林凌，張更，邱榮暉，羅道樞，林清

（福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與組織學(xué)胚胎學(xué)系，神經(jīng)生物學(xué)研究中心，福州 350122)

新生期缺氧缺血大鼠腦白質(zhì)損傷及腦內(nèi)Fyn、p-ERK和MBP下調(diào)

林凌，張更，邱榮暉，羅道樞，林清*

（福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與組織學(xué)胚胎學(xué)系，神經(jīng)生物學(xué)研究中心，福州 350122)

目的 檢測(cè)新生大鼠缺氧缺血后腦內(nèi)酪氨酸蛋白激酶Fyn、p-ERK及髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein, MBP）表達(dá)的變化，探討Fyn-ERK通路在缺氧缺血腦白質(zhì)損傷中的作用。方法 新生3日齡SD大鼠24只，隨機(jī)分為對(duì)照組和缺氧缺血（HⅠ）組。缺氧缺血后4周，應(yīng)用HE染色法觀察腦組織病理學(xué)改變；應(yīng)用免疫熒光染色法和Western blot法觀察Fyn、p-ERK及MBP在大鼠腦內(nèi)的定位定量表達(dá)變化。結(jié)果 HE染色顯示缺氧缺血大鼠出現(xiàn)缺氧缺血腦白質(zhì)損傷病理改變；免疫熒光染色和Western blot檢測(cè)顯示腦內(nèi)Fyn、p-ERK和MBP水平均明顯下調(diào)。結(jié)論 新生期缺氧缺血損傷4周后，可能通過Fyn與p-ERK水平的下調(diào)而使MBP減少，進(jìn)而使少突膠質(zhì)細(xì)胞成熟障礙，引起腦白質(zhì)損傷。

新生期缺氧缺血；Fyn蛋白；髓鞘堿性蛋白；腦白質(zhì)

缺氧缺血腦白質(zhì)損傷（hypoxic-ischemic white matter injury，WMⅠ）是早產(chǎn)兒腦損傷的重要類型，可致患兒出現(xiàn)腦癱、智力低下、視聽障礙等多種后遺癥，給社會(huì)和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)[1]。缺氧缺血WMⅠ的主要病理改變是髓鞘生成障礙，腦白質(zhì)變稀疏甚至軟化。WMⅠ中髓鞘生成障礙的具體機(jī)制仍未明確，目前依舊是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

Src蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinases, PTKs）家族成員共有10 種，具有高度同源性，分別由不同基因編碼，通過調(diào)節(jié)蛋白酪氨酸磷酸化，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、遷移和細(xì)胞形態(tài)的維持[2]。Fyn 是該家族的一員，是細(xì)胞內(nèi)一種非受體型酪氨酸激酶[3]。大量研究表明，F(xiàn)yn信號(hào)通路可通過激活髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein, MBP）基因而在髓鞘形成中發(fā)揮不可或缺的作用[4,5]。當(dāng)新生大鼠腦白質(zhì)發(fā)生炎癥后Fyn表達(dá)量降低，髓鞘形成障礙[6]。那么，F(xiàn)yn信號(hào)通路在新生大鼠發(fā)生缺氧缺血損傷中是否發(fā)揮同樣的作用？目前未見文獻(xiàn)報(bào)道。對(duì)這一問題的研究將有助于進(jìn)一步明確缺氧缺血WMⅠ的發(fā)病機(jī)制，具有重要意義。故本研究擬通過結(jié)扎新生3日齡SD大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈及缺氧法建立缺氧缺血（hypoxia-ischemia, HⅠ）損傷模型，應(yīng)用HE染色法觀察腦組織病理學(xué)改變，采用免疫熒光組織化學(xué)染色法和Western blot法檢測(cè)HⅠ后4周大鼠Fyn、p-ERK及MBP在腦內(nèi)的變化，探討Fyn-ERK 通路在缺氧缺血腦白質(zhì)損傷中的作用。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

