3，平蘇寧2，王晶晶2，汪泓2，盛璞義3，李朝紅2*

（1湘南學院組織胚胎學教研室，郴州423000；2中山大學中山醫(yī)學院人體解剖與組織胚胎學教研室，廣州510080 ；3中山大學附屬第一醫(yī)院骨外科教研室，廣州510080）

目的 探討小鼠血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）在機械牽張力（stretch stress, SS）和氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein, oxLDL）作用下全基因組甲基化水平的變化，并進一步考察辛伐他汀(simvastatin, SⅠM)對此變化的影響。方法 血漿制備氧化型低密度脂蛋白，體外常規(guī)培養(yǎng)VSMCs，施加機械牽張力和/或氧化型低密度脂蛋白，或用辛伐他汀預處理1h后再施加刺激，用熒光探針5-甲基胞嘧啶檢測VSMCs全基因組甲基化水平。以細胞免疫熒光定量陽性率和SPSS統(tǒng)計軟件對甲基化水平進行分析。結(jié)果 機械牽張力 和氧化型低密度脂蛋白均可降低VSMCs的全基因組甲基化水平，且兩者聯(lián)合作用大于單一因素，辛伐他汀預處理VSMCs可部分抑制機械牽張力和/或氧化低密度脂蛋白誘導的全基因組甲基化水平降低。 結(jié)論 機械牽張力和氧化低密度脂蛋白可分別促進VSMCs全基因組甲基化水平降低，當兩者共處理時呈相加作用，辛伐他汀可部分抑制上述效應(yīng)。

辛伐他汀；機械牽張力；氧化低密度脂蛋白；全基因組甲基化；血管平滑肌細胞；動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是指在動脈及其分支的動脈壁內(nèi)膜及內(nèi)膜下有脂質(zhì)沉著，同時伴有中膜平滑肌細胞遷移至內(nèi)膜并大量增殖，使內(nèi)膜增厚， 形成黃色或灰黃色狀如粥樣物質(zhì)的斑塊。其斑塊可發(fā)生破裂，造成血栓而導致嚴重的不良后果，嚴重威脅著人體健康。DNA甲基化是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶催化作用下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將活化的甲基引入DNA鏈中，形成5-甲基胞嘧啶的過程。甲基化的DNA可導致DNA結(jié)合蛋白與DNA主螺旋溝的結(jié)合能力降低，從而在不改變DNA堿基序列的基礎(chǔ)上調(diào)控基因的表達。目前已有研究證據(jù)表明，DNA甲基化變化在AS進程中發(fā)揮重要的作用。 Silvio Zaina[1]等采用鳥槍測序法對供體匹配的健康人和動脈粥樣硬化患者的主動脈進行比較觀察發(fā)現(xiàn)，相比于健康動脈，動脈發(fā)生粥樣硬化的部分在很多位點上都表現(xiàn)出過度甲基化，而且用高密度DNA甲基化微陣列和一系列的供體匹配樣本進行分析，發(fā)現(xiàn)這些DNA甲基化程度有變異的位點。對同一樣本的DNA甲基化特征與相應(yīng)的基因表達數(shù)據(jù)相對照，證實了DNA甲基化在該病中的重要性。這些甲基化程度存在差異的CpG與動脈粥樣硬化的發(fā)生有關(guān)，而且鑒定出其中與內(nèi)皮和平滑肌功能相關(guān)的基因。Ping 等[2]研究發(fā)現(xiàn)，ABCG1和GALNT2基因啟動子高甲基化狀態(tài)與冠心病危險的增加明顯相關(guān)，吸煙和年齡可以影響DNA甲基化水平。這些研究結(jié)果都表明細胞DNA甲基化的變化與AS密切相關(guān)。而誘發(fā)AS的危險因素有很多，比如高血壓產(chǎn)生的機械牽張力（SS）和高血脂氧化低密度脂蛋白（oxLDL）均可誘發(fā)AS，而且當兩者并存時可協(xié)同促進AS。OxLDL對血管平滑肌細胞(VSMCs)的作用機制已有較多報道[3,4]，而高血壓產(chǎn)生的SS對VSMCs的作用前期亦有一些研究報道，有研究顯示，SS伴或不伴去甲腎上腺素可通過Gαq 蛋白或ERK 信號通路誘導VSMCs增殖[5]。還有研究報道，SS伴或不伴晚期糖基化終末產(chǎn)物可促進VSMCs增殖和ERK信號通路激活[6]。然而，SS伴或不伴oxLDL對VSMCs全基因組甲基化的影響還未見報道。

