王詩筌，王雷，施恒亮，朱炳鑫，朱玉輻，于如同

·論著·

Rap2a在膠質(zhì)瘤中的表達及其意義

王詩筌，王雷，施恒亮，朱炳鑫，朱玉輻，于如同

目的 探討Rap2a在膠質(zhì)瘤中的表達及其意義。方法 應(yīng)用Western blot檢測Rap2a在膠質(zhì)瘤組織中的表達情況；在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251、U87中轉(zhuǎn)染Rap2a質(zhì)粒，應(yīng)用細(xì)胞克隆形成實驗和EdU實驗檢測過表達Rap2a對U251、U87細(xì)胞增殖的影響；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測過表達Rap2a對U251、U87細(xì)胞周期的影響。結(jié)果 Rap2a在膠質(zhì)瘤組織中呈低表達；過表達Rap2a抑制了U251、U87的增殖；過表達Rap2a明顯使細(xì)胞U251、U87的細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。結(jié)論 Rap2a的蛋白表達水平在膠質(zhì)瘤組織中表達下調(diào)，過表達Rap2a抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力。

膠質(zhì)瘤；Rap2a；細(xì)胞周期；細(xì)胞增殖

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見、死亡率最高的原發(fā)性腦腫瘤，是威脅人類生命最主要的疾病之一，約占全部原發(fā)性神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的40%～60%，年發(fā)病率5～10/10萬[1-2]。膠質(zhì)瘤的發(fā)生是多種基因突變及異常表達的結(jié)果，包括原癌基因的活化、抑癌基因表達受抑制、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達異常以及細(xì)胞代謝和信號傳導(dǎo)等多種機制異常的病理過程。在膠質(zhì)瘤中Ras信號通路是一個主要的致癌通路，Rap2a屬于Ras超家族成員之一，在多種人類細(xì)胞中扮演著多種生物學(xué)功能，包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵襲和遷移等[3-4]。但是Rap2a在膠質(zhì)瘤中的作用及其機制至今未見報道。本研究中主要探討Rap2a在膠質(zhì)瘤組織中的表達以及其意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本 手術(shù)標(biāo)本取自徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科2009年12月～2012年7月手術(shù)切除的人腦膠質(zhì)瘤新鮮標(biāo)本35例、腦外傷行內(nèi)減壓手術(shù)而取得的新鮮腦組織標(biāo)本15例(所取標(biāo)本已征得患者及其家屬同意并通過醫(yī)院倫理委員會的審查)。腫瘤標(biāo)本均取自瘤中央，未電凝，無囊變壞死組織，取得后立即置于液氮中凍存?zhèn)溆谩?5例腦膠質(zhì)瘤中，男19例，女16例，男女比例為1.18∶1?；颊吣挲g最小為1歲6個月，最大為70歲，平均年齡為44.70歲?；颊呔鶠樵l(fā)起病且第一次手術(shù)，術(shù)前均未行抗腫瘤治療，術(shù)后病理結(jié)果證實均為膠質(zhì)瘤，按2000年WHO膠質(zhì)瘤分級標(biāo)準(zhǔn)分級，其中Ⅰ級1例，Ⅱ級11例，Ⅲ級12 例，Ⅳ級11例。

1.1.2 細(xì)胞系 U251和U87細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤單克隆成系，WHO 203年分級標(biāo)準(zhǔn)為Ⅲ級和Ⅳ級。細(xì)胞為貼壁生長，采用DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.1.3 質(zhì)粒、抗體和試劑pCI-Neo-myc-Rap2a真核表達載體及pCI-Neo-myc由日本Kariya教授饋贈。Rap2a、GAPDH抗體購自Abcam公司，myc-tag抗體購自Santa Cruz公司。DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司；FBS胎牛血清購自杭州四季青公司；ECL發(fā)光試劑購自中國碧云天生物技術(shù)研究所；EdU試劑盒購自廣州銳博公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將傳代的細(xì)胞放入37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6～7h后細(xì)胞貼壁生長，細(xì)胞培養(yǎng)2～3d后，處于對數(shù)生長期，即可傳代或用于后續(xù)試驗。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將處于對數(shù)生長期的目的細(xì)胞進行胰酶消化，制成細(xì)胞懸液接種于6孔板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使其細(xì)胞融合達 60%～70%，使用轉(zhuǎn)染試劑ployjet分別與myc空質(zhì)粒和myc-Rap2a質(zhì)粒混合，混合物靜置20min后加入細(xì)胞中，6 h后換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后收集細(xì)胞提取蛋白或進行相關(guān)實驗。