新生3日齡SD大鼠24只，體質(zhì)量8.00～11.00g，雌雄不拘，由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(閩)2012-0001]，應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組和缺氧缺血HⅠ組。小鼠抗大鼠MBP抗體（美國(guó)abcam公司）；兔抗大鼠Fyn抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；兔抗大鼠ERK、p-ERK抗體（美國(guó)cst公司）；Alexa Fluor488標(biāo)記的山羊抗小鼠ⅠgG；Alexa Fluor555標(biāo)記的山羊抗兔ⅠgG（美國(guó)invitrogen公司）；小鼠抗大鼠GAPDH抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔ⅠgG、山羊抗大鼠ⅠgG及免疫印跡相關(guān)試劑（碧云天生物技術(shù)研究所） 。

2 缺氧缺血損傷模型制作

參照本實(shí)驗(yàn)室原有方法[7]稍加改進(jìn)。無水乙醚麻醉大鼠，無菌條件下作長(zhǎng)約0.5cm頸腹側(cè)正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，以8-0顯微外科手術(shù)縫線完全結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈后縫合皮膚；術(shù)后在37℃水浴箱內(nèi)放置10min，至體溫和活動(dòng)恢復(fù)正常，返籠飼養(yǎng)。返籠恢復(fù)2h后，將大鼠置于低壓氧倉(cāng)全自動(dòng)控制儀（南京柏曼信息科技服務(wù)中心，XF-XC06-Ⅰ）以8%的氧氣缺氧30min。對(duì)照組大鼠僅分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，不予結(jié)扎及缺氧。

3 組織切片標(biāo)本制備

缺氧缺血后4周分別取對(duì)照組和HⅠ組大鼠各6只，10﹪水合氯醛（3ml/kg）麻醉后，通過左心室插管灌注生理鹽水；待流出清亮液體后續(xù)以4﹪多聚甲醛灌注固定。每組取3只大鼠行石蠟包埋HE染色，另3只行冰凍切片用于免疫熒光染色。

4 免疫熒光染色

對(duì)腦組織進(jìn)行冰凍切片，片厚25μm，行漂片染色。以免疫熒光顯色封閉液室溫封閉2h；傾去封閉液，分別滴加小鼠抗大鼠MBP抗體（1:200）、兔抗大鼠Fyn抗體（1:200）和兔抗大鼠p-ERK抗體（1:200），4℃孵育過夜；用0.01mol/L PBS清洗后，分別滴加Alexa Fluor488標(biāo)記的山羊抗小鼠ⅠgG和AlexaFluor555標(biāo)記的山羊抗兔ⅠgG（1:200），37℃孵育2h；DAPⅠ（1mg/L）染核5min，抗熒光淬滅封片劑封片。激光掃描共聚焦顯微鏡（德國(guó)，Leica SP8）下觀察，綠色激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射波長(zhǎng)為500～530nm；紅色激發(fā)波長(zhǎng)為543nm，發(fā)射波長(zhǎng)為560～600nm；藍(lán)色激發(fā)波長(zhǎng)為405nm，發(fā)射波長(zhǎng)為420～450nm。陰性對(duì)照組以PBS代替一抗進(jìn)行染色。

5 Western blot檢測(cè)

缺氧缺血后4周分別取對(duì)照組和HⅠ組大鼠各6只，以RⅠPA裂解液提取大鼠腦組織總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。每孔上樣量為50μg蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)于PVDF膜。脫脂奶粉封閉，加入兔抗大鼠Fyn、ERK、p-ERK抗體（1:1000）4℃孵育過夜和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔ⅠgG、抗小鼠ⅠgG（1:1000）室溫孵育1h或加入小鼠抗大鼠MBP（1:1000）4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠ⅠgG（1:1000）室溫孵育1h，清洗后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光、顯影和定影，生物分子成像儀（日本，LAS 4000 mini）成像。以GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用ⅠmageJ 2.1圖像分析系統(tǒng)對(duì)Western blot結(jié)果進(jìn)行光密度分析，以各組目的蛋白條帶光密度值對(duì)內(nèi)參蛋白光密度值計(jì)算相對(duì)比值（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差），采用SPSSl9.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。以P＜0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 缺氧缺血使腦白質(zhì)纖維排列紊亂

