黃麗麗，蔣靖志，馬臨川，韓芳

(中國醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室 ，沈陽 110122)

氟西汀抑制PTSD大鼠海馬神經(jīng)元PSD-95和突觸素I水平的下調(diào)與學(xué)習(xí)記憶力的損害

黃麗麗，蔣靖志，馬臨川，韓芳*

(中國醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室 ，沈陽 110122)

目的 探討氟西汀(fluoxetine, FLXT)對創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（post-traumatic-stress-disorder，PTSD）大鼠記憶及大鼠海馬神經(jīng)元突觸后致密物蛋白95（postsynaptic density 95, PSD-95）和突觸素Ⅰ（synapsinⅠ）表達的影響。方法 采用國際認(rèn)定的SPS方法刺激大鼠建立PTSD大鼠模型，應(yīng)用水迷宮實驗觀察氟西汀對PTSD大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響，采用免疫熒光染色和免疫印跡法檢測海馬神經(jīng)元PSD-95和突觸素Ⅰ水平。結(jié)果 Morris水迷宮前5天的定位航行實驗結(jié)果顯示，SPS刺激后大鼠（PTSD大鼠）找到水下平臺的游泳距離和潛伏期比正常組大鼠長，給予氟西汀的PTSD大鼠找到水下平臺的距離和潛伏期較未用氟西汀處理的PTSD大鼠縮短。Morris水迷宮第6天空間探索實驗結(jié)果顯示，PTSD大鼠穿越平臺的次數(shù)和在靶象限花費時間的百分比明顯低于正常對照大鼠，而氟西汀可顯著增加PTSD大鼠在水迷宮實驗中的穿臺次數(shù)和在靶象限停留的時間百分比。免疫熒光染色和Western Blot檢測顯示，PTSD大鼠PSD-95和突觸素Ⅰ的水平降低，氟西汀干預(yù)可抑制PTSD大鼠PSD-95和 突觸素Ⅰ水平的降低。結(jié)論 氟西汀可通過抑制PTSD大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞PSD-95和 SynapsinⅠ水平的下調(diào)，減輕PTSD大鼠空間記憶和學(xué)習(xí)能力的損傷。

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙；氟西?。缓ｑR；突觸后致密物蛋白95；突觸素Ⅰ; 水迷宮

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（post-traumatic stress disorder，PTSD）是指個體目睹或經(jīng)歷異乎尋常的、不可抵抗的災(zāi)難后出現(xiàn)的一種應(yīng)激相關(guān)精神疾病，主要癥狀有創(chuàng)傷性事件的反復(fù)再現(xiàn)、回避任何關(guān)于創(chuàng)傷性事件的場景、高度警覺等臨床表現(xiàn)，是一種精神障礙[1-2]。海馬是學(xué)習(xí)記憶活動的關(guān)鍵腦區(qū)，在空間記憶的形成中起著關(guān)鍵作用[3]。LTP 是衡量海馬神經(jīng)元突觸可塑性的重要指標(biāo)[4]。研究表明創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙導(dǎo)致大鼠海馬的LTP幅度低于正常，海馬突觸可塑性功能減退，學(xué)習(xí)記憶能力受損[5]。以往的研究表明，氟西汀能有效減輕PTSD動物模型的行為學(xué)癥狀如焦慮、恐懼、探究行為的抑制以及提高動物的空間學(xué)習(xí)記憶能力[6]，但其具體的作用機制尚不明確。本研究通過單一連續(xù)應(yīng)激方法建立PTSD模型，探討氟西汀治療PTSD是否通過調(diào)節(jié)海馬突觸相關(guān)蛋白的水平發(fā)揮治療作用。

材料和方法

1 PTSD動物模型的制備及實驗動物分組

體重150～180g的健康雄性Wistar大鼠60只，購于中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗室條件飼養(yǎng)，將其隨機分為4組，每組15只，分別是正常加安慰劑（N+vehicle）組，SPS加安慰劑 (SPS+vehicle)組，SPS處理后加氟西?。⊿PS+fluoxetine) 組，正常加氟西汀 (N+fluoxetine) 組。采用2005年在日本文部省召開的國際會議上所確定的制備大鼠PTSD模型的SPS方法[7]，將30只大鼠連續(xù)進行以下步驟處理：禁錮2h；強迫性游泳20min（水深40cm，水溫25℃）；休息15min后乙醚麻醉，意識喪失后停止麻醉，麻醉后將大鼠置于通風(fēng)處至自然蘇醒。SPS+fluoxetine組和N+fluoxetine組于刺激后第一天同時給藥，給藥濃度120mg/L，4組飼養(yǎng)7天后取材。

