梁濤 王彬 汪濤 柳曦 李捷

·論著·

CXCR4抑制劑AMD3465調節(jié)肺癌細胞株增殖、侵襲的實驗研究

梁濤1，2王彬1汪濤1柳曦1李捷1

目的探討CXCR4抑制劑AMD3465對肺癌細胞株增殖、侵襲的影響。方法培養(yǎng)肺癌細胞株A549并分為AMD3465組、對照組；分別用含有三種不同劑量(50 、100、200 mg/L)AMD3465的DMEM處理以及用不含藥物的DMEM處理。處理后12、24、48 h，檢測細胞的增殖活力和侵襲數(shù)目；處理后48 h，檢測細胞中增殖及侵襲基因的mRNA表達量。結果處理后12、24、48 h，三種不同劑量(50、100、200 mg/L)AMD3465組細胞的OD值均顯著低于對照組、侵襲數(shù)目均顯著少于對照組，AMD3456劑量較低時OD值、侵襲數(shù)目與對照組差距均大于AMD3456劑量較高時(P<0.05)；處理后48 h，50 mg/L AMD3465組、100 mg/L AMD3465組、200 mg/L AMD3465組細胞中CyclinD1、PCNA、Ki-67、CatB、MMP2、MMP9、MMP13的mRNA表達量均顯著低于對照組；AMD3456劑量較低時細胞中CyclinD1、PCNA、Ki-67、CatB、MMP2、MMP9、MMP13的mRNA表達量與對照組差距均大于AMD3456劑量較高時(P<0.05)。結論CXCR4抑制劑AMD3465能夠有效抑制肺癌細胞株的增殖、侵襲。

支氣管肺癌； CXC受體4； 增殖； 侵襲

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，全球每年肺癌所致死亡的人數(shù)超過140萬，肺癌細胞的增殖、侵襲是影響肺癌預后及病情轉歸的重要生物學行為[1-3]。但關于肺癌細胞增殖、侵襲的調控機制尚未完全闡明。基質細胞衍生因子-1(SDF-1)是重要的趨化因子，與多種細胞的遷移、侵襲密切相關。近年來關于肺癌增殖和侵襲的研究認為，SDF-1及其受體CXCR4在肺癌細胞惡性生物學行為的調控中發(fā)揮關鍵作用，肺癌組織中CXCL12及CXCR4均呈高表達的趨勢[4-5]。但是，目前關于CXCR4是否直接參與肺癌細胞增殖、侵襲的調控尚未明確。ADM3465是CXCR4的特異性抑制劑，能夠選擇性地抑制CXCR4所介導的生物學效應。為了明確CXCR4對肺癌細胞增殖、侵襲的調控作用，本研究具體分析了CXCR4抑制劑AMD3465對肺癌細胞株增殖、侵襲的影響。

材料與方法

一、實驗材料

A549肺癌細胞株來自解放軍總醫(yī)院分子生物實驗室，細胞培養(yǎng)基、胎牛血清及胰蛋白酶均購于Gibco公司，RNA抽提試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購于北京康為世紀公司，PCR引物由上海生工公司設計并合成，CXCR4抑制劑AMD3465由解放軍總醫(yī)院核醫(yī)學科合成。

二、實驗方法

1. 細胞培養(yǎng)及處理方法: A549細胞株用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，細胞密度生長至90%后用0.125%的胰蛋白酶常規(guī)消化，消化后的細胞傳代擴增并接種在培養(yǎng)板中。培養(yǎng)板中的細胞密度生長至90%后進行處理，對照組用不含藥物的DMEM處理，50 mg/L AMD3465組、100 mg/L AMD3465組、200 mg/L AMD3465組分別用含有50mg/L AMD3465的DMEM、含有100 mg/L AMD3465的DMEM、含有200 mg/L AMD3465的DMEM處理。