辛伐他汀是HMG-COA還原酶抑制劑，作為降血脂藥物主要通過降低血清總膽固醇來達到治療目的。我們前期研究發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可以抑制SS和/或oxLDL誘導的VSMCs ERK磷酸化增加，從而抑制血管增生[7]。后又發(fā)現(xiàn)其可以抑制SS和/或oxLDL誘導的巨噬細胞ROS產(chǎn)生增加[8]。而辛伐他汀對SS和/或oxLDL誘導的VSMCs全基因組甲基化水平的影響目前尚無報道。

本研究對體外培養(yǎng)的VSMCs分別給予SS、oxLDL刺激以及合并兩因素同時處理，觀察VSMCs在接受刺激后細胞內(nèi)全基因組甲基化水平的變化及辛伐他汀對此作用的影響，旨在探討高血脂、高血壓狀態(tài)下VSMCs如何參與As的發(fā)生發(fā)展，并為闡明辛伐他汀在AS血管重塑中的作用機制提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1 細胞與試劑

所用VSMCs來源于體外分離 C57BL /6J 小鼠的主動脈中膜進行原代培養(yǎng)獲得，胰蛋白酶、H-Glucose DMEM 培養(yǎng)基購于Gibco公司；辛伐他?。╯imvastatin，SⅠM）、核熒光染料 DAPⅠ購于Sigma-aldrich公司；胎牛血清購于浙江天杭生物科技有限公司；牛血清白蛋白( bovine serum albumin，BSA) 購于Amersco公司；5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mc）抗體購于Eurogen公司；FⅠTC 標記驢抗小鼠熒光二抗購于Jackson Ⅰmmuno Research公司。

2 細胞培養(yǎng)

將VSMCs 以 5×104/ml 的密度接種于6孔硅膠牽拉板中，用含 10% 標準胎牛血清的 DMEM 高糖培養(yǎng)基在 37℃、5%CO2 培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24h后換用無血清培養(yǎng)基同步化處理細胞 24h。

3 SIM工作液的配制

于瓶裝SⅠM粉末中加入 95% 乙 醇 100μl,再加入15μl 0.1mol/L NaOH溶液, 于50℃ 水浴箱中靜置2h，最后定容到 1ml，分裝后于4℃保存，即為 10 mmol /L（5g /L） 的儲存液。

4 OxLDL的制備[9]

血漿解凍后裝入透析袋埋入聚乙二醇中濃縮，NaBr調(diào)整血漿密度為1.2g/ml后加入到離心管中，并加入1.063g/ml和1.020g/ml的NaCl溶液，4℃、50000r/min離心5h，收集 nLDL帶。在0.01mol/L PBS透析72h， 4 ℃下 每隔 12h換液一次。加入終濃度為10μmol/L 的CuSO4溶液， 37℃水浴氧化12～16h。氧化完成后，加入終濃度為10μmol/L的EDTA終止氧化。加入1mmol/L EDTA、0.9% NaCl，4℃下透析48h，每8h換液一次。然后在0.01mol/L PBS中透析24h，4℃下每8h換液一次。透析結(jié)束后，測定蛋白濃度。用0.22μm微孔濾膜過濾，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5 OxLDL和SIM共同作用下對VSMCs全基因組甲基化水平的影響

采用SⅠM（2.0μmol/L）預處理靜息狀態(tài)的VSMCs1h后，加入oxLDL（濃度50μg/ml）作用1h，并繼續(xù)培養(yǎng)23h，另設(shè)兩組對照：SⅠM處理組，僅使用2.0μmol/L SIM處理細胞; 陰性對照組，不施加任何因素。免疫熒光檢測VSMCs全基因組甲基化水平。

