康麗菲 鄭杰 朱翔

近年來(lái)，隨著全球工農(nóng)業(yè)技術(shù)的發(fā)展、大氣污染加重、人口老齡化加劇，肺癌的發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢(shì)[1,2]。肺腺癌發(fā)病率已超過(guò)鱗狀細(xì)胞癌，由于肺腺癌的多樣性和異質(zhì)性，對(duì)放化療帶來(lái)一定的影響，患者的生存率有待進(jìn)一步提高?；蛲蛔兗夹g(shù)檢測(cè)及靶向藥物治療的開(kāi)展，為肺腺癌的治療帶來(lái)了光明，使腫瘤的個(gè)體化治療成為可能。

表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）是一種具有酪氨酸激酶活性的糖蛋白，通過(guò)自身磷酸化，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)。如果EGFR過(guò)表達(dá)和突變及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常，將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)失控，形成腫瘤[3]。靶向藥物吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼等作為EGFR酪氨酸激酶抑制劑有可能通過(guò)抑制下游信號(hào)異常傳導(dǎo)，對(duì)EGFR敏感性突變形成抑制，為肺癌患者帶來(lái)希望[4-6]。因此EGFR基因突變檢測(cè)備受關(guān)注。

手術(shù)標(biāo)本因能提供更全面的組織學(xué)形態(tài)而更為全面精準(zhǔn)地體現(xiàn)腺癌的分化特點(diǎn)，但多數(shù)肺癌患者為晚期，活檢標(biāo)本是其唯一可能獲得的組織學(xué)證據(jù)，肺腺癌的異質(zhì)性在活檢標(biāo)本中是否會(huì)導(dǎo)致組織學(xué)診斷及EGFR基因檢測(cè)的較大差異，對(duì)指導(dǎo)臨床是否帶來(lái)了困擾，因此本研究對(duì)不同標(biāo)本類(lèi)型的肺腺癌分別統(tǒng)計(jì)，觀察EGFR基因突變與腫瘤的生長(zhǎng)方式、分化程度關(guān)系。進(jìn)一步分析EGFR基因突變與肺腺癌病理分型及標(biāo)本類(lèi)型的關(guān)系，為臨床檢測(cè)方案的不斷優(yōu)化和藥物治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 收集北京大學(xué)第三醫(yī)院病理科2011年1月-2016年10月肺活檢標(biāo)本173例［粘膜活檢、肺穿刺、支氣管內(nèi)超聲引導(dǎo)針吸活檢術(shù)（endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration, EBUSTBNA）標(biāo)本］及肺手術(shù)切除標(biāo)本163例（楔形肺切除、肺葉切除標(biāo)本）石蠟包埋組織，并經(jīng)病理診斷證實(shí)為肺腺癌的病例，行EGFR基因檢測(cè)［基因測(cè)序法及突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)（amplification refractory mutation system, ARMS）］，按2015年世界衛(wèi)生組織（World Health Organization, WHO）肺腺癌分型標(biāo)準(zhǔn)對(duì)選取的病例進(jìn)行主要分型確認(rèn)（貼壁型、腺泡型、乳頭型、微乳頭型、實(shí)體型），鑒于肺腺癌的高度異質(zhì)性，以占比例最多者為主要分型進(jìn)行歸組。手術(shù)標(biāo)本年齡為29歲-83歲，中位年齡為63歲，男性56例，女性107例；活檢標(biāo)本年齡28歲-84歲，中位年齡為65歲，男性75例，女性98例。分別對(duì)手術(shù)切除標(biāo)本和活檢標(biāo)本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，比較兩種標(biāo)本中EGFR基因突變與病理分型的關(guān)系是否一致。

