鄭小燕，冉建華，劉剛，侯良絹

（1重慶三峽中心醫(yī)院感染科，萬州404000；重慶醫(yī)科大學2基礎醫(yī)學院解剖學教研室，3神經(jīng)科學研究中心，重慶400016；4重慶三峽醫(yī)藥高等專科學?；A醫(yī)學部解剖學教研室；5重慶市抗腫瘤天然藥物工程技術研究中心，萬州404120）

睡眠剝奪小鼠肝臟中腫瘤壞死因子α表達上調(diào)

鄭小燕1，冉建華2,3，劉剛1，侯良絹4,5*

（1重慶三峽中心醫(yī)院感染科，萬州404000；重慶醫(yī)科大學2基礎醫(yī)學院解剖學教研室，3神經(jīng)科學研究中心，重慶400016；4重慶三峽醫(yī)藥高等專科學?；A醫(yī)學部解剖學教研室；5重慶市抗腫瘤天然藥物工程技術研究中心，萬州404120）

目的 探討睡眠剝奪（sleep deprivation, SD）對小鼠肝臟形態(tài)、功能的影響及腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor, TNF-α）表達的意義。方法 C57雄性小鼠隨機分為正常對照組、睡眠剝奪24h、48h和72h組，全自動生化分析儀檢測血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase, ALT），谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase, AST）的活性，硫代巴比妥酸法檢測肝組織丙二醛（malonaldehyde, MDA）含量，黃嘌呤氧化酶法檢測肝組織超氧化物歧化酶（superoxidedismutase, SOD）活性；采用HE染色檢測肝組織學特征，免疫組織化學染色和Western blot檢測肝組織TNF-α表達水平。結果 隨睡眠剝奪時間延長肝臟組織中，SOD表達量下降，MDA表達量增加；ALT、AST水平在睡眠剝奪24h后顯著增高，48h、72h表達水平持續(xù)增高；HE染色可見睡眠剝奪組小鼠出現(xiàn)肝細胞腫脹、排列不規(guī)則、肝小葉結構破壞、Kupffer細胞增生、大量炎癥細胞浸潤；免疫組織化學及免疫印跡顯示，睡眠剝奪組小鼠肝臟中TNF-α的表達隨睡眠剝奪時間的延長而表達持續(xù)增加。結論 睡眠剝奪后肝細胞過氧化脂質(zhì)作用誘發(fā)氧化應激導致小鼠肝臟形態(tài)和功能受損，活化TNF-α，誘發(fā)炎癥反應，加重對肝臟的損害。

睡眠剝奪；肝臟；腫瘤壞死因子α；氧化應激

現(xiàn)代社會由于環(huán)境改變，節(jié)奏加快，加上人們不良生活方式使得人們睡眠時間逐漸減少或睡眠不足，一般24 h內(nèi)睡眠少于6～8h就認為發(fā)生了睡眠剝奪（sleep deprivation, SD）[1]。睡眠剝奪是一種類似缺氧的病理過程可引起一系列心理、生理功能的改變，對機體造成損害。大量實驗研究表明[2-3]，睡眠剝奪對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血液循環(huán)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)都會造成損傷。睡眠剝奪后活性氧自由基（reactive oxide species, ROS）釋放增加，組織細胞抗氧化能力下降引起氧化應激反應是造成機體出現(xiàn)損傷的主要機制之一。由ROS引起的氧化應激參與炎癥、腫瘤、免疫等多種疾病的生理病理過程[4]。肝臟是機體物質(zhì)代謝的重要器官，肝細胞含有豐富的線粒體，是ROS攻擊的主要器官之一。然而，睡眠剝奪對小鼠肝臟形態(tài)和功能的影響研究較少。因此，本實驗選用改良多平臺睡眠剝奪裝置制作不同程度的小鼠睡眠剝奪模型，探討睡眠剝奪后對小鼠肝臟組織形態(tài)、功能及TNF-α表達的影響。為改變不健康的生活方式，更好的保護肝臟，預防肝病、降低肝病發(fā)病率及延緩慢性肝病的發(fā)展提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 動物分組與睡眠剝奪模型制作