6 SS和SIM共同作用下對VSMCs 全基因組甲基化水平的影響

采用SⅠM（2.0μmol/L）預處理靜息狀態(tài)的VSMCs 1h后，通過Flexcell-2000細胞儀給予 SS[10]處理（牽拉強度10%[6]，60min），并繼續(xù)培養(yǎng)23h。另設(shè)兩組對照：SⅠM處理組，僅使用2.0μmol/L SIM處理細胞；陰性對照組，不施加任何因素。免疫熒光檢測VSMC全基因組甲基化水平。細胞牽拉儀裝置中的真空泵可產(chǎn)生循環(huán)負壓，牽拉VSMCs可模擬體內(nèi)血壓作用于血管壁的VSMCs。

7 SS、oxLDL和SIM共同作用下對VSMCs全基因組甲基化水平的影響

采用SⅠM（2.0μmol/L）預處理靜息狀態(tài)的VSMCs 1h后，給予SS（牽拉強度10%，60min）和/或oxLDL（濃度50μg/ml，60min），并繼續(xù)培養(yǎng)23h。另設(shè)兩組對照：SⅠM處理組，僅使用2.0μmol/L SⅠM處理細胞；陰性對照組，不施加任何因素。免疫熒光檢測VSMCs 全基因組甲基化水平。

8 免疫熒光檢測VSMCs全基因組甲基化水平

用3%多聚甲醛固定已處理的細胞，1%Triton-X-100/PBS破膜10min，5-甲基胞嘧啶（5mc，1:200）抗體（Eurogen）和Cy3標記的第二抗體（JacksonⅠmmunoResearch公司）孵育；用DAPⅠ復染細胞核；由5mc陽性染色（綠色）鑒定DNA甲基化細胞。DNA甲基化指數(shù)計算為5mc陽性細胞占細胞總數(shù)的百分比。使用熒光顯微鏡對細胞進行檢測和拍照。

9 統(tǒng)計學方法

實驗所得數(shù)據(jù)采用ˉx ± s表示，采用 SPSS20.0數(shù)據(jù)包進行處理，組間比較采用方差分析，LSD法進行組間兩兩比較，以 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 SIM預處理抑制OxLDL對VSMCs內(nèi)全基因組甲基化水平的下調(diào)

免疫熒光檢測顯示，與未用SⅠM預處理的陰性對照組VSMCs比較（圖1A），50μg/ml oxLDL處理的VSMCs全基因組甲基化水平明顯下調(diào)（圖1B）；2.0μmol/L SIM處理25h不影響VSMCs全基因組甲基化水平（圖1C)，但用2.0μmol/L SIM預處理1h后再用50μg/ml oxLDL處理， oxLDL誘導的全基因組甲基化水平下調(diào)明顯減輕（圖1D，圖1E）。

圖1 SⅠM對oxLDL誘導的VSMCs內(nèi)全基因組甲基化的影響。A，陰性對照組；B，oxLDL處理組；C，SⅠM處理組；D，SⅠM和oxLDL共處理組；E，細胞全基因組甲基化水平統(tǒng)計學分析；a，與陰性對照組相比，P＜0.01；b，與oxLDL處理組比較，0.01＜P＜0.05；scale bar, 50μmFig. 1 Effects of SIM on genome-wide methylation induced by oxLDL. A, Negative control; B, oxLDL(OX) treatment alone; C, SIM treatment alone; D, Treatment with both of SⅠM and oxLDL; E, Statistical analysis for genome-wide methylation level. a, P＜0.01, compared with negative control group; b, 0.01＜P＜0.05, compared with oxLDL treatment group; scale bar, 50μm.

2 SIM預處理抑制SS對VSMCs內(nèi)全基因組甲基化水平的下調(diào)

與oxLDL處理相似， SS處理的VSMCs其全基因組甲基化水平明顯低于未用SⅠM預處理的陰性對照組VSMCs（圖2A，圖2B）；而用2.0μmol/L SIM預處理1h后再進行SS處理，SS誘導的全基因組甲基化水平的下調(diào)被部分抑制（圖2D，圖2E）。

圖2 SⅠM對SS誘導的VSMCs內(nèi)全基因組甲基化的影響。A，陰性對照組；B，SS處理組；C，SⅠM處理組；D，SⅠM和SS共處理組；E，細胞全基因組甲基化水平統(tǒng)計學分析；a，與陰性對照組相比，P＜0.01；b，與SS處理組比較，0.01＜P＜0.05；scale bar, 50μmFig. 2 Effects of SIM on genome-wide methylation induced by SS. A, Negative control; B, SS treatment alone; C, SIM treatment alone; D, Treatment with both of SⅠM and oxLDL; E, Statistical analysis for genome-wide methylation level; a, P＜0.01, compared with negative control group; b, 0.01＜P＜0.05, compared with SS group; scale bar, 50μm.