1.2 方法 手術(shù)標(biāo)本EGFR檢測(cè)采用熒光PCR Sanger測(cè)序法，使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit（#56404）從4片-6片石蠟組織中提取腫瘤的基因組DNA，并以其為模板擴(kuò)增EGFR基因第18-21外顯子。擴(kuò)增條件為預(yù)變性95oC 3 min，循環(huán)條件為95oC變性30 s，56oC退火30 s，72oC延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，72oC終末延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳確定片段大小和產(chǎn)物豐度后，純化并經(jīng)ABI 3500基因分析儀進(jìn)行Sanger測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)Alignment軟件與Genbank中的EGFR參比序列比對(duì)，并利用軟件ABI quence Scanner v1.0分析測(cè)序峰圖，突變病例均經(jīng)反向測(cè)序證實(shí)。活檢標(biāo)本采用ARMS熒光PCR法（步驟參見(jiàn)艾德生物試劑盒），分析肺腺癌手術(shù)標(biāo)本和活檢標(biāo)本中肺腺癌類(lèi)型和EGFR突變的情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)分析，各組統(tǒng)計(jì)采用行乘列表卡方檢驗(yàn)，組間差異采用四格表χ2檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用Pearson卡方值、Fisher確切概率，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌手術(shù)切除標(biāo)本和活檢標(biāo)本中EGFR基因突變率及與年齡性別的關(guān)系 163例的肺腺癌手術(shù)切除標(biāo)本和173例活檢標(biāo)本中EGFR總突變率沒(méi)有差異（P＞0.05）。兩組標(biāo)本中女性的EGFR突變率均明顯高于男性（P＜0.05）。手術(shù)標(biāo)本中60歲以上患者的EGFR突變率明顯低于60歲以下（P＜0.05），而活檢標(biāo)本中EGFR突變與年齡無(wú)關(guān)（P＞0.05）（表1，表2）。

2.2 EGFR基因突變的肺腺癌手術(shù)切除標(biāo)本中主要病理分型的構(gòu)成比及其與外顯子的關(guān)系 手術(shù)標(biāo)本肺腺癌中EGFR基因突變的102例中，腺泡型所占比例最高，其次是貼壁型和乳頭型，實(shí)體型則比例最少，未見(jiàn)微乳頭型。

EGFR突變包括18、19、20、21外顯子突變。19、21外顯子單獨(dú)突變最多，故對(duì)病理亞型及19、21外顯子單獨(dú)突變進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，組間兩兩比較，21外顯子突變?cè)谫N壁型較其他兩型高（P＜0.05），19外顯子突變?cè)谌轭^型較貼壁型高（P＜0.05）。 腺泡型和乳頭型比較，19、21突變無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3，表4）。

2.3 EGFR基因突變的肺腺癌活檢標(biāo)本中主要病理分型的構(gòu)成比及其與外顯子的關(guān)系 活檢標(biāo)本肺腺癌中EGFR突變的114例中，腺泡型所占比例最高，其次是貼壁型、乳頭型、微乳頭與實(shí)體型最少。

EGFR突變包括18、19、20、21外顯子突變，其中19、21外顯子單獨(dú)突變最多。不同病理分型中，19、21外顯子突變均無(wú)明顯差異（P＞0.05）（表5，表6）。

2.4 EGFR基因突變的肺腺癌手術(shù)和活檢標(biāo)本病理分型比較 EGFR突變的肺腺癌102例手術(shù)標(biāo)本中，腺泡型占54.9%，貼壁型占23.53%，乳頭型占17.65%，實(shí)體型占3.9%。而114例的活檢標(biāo)本中腺泡型占48.25%，貼壁型占26.32%，乳頭型占11.4%，微乳頭和實(shí)體合并組中占14.4%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)EGFR基因突變的肺腺癌手術(shù)和活檢標(biāo)本中主要病理組織分型構(gòu)成比明顯不同（χ2=8.040,P=0.045）（表7）。

表 1 肺腺癌手術(shù)和活檢標(biāo)本中EGFR基因突變率及與年齡性別的關(guān)系Fig 1 Relationship between the EGFR mutation rate and age, gender in lung adenocarcinoma of surgical removal and biopsy specimens

表 2 活檢標(biāo)本不同性別中EGFR突變與年齡關(guān)系Fig 2 Relationship with the EGFR mutation rate and age in different gender of biopsy sample

表 3 EGFR突變肺腺癌102例手術(shù)標(biāo)本中主要病理分型的構(gòu)成及其與外顯子的關(guān)系Fig 3 Relationship with the major pathology type and the exon of 102 cases of surgical specimen of lung adenocarcinoma with EGFR mutation [n (%)]

表 4 EGFR突變的肺腺癌手術(shù)標(biāo)本中主要病理分型與19、21外顯子單獨(dú)突變的關(guān)系Fig 4 Relationship between the major type and the mutation alone of the exon 19 and 21 in the surgical specimen [n (%)]