1.2.3 蛋白免疫印記法(Western blot) 將提取的組織或細(xì)胞總蛋白采用MicroBradford法測定蛋白濃度，根據(jù)所測的細(xì)胞濃度配平細(xì)胞總蛋白。將配平的蛋白樣品在垂直電泳槽上通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離(5%濃縮膠，12%分離膠)，以100V電壓，電泳約2h。電泳結(jié)束后，根據(jù)蛋白樣品上樣情況和蛋白質(zhì)分子量，切取適當(dāng)大小的分離膠。取適當(dāng)大小甲醇激活的PVDF膜，以半濕電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜電壓100V，時間約為120min。轉(zhuǎn)膜后的條帶在3% BSA封閉液中封閉2h。用Rap2a(1∶500)、GAPDH(1∶1000)、Myc(1∶2000)一抗4℃孵育過夜進行免疫印跡；TBST洗滌后，將條帶放入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶3000)中室溫孵育2h。ECL發(fā)光化學(xué)試劑在膠片上顯影條帶。采用Image J軟件進行分析蛋白條帶灰度值和面積。

1.2.4 EdU實驗 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，采用EdU滲入法檢測細(xì)胞增殖情況，方法如下：用細(xì)胞培養(yǎng)基按1∶1000的比例稀釋EdU溶液(試劑A)，制備適量50μM EdU培養(yǎng)基；每孔加入100μl 50μM EdU培養(yǎng)基孵育2h，棄培養(yǎng)基；PBS清洗細(xì)胞2次，每次5min。每孔加50μl 4%多聚甲醛，室溫孵育30min，棄固定液；每孔加入50μl 2mg/ml甘氨酸，脫色搖床孵育5min，棄甘氨酸溶液；每孔加入100μl PBS，脫色搖床清洗5min，棄PBS；每孔加入100μl滲透劑(含0.5% Triton X-100的PBS)，脫色搖床孵育10min，PBS清洗1次，5min。每孔加入200μl的1×Apollo染色反應(yīng)液，避光，室溫，脫色搖床孵育30min后，棄反應(yīng)液；加入100μl滲透劑脫色搖床清洗3次，每次10min，棄滲透劑；每孔加入200μl甲醇清洗2次，每次5min，PBS清洗1次，每次5min；DAPI染核后，PBS洗滌即可進行顯微拍照。

1.2.5 克隆形成實驗 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后采用常規(guī)消化傳代方法，制成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞計數(shù)，并用培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，并將細(xì)胞懸液倍比稀釋。按照每皿500個細(xì)胞接種到直徑60mm 的培養(yǎng)皿中，以十字方向輕輕晃動培養(yǎng)皿，使細(xì)胞分散均勻。培養(yǎng)皿置培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)12～14 d，中間根據(jù)培養(yǎng)液pH變化適時更換新鮮培養(yǎng)液。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見克隆時，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，PBS液小心浸洗2次。甲醇固定15min，棄甲醇后空氣干燥。用0.1%結(jié)晶紫染液染色10min，流水緩慢洗去染液，空氣干燥后進行拍照。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后進行如下處理，消化：用0.25%胰酶消化，離心(800rpm，5min)；洗滌：用PBS液洗一次，棄上清；固定：加入-20 ℃預(yù)冷的70%酒精，冰浴30min；洗滌：用PBS液洗一次，棄上清；去除RNA：加入濃度50μg/ml的RNA酶，37℃，30min；洗滌：用PBS液洗一次，棄上清；染色：加PI染液(500μg/ml)避光染色30min；檢測：300目尼龍濾膜過濾后上機檢測。

2 結(jié) 果

2.1 Rap2a在膠質(zhì)瘤中的表達情況 采用蛋白免疫印記技術(shù)檢測15例非腫瘤腦組織及35例膠質(zhì)瘤組織中Rap2a蛋白表達水平，結(jié)果如圖(圖1A)所示：Rap2a在腦膠質(zhì)瘤組織中表達明顯下調(diào)，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1B)。提示：Rap2a可能參與了膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。