2 Morris水迷宮（Morris water maze, MWM）

大鼠經(jīng)刺激以后，4組均在第1～5天行定位航行實驗，每只大鼠每天進行4次（分別從四個象限邊緣的中心放入水中）。將大鼠頭朝池壁放入水中，實驗前將大鼠置于站臺上適應(yīng)20s，然后將大鼠從不同象限面壁置入池內(nèi)，大鼠登上站臺5s后終止記錄，記錄為上臺潛伏期，最長記錄時間為120s，若大鼠在120s內(nèi)不能上臺，引導(dǎo)其登上站臺適應(yīng)10s，持續(xù)5天，測定大鼠平均上臺潛伏期，以評判大鼠的空間學(xué)習(xí)能力。第6天則撤除水面下的站臺進行空間探索實驗，選擇靶象限對面的象限將各組大鼠面壁置入池內(nèi)各一次，每次記錄大鼠在120s內(nèi)游泳軌跡并進行分析。測量大鼠在靶象限活動時間的比率和穿臺次數(shù)，以評判重復(fù)MWM訓(xùn)練后大鼠的空間記憶能力。

3 光鏡標(biāo)本制備

飼養(yǎng)7天后分別取N+vehicle組、SPS+vehicle組、SPS+fluoxetine組和N+fluoxetine組大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，暴露心臟，左心室插管，剪開右心耳，先以加入了少許肝素鈉的0.9%的生理鹽水300ml快速灌沖，肝臟變白后用提前配置好并且4℃冰凍的4%多聚甲醛進行固定，肝臟變硬后則取出腦組織并浸入多聚甲醛后固定6～12h，然后置于Holt’S液（以40%蔗糖、0.01mol/L PBS配制）中。用恒冷箱切片機行冰凍切片，厚為25μm，置于-20℃條件下的防凍液中保存，用于免疫熒光染色。

4 免疫熒光染色

分別選取各組冰凍漂片6張于24孔板中，先用0.01mol/L PBS沖洗5min×3次；將漂片放入已加入200μl 5%牛血清白蛋白（BSA）的96孔板中室溫封閉2h；然后每孔加入兔抗PSD-95多克隆抗體（1 : 300 : Santa Cruz）和鼠抗突觸素Ⅰ單克隆抗體（1 : 300 : Santa Cruz）一抗混合液200μl，以PBS代替一抗作陰性對照，4℃孵育過夜；FlTC-羊抗兔ⅠgG（濃度1 : 50，北京中杉金橋）和Cy3-羊抗小鼠ⅠgG（濃度1 : 50；北京中杉金橋）混合液37℃下避光孵育2h；一抗核二抗均用含0.3%Triton X-100的0.01mol/L PBS稀釋，以上各步驟間用PBS液洗5min×3次；封片（PBS：甘油=1 : 1），共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察。

5 Western blot

將大鼠斷頸處死，立即取腦，在冰上分離出海馬，RⅠPA裂解液裂解海馬組織，組織經(jīng)勻漿、超聲粉碎后高速低溫離心（12000r/min，30min）后取上清；采用BCA法測定蛋白濃度，每組取50μg蛋白樣品上樣，10%SDS PAGE變性凝膠電泳，濃縮膠90V、30min和分離膠110V、120min，350mA恒流1h轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2h；加入一抗混合液，分別是兔抗PSD-95多克隆抗體（1 : 300；Santa Cruz）、鼠抗突觸素Ⅰ（1 : 300；Santa Cruz）單克隆抗體和鼠抗GAPDH單克隆抗體（1 : 500；武漢博士德）4℃孵育過夜；加入二抗孵育，過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔ⅠgG（l : 500；武漢博士德）或羊抗小鼠ⅠgG（1 : 500；武漢博士德），室溫孵育2h；以上各步驟間用TBST洗15min×3次；PVDF膜上滴加ECL化學(xué)發(fā)光底物（武漢博士德），暗箱中拍攝，保存圖像（Tannon全自動化學(xué)發(fā)光儀）。應(yīng)用Ⅰmage J分析軟件分析目標(biāo)條帶和內(nèi)參（GAPDH）條帶的光密度值，以各組樣品蛋白與內(nèi)參蛋白光密度比值來觀察指標(biāo)的蛋白表達變化。