2. 細胞增殖活力的檢測方法: 用于細胞增殖活力的細胞接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔加入200 μl細胞懸液、密度為5×104/ml，處理后12、24、48 h，向培養(yǎng)體系中直接加入MTS試劑盒中的檢測液，20 μl/孔，繼續(xù)孵育3～4 h后檢測各培養(yǎng)孔內(nèi)細胞在570 nm波長處的吸光度(OD值)。

3. 細胞侵襲的檢測方法: 將BD公司的BioCoatTMMatrigelTMInvasion Chamber取出并在室溫放置，在上層小室和下層小室內(nèi)加入預熱到37 ℃的DMEM，使基質水化后向上層小室內(nèi)加入消化所得細胞懸液、每孔加入500 μl細胞懸液、密度為5×104/ml，下層小室中加入500 μl含有1%胎牛血清的DMEM。不同條件處理12、24、48 h，切下上層小室的微孔膜，5%結晶紫染色后PBS洗滌2遍，最后在高倍視野下觀察細胞數(shù)目。

4. 基因mRNA表達量的檢測方法: 用于基因mRNA表達量檢測的細胞接種在6孔培養(yǎng)板中，每孔加入1.5 ml細胞懸液、密度為5×104/ml，處理后48 h，采用RNA抽提試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒分離細胞中的總RNA并反轉錄為cDNA；采用熒光定量PCR試劑盒擴增CyclinD1、PCNA、Ki-67、CatB、MMP2、MMP9、MMP13，根據(jù)擴增曲線計算基因的mRNA表達量。

三、統(tǒng)計學方法

采用SPSS20.0軟件錄入數(shù)據(jù)并進行分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用方差分析，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、兩組細胞的增殖活力比較

處理后12、24、48 h，50 mg/L AMD3465組、100 mg/L AMD3465組、200 mg/L AMD3465組細胞的OD值均顯著低于對照組；AMD3456劑量較低組OD值與對照組OD值的差距，大于AMD3456劑量較高組OD值與對照組OD值的差距(P<0.05)，見表1。

表1 兩組細胞的增殖活力比較

注:a：與對照組比較，P<0.05；b：與50 mg/L AMD3465組比較，P<0.05；c：與100 mg/L AMD3465組比較，P<0.05

二、兩組細胞的侵襲能力對比

處理后12、24、48 h，50 mg/L AMD3465組、100 mg/L AMD3465組、200 mg/L AMD3465組細胞的侵襲數(shù)目均顯著少于對照組，AMD3456劑量較低組侵襲數(shù)目與對照組侵襲數(shù)目的差距，大于AMD3456劑量較高組侵襲數(shù)目與對照組侵襲數(shù)目的差距(P<0.05)，見表2。

表2 兩組細胞的侵襲能力比較

注：a：與對照組比較，P<0.05；b：與50 mg/L AMD3465組比較，P<0.05；c：與100 mg/L AMD3465組比較，P<0.05

三、兩組細胞中增殖基因的表達差異

處理后48 h，50 mg/L AMD3465組、100 mg/L AMD3465組、200 mg/L AMD3465組細胞中CyclinD1、PCNA、Ki-67的mRNA表達量均顯著低于對照組；AMD3456劑量較低組細胞中CyclinD1、PCNA、Ki-67 mRNA表達量與對照組細胞中CyclinD1、PCNA、Ki-67 mRNA表達量的差距，大于AMD3456劑量較高組細胞中CyclinD1、PCNA、Ki-67 mRNA表達量與對照組細胞中CyclinD1、PCNA、Ki-67 mRNA表達量的差距(P<0.05)，見表3。