圖1 A：應(yīng)用蛋白免疫印記法檢測非腫瘤腦組織以及膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中Rap2a蛋白表達水平；B：A圖的統(tǒng)計分析圖

2.2 Rap2a對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響 分別通過Rap2a和Myc抗體檢測轉(zhuǎn)染Myc-Rap2a質(zhì)粒48h后膠質(zhì)瘤U87、U251細(xì)胞中Rap2a的蛋白表達水平，結(jié)果如圖2顯示：外源Rap2a過表達成功，且表達量明顯高于內(nèi)源的Rap2a水平，提示：Rap2a蛋白在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中過表達成功。

圖2 蛋白免疫印記技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染Myc-Rap2a質(zhì)粒48h后膠質(zhì)瘤U87、U251細(xì)胞中Rap2a的蛋白表達

首先采用細(xì)胞克隆形成實驗檢測過表達Rap2a對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響，如圖3A所示，轉(zhuǎn)染Rap2a的細(xì)胞克隆形成數(shù)量明顯比對照組降低，分別統(tǒng)計U87、U251兩個細(xì)胞系形成的克隆數(shù)，結(jié)果顯示，實驗組與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(表1，圖3C，P<0.01；P<0.001)。結(jié)果表明：過表達Rap2a可以顯著抑制膠質(zhì)瘤U87、U251細(xì)胞的克隆形成能力。采用EdU實驗驗證Rap2a對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響。如圖3B所示, 轉(zhuǎn)染Rap2a的細(xì)胞增殖能力明顯比對照組低，分別計算U87、U251兩個細(xì)胞系增殖的細(xì)胞數(shù)，結(jié)果顯示，實驗組與對照組見都存在統(tǒng)計學(xué)意義(如表2，圖3D，P<0.01；P<0.01)。這些結(jié)果表明：過表達Rap2a可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。

表1 轉(zhuǎn)染Rap2a 48 h后細(xì)胞克隆形成實驗檢測細(xì)胞克隆形成率

注：實驗組vs陰性對照組**P<0.01，***P<0.001

表2 轉(zhuǎn)染Rap2a 48h后EdU實驗檢測細(xì)胞增殖率

注：實驗組vs陰性對照組**P<0.01

2.3 Rap2a對膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期的影響 以上結(jié)果表明Rap2a可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測Rap2a對膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期的影響。分別在U251和U87中檢測了轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和Rap2a質(zhì)粒的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的周期分布。結(jié)果如圖4A所示，在U251和U87中過表達Rap2a后，G0/G1期細(xì)胞比例明顯升高，處于S期的細(xì)胞較對照組明顯減少(圖4B，P<0.05)。

A：細(xì)胞克隆形成實驗檢測過表達Rap2a對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和U251的影響；B：A圖統(tǒng)計分析圖；C：EdU實驗檢測過表達Rap2a對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和U251的影響；D：C圖統(tǒng)計分析圖圖3 過表達Rap2a抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和U251的增殖(**P<0.01，***P<0.001)

A：流式細(xì)胞術(shù)檢測過表達Rap2a對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和U251周期的影響；B：A圖的統(tǒng)計分析圖圖4 過表達Rap2a對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和U251周期的影響(*P<0.05)

3 討 論

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的來自于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或他們的前提細(xì)胞的原發(fā)性腫瘤，雖然手術(shù)和輔助治療的進步，但惡性膠質(zhì)瘤患者的平均中位生存期為12個月左右[5]。膠質(zhì)瘤的發(fā)生時多種基因突變及異常表達以及細(xì)胞代謝和信號傳導(dǎo)等多種機制異常的病理過程。近年來隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，對膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制有了更深入、更全面的認(rèn)識?；蛑委熞殉蔀楫?dāng)今腫瘤治療的熱點，尋找對膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展起重要調(diào)節(jié)作用的基因，并研究其調(diào)控腫瘤發(fā)生的信號通路對深入了解膠質(zhì)瘤無限增殖和減緩凋亡的分子機制，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點提供了新的思路和理論支持[6]。