6 統(tǒng)計學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)使用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件，采用單因素方差分析及Turkey’s多重比較對相關(guān)資料進行統(tǒng)計處理，數(shù)據(jù)以±s表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 氟西汀提高PTSD大鼠的學(xué)習(xí)能力和空間記憶能力

Morris水迷宮定位航行實驗結(jié)果顯示，SPS刺激后大鼠找到水下隱藏平臺的游泳距離明顯大于正常組大鼠；與SPS+vehicle組大鼠相比，SPS+fluoxetine組大鼠找到水下平臺的游泳距離縮短（圖1）。經(jīng)過連續(xù)5天的游泳訓(xùn)練后，各組找到水下隱藏平臺的平均潛伏期逐漸縮短，但各組之間大鼠的學(xué)習(xí)能力仍有差異，第3天和第4天的結(jié)果顯示，SPS刺激后大鼠與正常大鼠相比找到水下平臺的潛伏期延長，而SPS大鼠口服氟西汀后找到水下隱藏平臺的潛伏期則比不給藥的SPS大鼠縮短（圖2）。

Morris水迷宮空間探索實驗顯示，SPS刺激后的大鼠穿越平臺的次數(shù)和在靶象限花費時間的百分比明顯低于N+vehicle組，與SPS+vehicle組大鼠相比刺激后給予氟西汀的大鼠在靶象限花費時間百分比與穿越平臺次數(shù)則明顯增加（圖3）。

2 氟西汀抑制PTSD大鼠海馬神經(jīng)元PSD-95和突觸素I水平的下調(diào)

免疫熒光染色結(jié)果顯示，在大鼠海馬神經(jīng)元DG區(qū)中，PSD-95和突觸素Ⅰ均主要分布在神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；在SPS刺激后的PTSD（SPS+vehicle組）大鼠，海馬神經(jīng)元DG區(qū)中PSD-95和突觸素Ⅰ免疫反應(yīng)性均較正常對照組明顯減弱；而在氟西汀處理的PTSD（SPS+fluoxetine組）大鼠，PSD-95和突觸素Ⅰ免疫反應(yīng)性較SPS+vehicle組增加，但仍低于正常對照組（圖4）。Western Blot 檢測顯示，PTSD大鼠和氟西汀處理的PTSD大鼠海馬內(nèi)PSD-95和突觸素Ⅰ水平的變化與免疫熒光檢測結(jié)果一致（圖5）。

圖1 氟西汀對PTSD大鼠水迷宮實驗運動軌跡的影響Fig. 1 The effect of fluoxetine on the trajectory of the PTSD rats in MWM experiment

圖2 氟西汀對PTSD大鼠水迷宮實驗潛伏期，* ,與N+Vehicle組大鼠比較，P＜0.01；#，與SPS+Vehicle組大鼠比較，P＜0.01Fig. 2 The effect of fluoxetine on the latency of the PTSD rats in MWM experiment. *, P＜0.01, compared with N+Vehicle group; #, P＜0.01, compared with SPS+Vehicle group

討 論

近年來的流行病學(xué)調(diào)查顯示，PTSD人群自殺率為普通人群的6倍，男性PTSD的終生患病率為3.4%，女性為8.5%，至少有1/3患者終身喪失工作和生活能力，遭遇災(zāi)難經(jīng)歷的PTSD患者更加嚴(yán)重[8]。PTSD癥狀已經(jīng)威脅到這些人群的正常生活，找到有效的方法極為迫切。關(guān)于其治療，國內(nèi)外多采用心理治療和藥物治療聯(lián)合療法，但藥物治療仍是主要療法。研究者們根據(jù)PTSD可能的生物學(xué)機制提出，治療PTSD 的有效藥物包括抗抑郁藥、非典型抗精神病藥、抗驚厥藥及苯二氮卓類抗焦慮藥[9]，其中SSRⅠs 類抗抑郁藥在PTSD 臨床治療中取得較好療效而被廣泛應(yīng)用。Vander等研究表明氟西汀能明顯改善PTSD患者的警覺性增高和麻木癥狀，以及抑郁和焦慮癥狀，改善患者認(rèn)知功能和增進注意力[10]。在Southwick[11]等對平民組成的研究中，氟西汀在臨床和統(tǒng)計學(xué)方面對各種嚴(yán)重程度的PTSD 病人都取得了顯著療效。