8～12周、重量匹配（19～21g）、清潔級雄性C57小鼠40只由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供。將小鼠隨機分為4組，每組10只：正常對照組（Control），睡眠剝奪24 h（SD 24 h）組，睡眠剝奪48 h（SD 48h）組，睡眠剝奪72h（SD 72 h）組。

選用改良多平臺水環(huán)境方法[5]（Modified Multiple Platform Water Environmental Method，MMPWM）制作不同程度的睡眠剝奪模型。實驗箱為30cm× 30cm×20cm透明樹脂水箱，其內(nèi)分別安放10個直徑2cm、高5cm的圓形平臺，各平臺間距離為5cm。箱內(nèi)注入水，低于平臺約2cm，平臺上方籠蓋處放置水瓶和飼料，小鼠在平臺上自由進食和飲水，若其睡眠，會因肌張力降低落入水中驚醒而爬回平臺，多次重復造成小鼠睡眠剝奪。正常對照組除平臺直徑為15cm外，其余條件與睡眠剝奪組一致。實驗期間日光燈持續(xù)照射，室內(nèi)溫度保持在23～25℃，每日更換實驗箱的水和飼料。

2 主要試劑

免疫組織化學試劑盒和DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），兔抗TNF-α多克隆抗體（武漢博士德生物技術有限公司），總蛋白提取試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），過氧化物酶標記的山羊抗兔ⅠgG（南京生興生物技術有限公司）；過氧化物酶化學發(fā)光ECL試劑盒（Millipore，美國），SOD、MDA檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（上海生工生物工程有限公司），其它試劑為國產(chǎn)分析純。

3 肝組織中MDA含量和SOD活性測定

取各組小鼠肝組織稱重，50μg肝組織用0.9%生理鹽水1：10冰上稀釋勻漿，3500 r/min 4℃離心20min，取上清備用。采用硫代巴比妥酸（TBA）法檢測丙二醛（malonaldehyde, MDA）含量，黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶（superoxidedismutase, SOD）活性，酶標儀檢測550nm波長OD值。

4 血清ALT和AST活性測定

各組小鼠在規(guī)定的時間點以3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)眶后靜脈叢取血，將靜脈血滴入1.5 ml消毒的EP管中靜置15 min，以3500r/min離心20min，上清液采用Modular P800型全自動生化分析儀（美國羅氏公司）檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的活性。

5 HE染色

各組小鼠取血后，開胸暴露心臟，生理鹽水40ml經(jīng)左心室插入升主動脈沖洗后再用30ml 4%多聚甲醛灌注固定；取出肝臟置于4%多聚甲醛后固定72h；脫水、透明后石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚5μm。切片經(jīng)二甲苯和梯度酒精脫蠟水化后，蘇木素染色3min，自來水沖洗5min。鹽酸酒精分化15s，自來水沖洗20min，蒸餾水浸泡5min，伊紅染色1 min，梯度酒精脫水、脫色，最后用中性樹膠封片。光鏡下觀察小鼠肝臟組織的形態(tài)學變化。

6 TNF-α免疫組織化學染色

肝切片經(jīng)二甲苯和梯度酒精脫蠟水化后，0.01mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）抗原修復（水浴90℃，30min），PBS沖洗5min×3次，3%H2O2溶液去除內(nèi)源性過氧化物酶活性10min，PBS沖洗5min×3次，滴加山羊血清工作液封閉非特異性結合位點，37℃孵育30min；滴加一抗稀釋液稀釋的TNF-α（1:200），濕盒4℃孵育過夜；第2天37℃復溫35min，PBS沖洗5min×3次后滴加生物素二抗工作液，37℃孵育45 min，PBS沖洗5min×3次，滴加SABC 室溫20min，PBS沖洗5min×3次，DAB顯色，蘇木素復染，脫水、透明后中性樹膠封片。每組隨機選取10張切片，每片隨機選取5個不疊加視野，20×物鏡下觀察拍照，采用Ⅰmage Pro Plus6.0軟件對TNF-α陽性細胞的累積光密度（integrated option density，ⅠOD）值進行定量分析。