Ras作為原癌基因在膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起著舉足輕重的作用[7-10]，Rap2a屬于Ras小G蛋白超家族的成員之一，在多種人類細(xì)胞中發(fā)揮著各種各樣的生物學(xué)功能，包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞遷移和侵襲、細(xì)胞增殖等[3]。雖然Rap2a是原癌基因Ras超家族中的一員，但其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中的作用還存在爭議。Prabakaran等[11]發(fā)現(xiàn)在濾泡狀甲狀腺癌中，Rap2a呈高表達，與甲狀腺癌侵襲性密切相關(guān)。相反也有報道指出，在前列腺癌中低表達的Rap2a可以促進前列腺特異抗原(PSA)的表達，然而高表達的Rap2a則抑制前列腺特異抗原表達，從而影響前列腺特異抗原介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄和前列腺細(xì)胞的成長[12]。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)Rap2a在膠質(zhì)瘤中表達下調(diào)(圖1A，1B)，提示Rap2a在膠質(zhì)瘤中可能扮演抑癌基因的角色，并且過表達Rap2a(圖2)可以誘導(dǎo)細(xì)胞G0/G1期阻滯(圖4A，4B)而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖(圖3A-D)。

Choudhury等[13]發(fā)現(xiàn)未經(jīng)編碼的microRNA-376*通過抑制靶基因Rap2a影響膠質(zhì)瘤的細(xì)胞的遷移和侵襲能力，同時利用RNAi技術(shù)干擾Rap2a促進了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。2014年，Sayyah 等[14]證實，Rap1a是膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和腫瘤生長的關(guān)鍵調(diào)控因子，在體外實驗中，Rap1a的缺失導(dǎo)致腫瘤質(zhì)量比對照組減少70%以上。而Rehmann[15]在2013年的報道中，證實了Rap1和Rap2之間存在相互拮抗作用。

這些報道與本研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)過表達Rap2a抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的結(jié)果相一致。但也有一些研究反對這種觀點，在肺癌中，Rap2a作為一個癌基因參與腫瘤的遷移與侵襲[16]。這些結(jié)果提示Rap2a功能的多樣性可能與組織細(xì)胞的不同和特殊的環(huán)境相關(guān)。

綜合以上結(jié)果表明，Rap2a在臨床膠質(zhì)瘤組織中表達下調(diào)，提示Rap2a在膠質(zhì)瘤中可能扮演抑癌基因的角色，其可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞G0/G1期阻滯而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。Rap2有三種不同的同源亞基，即Rap2a、Rap2b、Rap2c，本研究中僅僅涉及了Rap2a對膠質(zhì)瘤增殖影響?？傊?，本實驗結(jié)果表明Rap2a可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，為膠質(zhì)瘤的分子靶向治療提供重要的參考與理論支持。

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(收稿2016-01-27 修回2016-06-11)

Study on expression of Rap2a and its effect on glioma cell proliferation

WANGShi-quan,WANGLei,SHIHeng-liang,etal.
theGenerateSchool,XuzhouMedicalCollege,Xuzhou221002,China

ZHUYu-fu

Objective To explore the expression and the function of Rap2a in glioma.Methods The expression level of Rap2a in glioma tissues was detected by Western blot.The colony formation and EdU assay were subjected for assessing the cell proliferation up on overexpression of Rap2a plasmid in U251 and U87 cells.The flow cytometry assay was used to analyse the effect of Rap2a on cell cycle of U251 and U87 cells.Results The expression level of Rap2a in glioma tissues was decreased comparing with the non-tumor tissues.Overexpression of Rap2a inhibited the proliferation of U251 and U87 cells.In addition,we found that overexpression of Rap2a arrested the cell cycle at G0/G1 phase.Conclusion The expression level of Rap2a in glioma tissues is down-regulated,and overexpression of Rap2a inhibits the proliferation of glioma cells.

glioma;Rap2a;cell cycle;proliferation

國家自然科學(xué)基金資助項目(81272777)；江蘇省2013年度普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃資助項目(CXLX13_994)

221002 徐州醫(yī)學(xué)院研究生院(王詩筌，朱炳鑫)；徐州醫(yī)學(xué)院神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究所(施恒亮，于如同)；徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腦科醫(yī)院神經(jīng)外科(王雷，施恒亮，朱玉輻，于如同)

朱玉輻

10.3969/j.issn.1672-7770.2017.04.010

R739.41

A

1672-7770(2017)04-0279-05