于缺氧缺血后4周取腦組織行HE染色，結(jié)果顯示：對(duì)照組腦白質(zhì)（胼胝體）纖維排列致密、整齊（圖1A），缺氧缺血組腦白質(zhì)纖維排列稀疏、紊亂（圖1B）。

2 缺氧缺血降低腦組織內(nèi)Fyn、p-ERK和MBP水平

免疫熒光染色顯示，缺血缺氧組Fyn免疫反應(yīng)陽性物較相應(yīng)對(duì)照組少（圖2），且在胼胝體部位，F(xiàn)yn表達(dá)于細(xì)胞胞體和突起（圖2A2，圖2B2），而在海馬則表達(dá)于神經(jīng)元胞核（圖2A3，圖2B3）。缺氧缺血組p-ERK表達(dá)量亦較相應(yīng)對(duì)照組下降（圖3），并且p-ERK表達(dá)于胼胝體細(xì)胞突起（圖3A2，圖3B2）和海馬神經(jīng)元胞體（圖3A3，圖3B3）。缺氧缺血組MBP免疫反應(yīng)陽性物較相應(yīng)對(duì)照組減少（圖4）；局部放大后可見對(duì)照組腦白質(zhì)MBP免疫反應(yīng)陽產(chǎn)性物排列整齊、致密、突起較長(zhǎng)（圖4A2），而缺氧缺血組MBP免疫反應(yīng)陽性物排列較紊亂、稀疏、突起變短（圖4B2）。

圖1 缺氧缺血腦白質(zhì)病理學(xué)變化的HE染色檢測(cè)。cc，胼胝體；A2和B2分別為A1和B1中方框內(nèi)cc的高倍像；比例尺：A1和B1，100μm;；A2和B2，10μmFig. 1 The pathological changes in hypoxic-ischemic rat brain. The corpus callosum (cc) region was examined using HE staining. A1: Control rat; B1: Hypoxia-ischemic rat; A2and B2 Boxed regions at higher magnification from A1 and B1 respectively. Scale bar: 100μm in A1 and B1; 10μm in A2 and B2

提取各組大鼠腦組織總蛋白，以Western blot檢測(cè)Fyn、ERK、p-ERK及MBP水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，缺氧缺血組Fyn和MBP水平顯著下降、p-ERK與總ERK的比例明顯降低（圖5）。

討 論

本研究通過永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈聯(lián)合缺氧法致使新生大鼠發(fā)生缺氧缺血損傷，應(yīng)用HE染色法觀察腦組織病理學(xué)改變，應(yīng)用免疫熒光組織化學(xué)染色法和Western blot 法觀察Fyn、p-ERK和MBP在腦內(nèi)水平變化。我們發(fā)現(xiàn)，在缺氧缺血后4周，腦白質(zhì)纖維變稀疏，F(xiàn)yn、p-ERK及MBP的表達(dá)量均較對(duì)照組明顯減少，并且Fyn在胼胝體與海馬的表達(dá)部位不同。

Fyn在海馬表達(dá)于細(xì)胞核，參與神經(jīng)元的活動(dòng)，缺氧缺血后其水平顯著下降，這與廖家萬[8]等的研究結(jié)果相一致。他們認(rèn)為低氧可使大鼠海馬神經(jīng)元Fyn表達(dá)降低。而在胼胝體Fyn主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和突起，由于胼胝體主要成分是少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元突起，故筆者推測(cè)，胼胝體中Fyn可能主要作用于少突膠質(zhì)細(xì)胞，但Fyn在海馬與胼胝體表達(dá)部位不同的具體原因及機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