7 TNF-α免疫印跡

處死各組小鼠，取肝臟50mg加入蛋白裂解液，冰上徹底勻漿后靜置30min，10000 r/min 4 ℃離心10min，取上清即為各組肝組織總蛋白。采用Bradford法測定蛋白濃度，50μg蛋白恒定上樣，10%SDSPAGE凝膠電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉100min，滴加兔抗TNF-α多克隆抗體(1:300)，4℃孵育過夜，第2天復溫1h，TBST洗膜后滴加HRP標記的山羊抗兔二抗（1:5000）37℃ 2h，TBST洗膜后ECL顯色液顯色，膠片曝光。Ⅰmage J軟件對蛋白條帶半定量分析。

8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS18.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，以P＜0.05表示有統(tǒng)計學意義，GraphPad Prism5軟件作圖。

結 果

1 睡眠剝奪小鼠肝組織MDA含量增加SOD活性下降

與正常對照組比較，睡眠剝奪后小鼠肝組織的MDA含量增加，SOD活性下降；隨著剝奪時間的延長，MDA含量持續(xù)增高，SOD活性持續(xù)下降（表1）。

表1 肝組織MDA含量和SOD活性Tab. 1 MDA content and SOD activity in liver tissue

2 睡眠剝奪小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性升高

血清ALT水平在正常對照組小鼠為29.3± 6.91U/L，睡眠剝奪后顯著升高，其中SD 24h后達118.7±19.02U/L，SD 48h后達160.1±17.53U/L，SD 7h后高達179.9±13.26U/L（圖1）。與ALT相似，血清AST水平在正常對照組為138.4± 33.78U/L，在睡眠剝奪后也逐漸升高，其中SD 24h后達367.8±99.33U/L，SD 48h后達614.8±84.41U/L，SD 72h后高達683.5±138.90U/L（圖1）。

圖1 睡眠剝奪對小鼠血清ALT和AST水平的影響。*，與正常對照組比較，P＜0.01Fig.1 Effect of sleep deprivation on the levels of ALT and AST in the sera of mice. *, P＜0.01, compared with the control group

3 睡眠剝奪破壞小鼠肝組織結構

正常對照組小鼠肝細胞呈多邊形，胞核大圓，居中，胞質(zhì)豐富無空泡狀，肝細胞排列規(guī)則呈索狀（圖2A）。睡眠剝奪24h組肝細胞形態(tài)不規(guī)則，肝細胞輕度水腫，核固縮，肝血竇腔隙明顯擴大（圖2B）。睡眠剝奪48h組，肝細胞中度水腫，細胞空泡狀，肝細胞排列紊亂形態(tài)不規(guī)則，肝小葉結構被破壞，在相鄰的肝小葉間有大量炎癥細胞浸潤（圖2C）。睡眠剝奪72h組，肝細胞重度水腫，氣球樣變，空泡樣變性，在中央靜脈周圍和門管區(qū)有大量炎癥細胞浸潤，Kupffer細胞增生，肝小葉結構被嚴重破壞（圖2D）。

4 睡眠剝奪上調(diào)小鼠肝組織內(nèi)TNF-α

免疫組織化學染色顯示，TNF-α陽性產(chǎn)物主要分布在胞質(zhì)內(nèi)，胞核僅有少量表達（圖3）。正常對照組小鼠肝臟組織中TNF-α免疫反應極弱或陰性（圖3A）；睡眠剝奪24h組，TNF-α免疫反應性較正常對照組增強，陽性產(chǎn)物呈淺棕色（圖3B）；隨著睡眠剝奪時間的延長，TNF-α在免疫反應性進一步增強，陽性產(chǎn)物逐漸加深呈深棕黃色（圖3C，圖3D）。應用Ⅰmage Pro Plus6.0軟件對肝細胞內(nèi)TNF-α陽性產(chǎn)物進行定量測定分析顯示，正常對照組、SD 24h組、SD 48h組和SD 72h小鼠肝組織內(nèi)TNF-α陽性產(chǎn)物的ⅠOD值分別是： 0、32.80±7.48、63.55±10.26和92.91±10.41，ⅠOD值隨著睡眠剝奪組時間的增加而逐漸升高（P＜0.01）

圖2 睡眠剝奪對小鼠肝組織結構影響HE染色檢測。A，對照組；B，SD 24h組；C，SD 48h組；D，SD 72h組；比例尺，100μmFig. 2 HE staining examination for effect of sleep deprivation on liver histology. A, control group; B, SD 24h group; C, SD 48h group; D, SD 72h; scale bar, 100μm