表3 兩組細胞中增殖基因的表達量比較

注：a：與對照組比較，P<0.05；b：與50 mg/L AMD3465組比較，P<0.05；c：與100 mg/L AMD3465組比較，P<0.05

四、兩組細胞中侵襲基因的表達差異

處理后48 h，50 mg/L AMD3465組、100 mg/L AMD3465組、200 mg/L AMD3465組細胞中CatB、MMP2、MMP9、MMP13的mRNA表達量均顯著低于對照組，AMD3456劑量較低組細胞中CatB、MMP2、MMP9、MMP13 mRNA表達量與對照組細胞中CatB、MMP2、MMP9、MMP13 mRNA表達量的差距，大于AMD3456劑量較高組細胞中CatB、MMP2、MMP9、MMP13 mRNA表達量與對照組細胞中CatB、MMP2、MMP9、MMP13 mRNA表達量的差距(P<0.05)，見表4。

討 論

SDF-1是哺乳動物體內(nèi)重要的趨化因子，與受體CXCR4結合后能夠通過激活下游多種信號通路來調控細胞的生長、運動、粘附等過程。近年來，SDF-1/CXCR4信號通路與惡性腫瘤的關系受到了越來越多的關注，該信號通路能夠指示腫瘤細胞沿著CXCL12的濃度梯度進行遷移和運動，進而向鄰近組織或遠處組織中SDF-1高表達的區(qū)域浸潤[6-8]。已有研究報道，肺癌組織中CXCR4和SDF-1呈高表達的趨勢[9]，但關于SDF-1/CXCR4信號通路對肺癌細胞生長和運動的影響尚未明確。為了明確SDF-1/CXCR4通路對肺癌細胞惡性生物學行為的影響，本研究采用CXCR4的抑制劑AMD3465來選擇性抑制CXCR4的生物學效應，進而對細胞的增殖活力和侵襲數(shù)目進行分析，結果顯示：不同劑量AMD3465組細胞處理后12、24、48 h的OD值均顯著低于對照組、侵襲數(shù)目均顯著少于對照組。這就說明CXCR4抑制劑AMD3465對肺癌細胞株的增殖、侵襲具有抑制作用，也提示SDF-1/CXCR4通路參與了肺癌增殖和侵襲的調控。

在肺癌細胞的增殖過程中，細胞周期進程的加速是促進細胞增殖的重要環(huán)節(jié)，而細胞周期的進程又與多種基因的表達變化密切相關。CyclinD1是調節(jié)細胞周期進程的關鍵蛋白，與CDK4和CDK6結合所形成的CyclinD1-CDK4/6復合物能夠引起Rb蛋白發(fā)生磷酸化并釋放轉錄因子E2F，進而驅動細胞周期由G1期進入S期和G2期、促進細胞的增殖[10-11]。PCNA是參與DNA復制及核酸剪切過程的輔助分子，還能與CyclinD1相互作用并加速細胞周期的進程；Ki-67是細胞周期進程的標志分子之一，在細胞周期的G1期開始逐步出現(xiàn)、在S期和G2期達到高峰，而在G0期則幾乎不表達。本研究通過分析CXCR4的抑制劑AMD3465對肺癌細胞中上述增殖基因表達量的影響顯示：不同劑量AMD3465組細胞中處理后48 h CyclinD1、PCNA、Ki-67的mRNA表達量均顯著低于對照組。這就說明CXCR4抑制劑AMD3465對肺癌細胞中增殖基因的表達量具有負性調節(jié)作用，也提示SDF-1/CXCR4通路參與了肺癌中增殖基因表達的調控。