圖2 免疫熒光檢測(cè)缺氧缺血對(duì)腦組織Fyn水平的影響。cc，胼胝體；HP，海馬；A2和B2，分別為A1和B1中方框內(nèi)CC的高倍像；A3和B3，分別為A1和B1中方框內(nèi)HP的高倍像；比例尺：A1和B1，100μm；A2、A3和B2、B3，25μm。Fig. 2 The effects of hypoxia-ischemia on brain Fyn level. cc, corpus callosum; HP, hippocampus; A2 and B2, the images of cc at higher magnification from A1 and B1, respectively; A3 and B3, the images of HP at higher magnification from A1 and B1, respectively; scale bar: 100μm in A1 and B1; 25μm in A2, A3, B2 and B3

圖3 免疫熒光檢測(cè)缺氧缺血對(duì)腦組織p-ERK水平的影響。cc，胼胝體；HP，海馬；A2和B2，分別為A1和B1中方框內(nèi)CC的高倍像；A3和B3，分別為A1和B1中方框內(nèi)HP的高倍像；比例尺：A1和B1，100μm；A2、A3和B2、B3，25μm。Fig. 3 The effects of hypoxia-ischemia on the brain p-ERK level. cc, corpus callosum; HP, hippocampus; A2 and B2, the high magnification images of cc in A1 and B1; A3 and B3, the high magnification images of HP in A1 and B1; scale bar: 100μm in A1 and B1; 25μm in A2, A3, B2 and B3

圖4 免疫熒光檢測(cè)缺氧缺血對(duì)腦白質(zhì)MBP水平的影響。A2和B2，分別為A1和B1中方框內(nèi)白質(zhì)的高倍像；比例尺：A1和B1，100μm；A2和B2，25μm。Fig.4 The effect of hypoxia-ischemia on MBP level in the white matter of brain; A2 and B2, the high magnification images of the white matter in the frames from A1 and B1; scale bar: 100μm in A1 and B1; 25μm in A2 and B2

圖5 缺血缺氧下調(diào)腦白質(zhì)Fyn、p-ERK、MBP水平。A，F(xiàn)yn、p-ERK、MBP水平代表性Western blot檢測(cè)；B，F(xiàn)yn水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；C，p-ERK水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；D，MBP水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析； *，與對(duì)照組相比，0.01＜P＜0.05Fig.5 The effect of hypoxia-ischemia on the Fyn, p-ERK, MBP level of brain white matter. A, levels of Fyn, p-ERK, MBP were determined by western blot; B, statistic analysis for Fyn level; C, statistic analysis for p-ERK level; D, statistic analysis for MBP level; *, 0.01＜P＜ 0.05, compared with the control