圖3 睡眠剝奪對小鼠肝組織TNF-α水平影響的免疫組織化學檢測。A，對照組；B，SD 24h組；C，SD4 8h組；D，SD 72h組；比例尺，100μmFig. 3 Effect of sleep deprivation on TNF-α level in the liver tissues was evaluated using immunohistochemistry. A, control group; B, SD 24h group; C, SD 48h group; D, SD 72h; scale bar, 100μm

進一步的Western blot檢測顯示，正常對照組小鼠肝組織中未見TNF-α陽性條帶，而SD 24h、SD 48h和SD 72h組小鼠肝組織中均可見TNF-α陽性條帶，且TNF-α水平在SD 24h顯著升高，之后持續(xù)升高，一直保持在較高水平（圖4）。

圖4 睡眠剝奪對小鼠肝組織TNF-α水平影響的Western blot檢測。A，代表性Western blot；B，統(tǒng)計學分析；*，與正常對照組比較，P＜0.01（n=10）Fig. 4 Effect of sleep deprivation on TNF-α level in the liver tissues was evalutated using western blot. A, representative Western blot; B, quantitative analysis of western blotting; *, P＜0.01, compared with the control group（n=10）

討 論

睡眠剝奪是一個機制復雜的損傷過程，可引起機體能量代謝異常，自由基生成增多，炎癥反應等，導致機體因代謝紊亂引起氧化應激反應。前期實驗提示[6]，氧化應激是睡眠剝奪誘發(fā)機體出現(xiàn)損傷的中心環(huán)節(jié)，這一應激源引起的形態(tài)結構改變、生理功能紊亂影響廣泛，可對全身各細胞、組織、系統(tǒng)造成嚴重損害。

肝臟是機體內(nèi)代謝十分活躍的臟器之一。在代謝過程中需消耗大量的氧，同時也產(chǎn)生的大量的ROS，在肝細胞損害過程中起著重要作用。生理狀態(tài)下，機體氧化和抗氧化系統(tǒng)處于動態(tài)平衡。在一些病理情況下，氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡，大量的自由基堆積可對不飽和脂肪酸進行脂質(zhì)過氧化，損傷多種生物大分子物質(zhì)，擾亂細胞正常代謝活動，使其形態(tài)結構和功能受損，甚至導致肝細胞壞死[7-8]。SOD是機體內(nèi)主要的抗氧化酶之一，能保護機體免受O2-毒性的損害，清除體內(nèi)代謝過程中所產(chǎn)生的高活性分子，使細胞免受ROS的損傷。MDA是脂質(zhì)過氧化的終末產(chǎn)物，其含量的高低可間接反應組織細胞受自由基攻擊的損傷程度[9-11]。本實驗中顯示，睡眠剝奪24h、48h、72h小鼠肝臟組織中SOD活性明顯下降，MDA活性顯著升高，這提示睡眠剝奪后小鼠肝臟組織氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡，受到了氧化損傷，抗氧化能力下降，造成肝細胞過氧化損傷。

ALT和AST是人體內(nèi)兩種重要的轉(zhuǎn)氨酶，生理情況下血清中活性極低。ALT在肝細胞的胞漿中活性最強，當肝細胞急性損傷或肝病早期，肝細胞膜完整性破壞，通透性增加，胞漿中的ALT溢出進入血液，導致血液中ALT活性增加。AST主要存在于心肌細胞和肝細胞線粒體中，當肝細胞嚴重受損時，線粒體受到破壞，AST大量釋放進入血液，引起血清中AST含量升高酶活性增加，因此血清中ALT和AST升高可作為肝功能受損或肝臟病變的敏感指標[12-13]。本實驗結果顯示，睡眠剝奪24h、48h、72h小鼠血清的ALT和AST較正常對照組分別增加了305%、446%、514%；166%、344%、394%。在HE染色中可以觀察到，睡眠剝奪24h、48h、72h小鼠肝細胞有不同程度的水腫，肝細胞結構紊亂，肝小葉結構破壞，這些病理表現(xiàn)與血清學生化指標一致，說明睡眠剝奪后小鼠肝細胞受損導致肝細胞內(nèi)的ALT和AST大量釋放進入血液，使得血清中含量急劇升高。