表 5 EGFR突變肺腺癌114例活檢標(biāo)本中主要病理分型的構(gòu)成及其與外顯子的關(guān)系Fig 5 Relationship with the major pathology type and the exon of 114 cases of biopsy specimen of lung adenocarcinoma with EGFR mutation [n (%)]

表 6 EGFR突變的肺腺癌活檢標(biāo)本中主要病理分型與19、21外顯子單獨(dú)突變的關(guān)系Fig 6 Relationship between the major type and the mutation alone of the exon of 19 and 21 in the biopsy specimen [n (%)]

表 7 肺腺癌手術(shù)和活檢標(biāo)本中主要病理分型構(gòu)成比的比較Fig 7 Comparison with the constitution ration of major pathology type of lung adenocarcinoma in surgical and biopsy specimen [n (%)]

3 討論

肺腺癌的顯著特點(diǎn)是它的異質(zhì)性和混合性，2015版WHO相對(duì)于2004版的一個(gè)區(qū)別在于取消了混合型腺癌這一概念，代之以更加精細(xì)的分型，并以5%的比例遞減進(jìn)行報(bào)告，更加體現(xiàn)了肺腺癌的異質(zhì)性，人們對(duì)肺腺癌的基因突變認(rèn)識(shí)也只是冰山一角。目前EGFR基因突變是在肺腺癌最常見(jiàn)，由細(xì)胞外域、細(xì)胞內(nèi)域、跨膜區(qū)三部分組成[7]，細(xì)胞內(nèi)域含有酪氨酸激酶[8]，通過(guò)自身磷酸化，進(jìn)一步激活與細(xì)胞增殖、凋亡有關(guān)的通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和增殖。如果EGFR過(guò)表達(dá)和突變及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常，將導(dǎo)致細(xì)胞DNA復(fù)制及細(xì)胞分裂過(guò)度，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)失控和惡性化，形成腫瘤。EGFR在非小細(xì)胞肺癌發(fā)病中，具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的作用[9]。

本研究中163例的肺腺癌手術(shù)標(biāo)本中，EGFR基因突變率為62.58%。173例的肺腺癌活檢標(biāo)本中，EGFR基因突變率為65.9%，兩組標(biāo)本EGFR突變率沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。肺腺癌手術(shù)標(biāo)本中女性EGFR突變率（42.77%）明顯高于男性（23.12%）。肺腺癌活檢標(biāo)本中女性EGFR突變率（44.79%）明顯高于男性（17.79%）（P＜0.05），兩組標(biāo)本中EGFR女性突變率均明顯高于男性。

Shi等[10]報(bào)道在亞洲東南地區(qū)肺腺癌中，女性為EGFR突變率為61.1%明顯高于男性（44%），不同地區(qū)EGFR突變也有差異，突變率最高為越南64.2%（77/120），最低為印度22.2%（16/72）。其他國(guó)家在47.2%-62.1%之間（中國(guó)大陸為50.2%，香港為47.2%，印度為22.2%，菲律賓為52.3%，臺(tái)灣為62.1%，泰國(guó)為53.8%，越南為64.2%）。本研究中EGFR突變稍高，和臺(tái)灣、越南相差不多。Han等[11]報(bào)道國(guó)內(nèi)276例的肺的非小細(xì)胞腺癌中，EGFR基因突變率為55.8%，女性的突變率明顯高于男性，和年齡沒(méi)有明顯相關(guān)關(guān)系。Liang等[12]報(bào)道國(guó)內(nèi)肺腺癌中EGFR突變率為63.9%，女性明顯高于男性，突變率與年齡無(wú)關(guān)。諸多報(bào)道中女性突變高于男性，本研究與此一致。而Zhang等[13]發(fā)現(xiàn)東亞地區(qū)女性非吸煙者手術(shù)切除的肺腺癌標(biāo)本中EGFR的突變率為76.2%，年齡越大突變率越高。而本研究手術(shù)標(biāo)本中，年齡越大，EGFR突變率越低，與其他報(bào)道結(jié)果不同。而活檢標(biāo)本中EGFR突變與年齡無(wú)關(guān)，男性女性標(biāo)本中EGFR突變均與年齡無(wú)關(guān)。 由此可見(jiàn)對(duì)于EGFR與年齡的關(guān)系尚不明了。有待進(jìn)一步探討。