表4 兩組細胞中侵襲基因的表達量比較

注：a：與對照組比較，P<0.05；b：與50 mg/L AMD3465組比較，P<0.05；c：與100 mg/L AMD3465組比較，P<0.05

SDF-1/CXCR4通路對細胞的黏附、遷移和運動具有調節(jié)作用， 而肺癌細胞的局部浸潤和遠處轉移不僅依賴于細胞的黏附、遷移，同時還與細胞外基質及基底膜的降解密切相關。蛋白酶是水解細胞外基質及基底膜中多種成分的重要催化酶，能夠促進細胞突破細胞外基質及基底膜的限制并向臨近組織浸潤和遠處組織轉移。CatB、MMP2、MMP9、MMP13等蛋白酶是與肺癌細胞侵襲密切相關的蛋白酶，CatB是細胞溶酶體的組成部分，能夠有效激活纖溶酶原激活劑并促進細胞外基質的降解[12-14]；MMP2、MMP9、MMP13是MMPs家族的重要成員，對細胞外基質及基底膜中的Ⅳ型膠原、層黏連蛋白、彈性蛋白等成分具有直接的水解作用，能夠促進細胞外基質及基底膜的降解[15-16]。本研究通過分析CXCR4的抑制劑AMD3465對肺癌細胞中上述侵襲基因表達量的影響顯示：不同劑量AMD3465組細胞中處理后48 h CatB、MMP2、MMP9、MMP13的mRNA表達量均顯著低于對照組。這就說明CXCR4抑制劑AMD3465對肺癌細胞中侵襲基因的表達量具有負性調節(jié)作用，也提示SDF-1/CXCR4通路參與了肺癌中侵襲基因表達的調控。

綜上所述，SDF-1/CXCR4通路參與了肺癌增殖、侵襲的調控；CXCR4抑制劑AMD3465能夠有效抑制肺癌細胞株的增殖、侵襲。

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(本文編輯：王亞南)

梁濤，王彬，汪濤，等. CXCR4抑制劑AMD3465調節(jié)肺癌細胞株增殖、侵襲的實驗研究[J/CD]. 中華肺部疾病雜志(電子版)， 2017， 10(4)： 398-401.

Experimental study of CXCR4 inhibitor AMD3465 regulating proliferation and invasion of lung carcinoma cell line

LiangTao1,2,WangBin1,WangTao1,LiuXi1,LiJie1.

1DepartmentofThoracicSurgery,GeneralHospitalofPLA,Beijing100853,China;2DepartmentofThoracicSurgery,GeneralHospitalofRocketArmy,PLA,Beijing100853,China

Correspondingauthor：LiJie,Email：13801010576@163.com

Objective To study the effect of CXCR4 inhibitor AMD3465 on proliferation and invasion of lung carcinoma cell lines. Methods The lung carcinoma cell line A549 was cultured and divided into 50 mg/L AMD3465 group, 100 mg/L AMD3465 group, 200 mg/L AMD3465 group treated with DMEM containing different dosage of AMD3465 and control group treated DMEM without drug. After 12 h, 24 h and 48 h, the proliferation and invasion number of the cells were detected. After 12 h, the mRNA expression of cell proliferation and invasion genes were detected. Results 12 h, 24 h, 48 h after treatment, OD values of 50 mg/L AMD3465 group, 100 mg/L AMD3465 group, 200 mg/L AMD3465 group were significantly lower than the control group, invasion number were significantly less than the control group，the differences of OD values and invasion number between control group and lower dosage ADM3456 group were larger than higher dosage AMD3465(P<0.05); 48 hours after treatment, mRNA expression of CyclinD1, PCNA, Ki-67 cells, CatB, MMP2, MMP9, MMP13 of 50mg/L AMD3465 group, 100 mg/L AMD3465 group, 200 mg/L AMD3465 group were significantly lower than the control group; the differences of mRNA expression of CyclinD1, PCNA, Ki-67 cells, CatB, MMP2, MMP9, MMP13 between control group and lower dosage ADM3456 group were larger than higher dosage AMD3465(P<0.05). Conclusion CXCR4 inhibitor AMD3465 can effectively inhibit the proliferation and invasion of lung carcinoma cell lines.

Bronchogenic carcinoma; CXC receptor 4; Proliferation; Invasion

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.04.004

國家自然科學基金資助項目(81573026)

100853 北京，中國人民解放軍總醫(yī)院胸外科1100088 北京，中國人民解放軍火箭軍總醫(yī)院 胸外科2

李捷， Email：13801010576@163.com

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2017-06-04)