圖3 氟西汀對PTSD大鼠空間記憶的影響。A，水迷宮實驗檢測大鼠穿越平臺次數(shù)；B，水迷宮實驗檢測大鼠在靶象限停留的時間百分比；*，與N+Vehicle組大鼠比較，P＜0.01；#，與SPS+Vehicle組大鼠比較，P＜0.01Fig. 3 The effect of fluoxetine on the spatial memory of the PTSD rats. A , the times the rats crossed the platform in MWM experiment; B, the percentage of time spent in the target quadrant in MWM experiment; *, P＜0.01, compared with N+Vehicle group; #, P＜0.01, compared with SPS+Vehicle group

圖4 西汀對PTSD大鼠海馬內(nèi)PSD-95和突觸素Ⅰ水平影響的免疫熒光檢測。比列尺，20μmFig. 4 Immunofluorescent detection of the effect of fluoxetine on the levels of PSD-95 and synapsin I in the hippocampus of the PTSD rats; scale bar, 20μm

本研究采用國際認(rèn)定的SPS方法構(gòu)建PTSD大鼠模型，通過連續(xù)5天的定位航行訓(xùn)練和一天空間探索實驗，發(fā)現(xiàn)SPS大鼠上臺潛伏期明顯比正常組長，穿越平臺的次數(shù)和在靶象限停留的時間百分比比正常組低，這些實驗結(jié)果表明單一連續(xù)刺激導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶能力受損，符合PTSD的臨床表現(xiàn)，說明我們的動物模型是成功的。給予PTSD大鼠口服氟西汀后，水迷宮實驗檢測表明給藥組上臺潛伏期比SPS組縮短，穿越平臺的次數(shù)和靶象限停留時間的百分比較SPS組增加。本實驗給藥組采取的是SPS刺激后第一天開始給予氟西汀治療，治療七天。行為學(xué)證實氟西汀可以改善SPS刺激導(dǎo)致的大鼠學(xué)習(xí)記憶損害。晉翔[6]等的研究中給予大鼠單一連續(xù)刺激后飼養(yǎng)14天再給予氟西汀治療可以提高PTSD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。Liberzon[7]等報道大鼠SPS刺激七天為PTSD形成，所以本實驗給予SPS大鼠從第一天開始連續(xù)七天進行氟西汀治療，可以為臨床早期PTSD治療和臨床用藥提供了一定的理論基礎(chǔ)。

圖5 氟西汀對PTSD大鼠海馬內(nèi)PSD-95和突觸素Ⅰ水平的影響。A，PSD-95水平的Western blot檢測；B，突觸素Ⅰ水平的Western blot檢測；C，氟西汀對PTSD大鼠海馬內(nèi)PSD-95和突觸素Ⅰ水平影響的統(tǒng)計學(xué)分析；*，與N+vehicle組比較，P＜0.01；# , 與SPS+vehicle組比較，P＜0.01Fig. 5 The effect of fluoxetine on the levels of PSD-95 and synapsin I in the hippocampus of the PTSD rats. A, western blot detection of PSD-95 level; B, western blot detection of synapsin I level; C, statistical analysis of the effect of fluoxetine on the levels of PSD-95 and synapsin I in the hippocampus of the PTSD rats; *, P＜0.01, compared with N+vehicle group; #, P＜0.01, compared with SPS+vehicle group

突觸后密度蛋白-95（PSD-95）是一種分布在興奮性突觸后膜的腳手架蛋白，與NMDA受體直接相互作用，在突觸的成熟和突觸可塑性中發(fā)揮重要作用。NMDA受體被公認(rèn)為是與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系最密切的一種谷氨酸離子型受體，對海馬突觸可塑性起著參與和調(diào)控的作用。研究表明，PSD-95能夠介導(dǎo)逆行性信號傳遞，促進突觸前膜突觸素的表達增加，增強大鼠的空間記憶能力[12]。PSD-95表達量變化與阿爾茨海默癥、抑郁癥病人學(xué)習(xí)記憶能力的下降有關(guān)。林玲[5]等研究表明SPS大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力受損，PSD-95表達下降，這與本研究中SPS組PSD-95的變化一致，但是本實驗新穎的一點是給予SPS大鼠氟西汀治療證實了此藥物可以通過逆轉(zhuǎn)PSD-95表達下降來改善大鼠行為學(xué)。突觸前膜囊泡蛋白SynapsinⅠ大量表達在海馬的CA3區(qū)和DG區(qū)[13-15]，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸連接的形成和維持，還通過其磷酸化作用調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和突觸可塑性，形成LTP，促進學(xué)習(xí)和記憶。Leonie[16]等研究表明氟西汀促進CA3區(qū)、DG區(qū)SynapsinⅠ的表達來改善小鼠PTSD癥狀,本實驗用行為學(xué)進一步證實氟西汀可以通過增加SynapsinⅠ的表達來提高PTSD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。