由于WMⅠ患兒認(rèn)知和行為學(xué)障礙通常在幼兒期才明顯固定化，而1月齡大鼠在神經(jīng)發(fā)育上相當(dāng)于人類2～5歲幼兒[9]。且研究表明，新生大鼠缺氧缺血后4周可見早期少突膠質(zhì)前體細(xì)胞大量增殖，但新生的早期少突膠質(zhì)前體細(xì)胞雖可向晚期少突膠質(zhì)前體細(xì)胞發(fā)育，卻無法進(jìn)一步分化為成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞及產(chǎn)生髓鞘蛋白[10,11]。因此，為明確少突膠質(zhì)細(xì)胞無法分化成熟是否與Fyn相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)選擇缺氧缺血后4周作為觀測(cè)點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新生大鼠缺氧缺血后4周，腦組織中的Fyn和MBP水平下降，并且組織學(xué)顯示腦白質(zhì)纖維排列疏松，說明Fyn水平下降可能引起髓鞘生成障礙，這與其它報(bào)道大致吻合。已有的研究證實(shí)，F(xiàn)yn可誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生遷移[12]，促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞和施萬細(xì)胞的成熟和發(fā)育[13,14]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘形成過程中具有不可或缺的作用。Goto等的研究則顯示，F(xiàn)yn基因敲除小鼠與野生型小鼠相比，少突膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量減少且形態(tài)發(fā)生改變，胼胝體稀疏[15]。Xie等發(fā)現(xiàn)，新生大鼠腦白質(zhì)發(fā)生炎癥后Fyn含量降低，髓鞘形成障礙[6]。這些研究共同提示Fyn在髓鞘生成中發(fā)揮重要作用，這有賴于Fyn的特性。Fyn為細(xì)胞內(nèi)非受體型酪氨酸激酶，為Src家族蛋白酪氨酸激酶中的一員，可通過促使酪氨酸磷酸化發(fā)揮作用，酪氨酸激酶磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與髓鞘形成過程中信號(hào)的傳導(dǎo)，其中包括 MAPK/ERK 等信號(hào)傳導(dǎo)通路[16]。因此，本研究進(jìn)一步觀察了ERK的磷酸化水平，結(jié)果顯示缺氧缺血后4周p-ERK的表達(dá)降低，由此我們推測(cè)，ERK磷酸化水平下降可能與Fyn水平下調(diào)有關(guān)。

缺氧缺血腦白質(zhì)損傷為早產(chǎn)兒腦損傷的常見類型，主要病理表現(xiàn)為髓鞘合成障礙，腦白質(zhì)變疏松甚至軟化。WMⅠ可致存活患兒出現(xiàn)腦癱、認(rèn)知障礙、視覺異常等嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，至今仍缺乏有效的防治措施。本研究發(fā)現(xiàn)新生大鼠缺氧缺血后，F(xiàn)yn水平下調(diào)、ERK磷酸化水平降低，同時(shí)MBP水平也明顯下調(diào)。由此提示，新生期腦缺氧缺血后可能通過Fyn-ERK通路蛋白的下調(diào)而使MBP水平降低，進(jìn)而使髓鞘生成障礙，少突膠質(zhì)細(xì)胞成熟障礙，最終導(dǎo)致腦白質(zhì)損傷。但缺氧缺血如何誘導(dǎo)Fyn表達(dá)下降有待進(jìn)一步的研究加以證實(shí)。

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Hypoxic-ischemic white matter injury and down-regulation of Fyn, p-ERK and MBP in neonatal rat brain

Lin Ling, Zhang Geng, Qiu Ronghui, Luo Daoshu, Lin Qing*
（Department of Human Anatomy, Histology and Embryology, School of Basic Medical Science, Research Center for Neurobiology, Fujian Medical University, Fuzhou 350122, China）

Objective To understand the role that Fyn-ERK pathway plays in hypoxic-ischemic white matter injury in neonatal rats. Methods 3-day-old new born SD rats were randomly divided into control and hypoxic-ischemic groups. The histology of rat brain tissues 4 weeks after operation was examined using HE staining. The distribution and expression level of Fyn, p-ERK and MBP protein were detected by immunocytochemistry and western blotting. Results The white matter injury was observed in hypoxic-ischemic rats. The levels of Fyn, p-ERK and MBP protein significantly decreased in the brains of hypoxic-ischemic rats, compared to the control group. Conclusion The results suggest that hypoxia-ischemia may decrease MBP level in neonatal rats through downregulating Fyn and p-ERK protein levels, which may lead to oligodendrocyte maturation disorder and white matter injury.

Neonatal hypoxia-ischemia; Fyn protein; myelin basic protein; white matter

R722.6

A DOⅠ：10.16705/ j. cnki. 1004-1850.04.004

2017-04-25

2017-08-02

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（81501305）；福建省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（JA13135）

林凌，女（1982 年），漢族，碩士，實(shí)驗(yàn)師

*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)：linqing522@126.com