3 SIM預處理抑制SS和oxLDL聯(lián)合作用對VSMCs全基因組甲基化水平的下調(diào)

OxLDL（濃度50μg/ml）和SS（牽拉強度10%）聯(lián)合處理的VSMCs其全基因組甲基化水平明顯低于未用SⅠM預處理的陰性對照組VSMCs（圖3A，圖3D），并小于任一單因素的作用水平，呈相加效應(yīng)（圖3B，圖3C，圖3D），但用2.0μmol/L SIM預處理1h后再進行SS和 oxLDL聯(lián)合處理，SS和oxLDL聯(lián)合誘導的全基因組甲基化水平的下調(diào)被部分抑制（圖3H，圖3Ⅰ）。

討 論

研究證實，全基因組甲基化與AS發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。將Apoe-/-小鼠中主動脈早期粥樣硬化組織和C57BL/6對照鼠中主動脈組織比較，發(fā)現(xiàn)粥樣硬化組織呈現(xiàn)顯著的全基因低甲基化狀態(tài)，并且發(fā)現(xiàn)其發(fā)生早于動脈粥樣硬化的組織學證據(jù)[11]。在人、大鼠和兔子的進展性斑塊中全基因組均呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)[12-14]，這種基因組低甲基化是否促進動脈粥樣硬化的發(fā)展，還有待研究。另外，粥樣硬化斑塊中不同的細胞可能各自呈現(xiàn)獨特的甲基化方式，OxLDL可通過促進內(nèi)皮細胞全基因組甲基化水平升高而減少細胞凋亡，加速AS的發(fā)生發(fā)展[15]，還可通過上調(diào)巨噬細胞胱硫醚γ-裂解酶（CSE）啟動子甲基化水平可促進泡沫細胞的形成，加速AS的進程[16]。由于細胞DNA甲基化變化與動脈粥樣硬化密切相關(guān)，因此探討SS和/或oxLDL對VSMCs DNA甲基化的影響具有重要的意義。本研究依照前期的實驗基礎(chǔ)，施加強度為10%的SS，可下調(diào)VSMCs內(nèi)全基因組甲基化水平，當SS與oxLDL合并處理時，DNA甲基化水平降低更明顯。為了研究SⅠM對SS和/或oxLDL誘導的DNA甲基化水平的影響，采用SⅠM預處理細胞1h，結(jié)束后施加SS和/或oxLDL，發(fā)現(xiàn)SⅠM可抑制上述作用。因此本研究具有以下幾個方面的意義：首先，SS誘導VSMCs內(nèi)全基因組DNA甲基化水平下降，進一步揭示了高血壓在促進As發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用；其次，SS與oxLDL共存進一步增加SS對VSMCs內(nèi)全基因組DNA甲基化水平的下調(diào)效應(yīng)，可部分解釋臨床上高血壓與高血脂并發(fā)時AS加速的現(xiàn)象，同時還揭示了辛伐他汀除了已知的降血脂作用外，在延緩AS血管重塑病變進展中的作用機制。