以上的研究表明，PTSD動物模型中海馬神經(jīng)元內(nèi)突觸相關(guān)蛋白的表達區(qū)域存在差異。本研究證實了氟西汀通過提高DG區(qū)突觸相關(guān)蛋白的表達來改善大鼠學(xué)習(xí)記憶。海馬分為CA區(qū)和齒狀回DG區(qū)，其中DG區(qū)終身保持新生神經(jīng)元的能力即神經(jīng)再生，相關(guān)文獻報道，齒狀回的神經(jīng)干細(xì)胞位于海馬門區(qū)與顆粒細(xì)胞層之間的下顆粒帶，成年大鼠海馬中新生成的神經(jīng)元會從門區(qū)遷移到顆粒層，接受突觸信息傳入沖動，把軸突進入苔蘚纖維，參與信息傳導(dǎo)[17]。而有研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)激對海馬的損傷主要是抑制齒狀回區(qū)DG區(qū)神經(jīng)元的再生，降低新生神經(jīng)元的存活而導(dǎo)致PTSD 持續(xù)發(fā)生[18]。那么這里我們可以設(shè)想氟西汀是否能通過提高DG區(qū)突觸相關(guān)蛋白的表達而促進新生神經(jīng)元的再生、抑制海馬神經(jīng)元的凋亡來增加突觸可塑性，提高PTSD大鼠學(xué)習(xí)記憶？此疑問有待于我們進一步研究證實。

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Fluoxetine inhibits down-regulation of PSD-95 and synapsin Ⅰ in the hippocampal neurons and impairment of the learning and memory ability of PTSD rats

Huang Lili, Jiang Jingzhi, Ma Linchuan, Han Fang*
(Department of Histology and Embryology, China Medical University,Shenyang 110001, China)

Objective To investigate the effect of fluoxetine on the memory post-traumatic-stress-disorder (PTSD) rats and the expression of postsynaptic density 95 (PSD-95) and synapsin Ⅰ in the hippocampal neurons of PTSD rats. Methods The PTSD rat model was established by the internationally recognized SPS method. Morris water maze (MWM) experiment was performed to observe the effect of fluoxetine on the learning ability and memory of PTSD rats. The expression of PSD-95 and synapsinⅠin hippocampal neurons was detected by immunofluoresent staining and western blot. Reults In the positioning navigation test during the first five days of MWM experiment, the swimming distance and latency taken by the PTSD rats to find the underwater platform were longer than those taken by normal rats or PTSD rats treated with fluoxetine; on the sixth day of MWM experiment in the space exploration test, the times the rats crossed the platform and the percentage of time spent in the target quadrant were obviously lower in the PRSD group than in the normal group, and fluoxetine treatment significantly increased these two indexes. Immunofluoresent staining and western blot results showed that the levels of PSD-95 and synapsin Ⅰ decreased in the PTSD rats and that fluoxetine treatment could inhibit this effect. Conclusion Fluoxetine can relieve the impairment of the special memory and learning ability of PTSD rats by inhibiting the decrease of the levels of PSD-95 and synapsin Ⅰ in the hippocampal neurons of the rats.

Post-traumatic stress disorder; fluoxetine; hippocampus; postsynaptic density protein 95; synapsinⅠ; water maze

R641

A DOⅠ：10.16705/ j. cnki. 1004-1850.04.002

2017-02-06

2017-05-25

國家自然科學(xué)基金（81571324）；沈陽市科技項目（F16-205-1-53）

黃麗麗，女（1990年），漢族，碩士研究生

*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)：fhan@cmu.edu.cn