細胞因子是由活化的免疫細胞分泌的一種具有高活性、多功能的小分子蛋白質(zhì)，通過與細胞膜上特異性受體結合后發(fā)揮多種生物學功能，在免疫反應和炎癥反應中起重要作用，同時也參與機體某些疾病的發(fā)生、發(fā)展[7]。TNF-α是主要由單核-巨噬細胞分泌的細胞因子，參與一系列的炎癥反應和組織損傷，在機體炎癥免疫反應時最早出現(xiàn)且表達增加[14-15]。在肝臟中，由Kupffer細胞激活后表達，通過與肝細胞表面TNF-α受體結合而發(fā)揮生物學效應，是參與肝臟疾病發(fā)生發(fā)展的關鍵細胞因子[16]。肝臟作為機體代謝的主要器官，生理功能廣泛，有研究證實[17-18]，氧化應激是多種肝臟疾病發(fā)病的共同生理病理基礎。氧化應激水平的增加可促使TNF-α的產(chǎn)生，加重對肝臟的損傷[12]。本研究中免疫組織化學結果顯示，睡眠剝奪小鼠肝臟組織TNF-α的表達隨著睡眠剝奪時間的延長表達增多，染色加深。免疫印跡結果顯示，正常對照組的肝臟組織TNF-α沒有表達，而在SD 24 h后TNF-α表達量一直保持在較高水平。HE染色結果顯示，睡眠剝奪48h、72h，在中央靜脈和門管區(qū)周圍出現(xiàn)大量的炎癥細胞浸潤，Kupffer細胞增生，這提示可能由于肝細胞受到氧化損傷，抗氧化能力減弱，促使炎癥因子TNF-α大量釋放，進一步對肝臟造成損傷甚至肝細胞壞死。

綜上所述，睡眠剝奪導致肝細胞脂質(zhì)過氧化誘發(fā)肝臟氧化應激，使得肝臟結構受損，肝功能異常，進而促進TNF-α的大量釋放，誘發(fā)肝臟炎癥的發(fā)生，加重對肝臟的損害，其具體的分子機制有待于進一步研究。

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Upregulation of tumor necrosis factor-α expression in livers of sleep deprived mice

Zheng Xiaoyan1, Ran Jianhua2,3, Liu Gang1, Hou Liangjuan4,5*
(1Department of Infectious Disease, Three Gorges Central Hospital,wanzhou 404000;2Department of Anatomy, College of Medicine;3Neuroscience Research Center,Chongqing Medical University, Chongqing400016;4Department of Anatomy, Three Gorges Medical College;5Engineering Research Center of Antitumor Natural Drugs, wanzhou 404120)

Objective To investigate the impact of sleep deprivation on morphology, functions and tumor necrosis factor (TNF-α) expression in livers of mice. Methods C57 male mice were randomly divided into four groups: control versus groups with sleep deprivation for 24h, 48h, or 72h respectively. Serum alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) levels in liver tissue were determined using automatic biochemical analyzer. The contents of superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) in liver tissue were measured by xanthine oxidase method and thiobarbituric acid method. HE staining was used to analyze the histological features of liver. The expression of TNF-α in liver tissue was detected by immunohistochemical staining and western blot. Results With prolonged sleep deprivation, the expression of SOD decreased and the expression of MDA increased in liver tissue. ALT and AST levels significantly increased at 24 h and continued to rise over the rest of time course. HE staining showed swollen and irregularly arranged hepatocytes, hepatic lobular structure destruction, Kupffer cell proliferation, and extensive inflammatory cell infiltration. Immunohistochemistry and immunoblotting showed that the increased expression of TNF-α in the liver was associated with prolonged sleep deprivation time. Conclusion The elevated lipid peroxidation in response to sleep deprivation induces oxidative stress which may lead to impaired liver morphology and functions. Upregulation of TNF-α elicits inflammatory response, which may further contribute to liver damage.

Sleep deprivation; liver; TNF-α; oxidative stress

R749.7

A DOⅠ：10.16705/ j. cnki. 1004-1850.04.007

2017-02-13

2017-07-10

重慶三峽醫(yī)專校級苗圃工程自然科學項目（2016mpxz17）；重慶市教委科學技術研究項目（KJ1725384）

鄭小燕，女( 1980年)，漢族，主管護師

*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)：409846096@qq.com