在哺乳動物中，甲基化主要發(fā)生在DNA分子CpG雙核苷酸序列的胞嘧啶上，CpG的甲基化通常情況下與基因沉默相關(guān)，直接調(diào)控細胞的增殖與凋亡[17]，已有研究發(fā)現(xiàn)，oxLDL可通過促進VSMCs p21基因甲基化誘導其增殖加速AS。Hiltunen等[18]發(fā)現(xiàn)，發(fā)生動脈粥樣硬化的人和載脂蛋白E(Apoli-po-protein E，ApoE) 基因敲除鼠，動脈斑塊部位以及增殖的VSMCs中，基因組出現(xiàn)低甲基化。這些資料均表明VSMCs內(nèi)DNA甲基化變化引起細胞增殖是導致AS的重要機制之一，本研究首次證實了高血壓產(chǎn)生的SS可促進VSMC全基因組甲基化水平降低，SS和oxLDL聯(lián)合處理時可產(chǎn)生相加效應(yīng)，亦首次證實了辛伐他汀可抑制上述作用。但本研究也存在一些不足，我們在前期的研究中發(fā)現(xiàn)[7]，SS和/或oxLDL可促進VSMCs增殖，那么SS和/或oxLDL誘導的VSMCs全基因組甲基化水平下降與細胞增殖有何關(guān)系？SS和oxLDL如何促進DNA甲基化水平降低？這些都將是本研究需要深入關(guān)注的問題。

圖3 SⅠM對SS和oxLDL誘導的VSMCs內(nèi)全基因組甲基化水平的影響。A，陰性對照組；B，oxLDL處理組；C，SS處理組；D，SS+oxLDL共處理組；E，SⅠM處理組；F，SⅠM+oxLDL共處理組；G， SⅠM+SS共處理組；H，SⅠM+SS+oxLDL共處理組；Ⅰ，細胞全基因組甲基化水平統(tǒng)計學分析。a，與陰性對照組相比，P＜0.01；b，與同組內(nèi)未加SⅠM處理組比較，0.01＜P＜0.05；c，與單獨ox處理組或SS處理組比較，0.01＜P＜0.05；scale bar, 50μmFig. 3 Effects of SIM on genome-wide methylation induced by SS and oxLDL. A, negative control; B, oxLDL treatment alone; C, SS treatment alone; D, Treatment with both of oxLDL and SS;E, SⅠM treatment alone; F, Treatment with both of SⅠM and oxLDL; G, Treatment with both of SⅠM and SS; H, Treatment with SⅠM,SS and oxLDL; Ⅰ, Statistical analysis for genome-wide methylation level; a, P＜0.01, compared with negative control group; b, 0.01＜P＜0.05, compared with the same group without SⅠM; c, 0.01＜P＜0.05, compared with oxLDL treatment group or SS treatment group; scale bar, 50μm

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Simvastatin inhibits genome-wide methylation in mouse vascular smooth muscle cells induced by stretch stress and oxidized low density lipoprotein

Liu Kefeng1,2, Pei Ting1, Liu Shuying1, Li Ziqing3, Ping Suning1, Wang Jingjing1, Wang Hong1, Sheng Puyi3, Li Chaohong2?
(1Department of Histology and Embryology, Xiangnan University, Chenzhou 423000, China;2Department of Histology and Embryology, Zhongshan School of Medicine,Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, China;3Departments of orthopedic Surgery, Sun Yat-sen University First Affiliated Hospital, Guangzhou 510080,China)

Objective To investigate genome-wide methylation in mouse vascular smooth muscle cells (VSMCs) induced by stretch stress(SS) and oxidized low-density lipoprotein (oxLDL), and the role of simvastatin in this process. Methods VSMCs were treated with SS and/or oxLDL prepared from plasma with or without pre-incubation of simvastatin for 60 min. The methylation was detected using 5-methylcytosine fluorescent probe. The level of methylation was determined by fluorescence positive rate which was quantified using SPSS analysis. Results Either SS or ox-LDL decreased the genome-wide methylation of VSMCs. The combination of both caused more significant reduction. Simvastatin partly inhibited the effect induced by SS and/or oxLDL. Conclusion Both SS and ox-LDL can reduce genome - wide methylation in VSMCs independently, and to a higher degree when applied together. Simvastatin can partly abolish this effect.

Simvastatin; stretch stress; oxidized low-density lipoprotein; genome-wide methylation; vascular smooth muscle cells; atherosclerosis

R34

A DOⅠ：10.16705/ j. cnki. 1004-1850.04.008

2017-04-18

2017-08-02

國家自然科學基金項目(81070124、81500337)；廣東省科技計劃項目( 2014A020212109)；湖南省教育廳資助科研項目（12C0893）；湖南省重點建設(shè)學科資金資助（湘教發(fā) [2011] 76 號）

劉科峰，女（1978 年），漢族，博士

*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)：lichaoh@mail.sysu.edu.cn