手術(shù)標(biāo)本中EGFR突變包括18、19、20、21外顯子突變。19、21外顯子單獨(dú)突變最多（分別為44.12%和43.14%），21外顯子突變?cè)谫N壁型較其他兩型高（P＜0.05），19外顯子突變?cè)谌轭^型較貼壁型高（P＜0.05）。實(shí)體型中雖然19外顯子比21外顯子突變率高，但病例數(shù)較少，無(wú)法統(tǒng)計(jì)。提示在不同外顯子突變中病理分型不同。19外顯子可能在低中分化腺癌中突變較高，而21外顯子在高分化腺癌中突變較高（貼壁型為高分化，腺泡型和乳頭型為中分化，微乳頭和實(shí)體型為低分化）。目前，19、21外顯子突變被認(rèn)為是兩種獨(dú)立的疾病，對(duì)EGFR酪氨酸激酶抑制劑反應(yīng)不同，Zhu等[14]認(rèn)為19外顯子突變的患者對(duì)吉非替尼反應(yīng)比21外顯子突變者明顯。Sordella等[15]報(bào)道，19和21外顯子突變能導(dǎo)致EGFR分子自身磷酸化的位點(diǎn)不一樣，而導(dǎo)致其下游的信號(hào)通路不同，比如，相對(duì)于缺失突變，L858R突變中的845密碼子編碼的酪氨酸殘基表現(xiàn)出高度磷酸化的狀態(tài)。這可能是19外顯子突變肺癌患者相對(duì)21外顯子突變肺癌患者對(duì)酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors, TKIs）藥物反應(yīng)率較高，應(yīng)用TKIs藥物后預(yù)后較好的原因。由此建立了組織學(xué)分型與EGFR狀態(tài)及TKI治療三者的關(guān)系。

EGFR基因突變的肺腺癌手術(shù)標(biāo)本102例中，主要病理分型腺泡型所占比例最高（54.9%），其次是貼壁型（23.53%）和乳頭型(17.65%)，實(shí)體型則比例最少（3.9%）。EGFR突變的肺腺癌活檢標(biāo)本114例中，腺泡型所占比例最高（48.25%），其次是貼壁型（26.32%）、乳頭型（11.4%），微乳頭與實(shí)體型最少（14.04%）。手術(shù)和活檢標(biāo)本比較，主要病理分型構(gòu)成比不同?；顧z標(biāo)本肺腺癌中EGFR基因突變的114例中，19、21外顯子突變與主要病理分型無(wú)相關(guān)關(guān)系。朱佩[16]發(fā)現(xiàn)在氣管鏡活檢標(biāo)本中EGFR基因突變與肺腺癌的分化無(wú)明顯相關(guān)。本研究與此結(jié)果一致。由于肺腺癌病理分型多樣性，活檢標(biāo)本可能只反映了腫瘤的部分組織學(xué)類(lèi)型，比較局限，不能反應(yīng)全貌，不能替代主要組織學(xué)分型，故不能得出手術(shù)標(biāo)本表現(xiàn)出的組織學(xué)分型與EGFR之間的關(guān)聯(lián)性。因此對(duì)于評(píng)判病理分型與基因突變的關(guān)系時(shí)，活檢標(biāo)本可能沒(méi)有手術(shù)標(biāo)本更能表現(xiàn)出的相關(guān)性。此外，活檢標(biāo)本EGFR檢測(cè)使用的是ARMS方法，手術(shù)標(biāo)本使用的是PCR Sanger測(cè)序法，由于方法差異引起的誤差不可避免，因此尚需統(tǒng)一方法進(jìn)一步研究。

本研究中看到了19與21外顯子有不同的組織學(xué)形態(tài)特點(diǎn)，但是其中是否有更深的機(jī)制，尚待進(jìn)一步研究。 肺癌靶向治療雖然如火如荼開(kāi)展，但還需要相關(guān)理論作為支撐，對(duì)于EGFR基因相關(guān)通路中不同外顯子的突變療效不同的具體機(jī)制，還需進(jìn)一步探討，尤其是肺腺癌異質(zhì)性較大，同一患者可能多種病理分型，以及手術(shù)和活檢標(biāo)本EGFR基因檢測(cè)的差異，諸多問(wèn)題需要關(guān)注，因此對(duì)于肺癌的靶向治療及預(yù)后評(píng)估需要很長(zhǎng)的路要走。