徐秀梅，王蓓，翟虹，王彪，趙獻(xiàn)萍

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院,烏魯木齊830000 )

IL-1、ICAM-1在超聲聯(lián)合造影劑致大鼠腦損傷組織中的變化及其影響因素

徐秀梅，王蓓，翟虹，王彪，趙獻(xiàn)萍

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院,烏魯木齊830000 )

目的 探討超聲聯(lián)合造影劑致大鼠腦損傷組織中IL-1、ICAM-1水平的變化及其與超聲照射劑量的關(guān)系。方法 SD大鼠25只，隨機(jī)分為對(duì)照組5只，實(shí)驗(yàn)組20只，實(shí)驗(yàn)組根據(jù)超聲機(jī)械指數(shù)和照射時(shí)間隨機(jī)分為4個(gè)亞組：MI1.5照射5 min組(A1組)、MI1.5照射10 min組(A2組)、MI1.9照射5 min組(B1組)、MI1.9照射10 min組(B2組)，各5只。對(duì)照組注射造影劑Sonovue;實(shí)驗(yàn)組在對(duì)照組基礎(chǔ)上使用超聲照射大鼠腦部顳窗，伊文思藍(lán)作為追蹤劑，使用光鏡觀察各組腦組織形態(tài)學(xué)變化，免疫組化法檢測(cè)IL-1、細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)在腦組織中的表達(dá)。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組肉眼觀察可見藍(lán)色染色，光鏡下可見細(xì)胞水腫、紅細(xì)胞滲出、個(gè)別細(xì)胞壞死。實(shí)驗(yàn)組腦損傷組織IL-1、ICAM-1陽性細(xì)胞數(shù)高于對(duì)照組(P均<0.05)，實(shí)驗(yàn)組間比較，B1、B2組較A1、A2組損傷腦組織IL-1、ICAM-1陽性細(xì)胞數(shù)增多(P均<0.05)。結(jié)論 超聲聯(lián)合造影劑致大鼠腦損傷組織中IL-1、ICAM-1表達(dá)升高，其水平與超聲照射劑量有關(guān)。

腦損傷；超聲；造影劑；血腦屏障；白細(xì)胞介素1；細(xì)胞間黏附分子1；大鼠

超聲聯(lián)合造影劑能夠成功開放血腦屏障[1]。文獻(xiàn)和本研究前期實(shí)驗(yàn)證明，超聲聯(lián)合造影劑在開放血腦屏障時(shí)可引起一定程度的腦損傷[2]，但這種腦組織損傷的病理學(xué)基礎(chǔ)不明。文獻(xiàn)研究顯示，腦組織創(chuàng)傷后，炎癥反應(yīng)是腦損傷病理生理過程中的重要環(huán)節(jié)。腦損傷后炎性細(xì)胞成分的積聚，均會(huì)誘發(fā)炎癥前細(xì)胞因子、化學(xué)因子以及內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞黏附因子的表達(dá)上調(diào)。2014年1月～2016年3月，本研究通過高強(qiáng)度超聲聯(lián)合造影劑開放大鼠血腦屏障的同時(shí)，觀察IL-1、細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)在損傷腦組織中的表達(dá)變化，并探討其影響因素，為將來超聲聯(lián)合微泡開放血腦屏障預(yù)防腦組織損傷提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及儀器 健康SD大鼠25只(新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，雌雄不限，體質(zhì)量(200±50)g。伊文思藍(lán)溶液(百靈威科技有限公司生產(chǎn))；Sonovue造影劑(注射用六氟化硫微泡，BRACCO 公司生產(chǎn))；IL-1試劑盒、ICAM-1試劑盒(武漢博士德公司)；彩色多普勒超聲診斷儀(使用美國(guó)西門子醫(yī)療設(shè)備公司的Sequoia-512型)，S15-8探頭，頻率12 MHz，MI設(shè)為1.9，采用連續(xù)成像方式，成像深度4 cm，TGC除進(jìn)場(chǎng)完全抑制外，中遠(yuǎn)場(chǎng)居中，聚焦于遠(yuǎn)場(chǎng)。

1.2 分組及處理 將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組5只，實(shí)驗(yàn)組20只，實(shí)驗(yàn)組根據(jù)超聲機(jī)械指數(shù)和照射時(shí)間隨機(jī)分為4個(gè)亞組：MI1.5照射5 min組(A1組)、MI1.5照射10 min組(A2組)、MI1.9照射5 min組(B1組)、MI 1.9照射10 min組(B2組)，每小組5只。大鼠以3%的戊巴比妥鈉30 mg/kg尾靜脈注射進(jìn)行麻醉，動(dòng)物麻醉后左側(cè)臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，剪除右眼與右耳連線至顱頂?shù)捏w毛作為超聲照射聲窗。對(duì)照組注射造影劑0.2 mL，并注射生理鹽水1 mL，不用超聲照射。實(shí)驗(yàn)組分別根據(jù)超聲機(jī)械指數(shù)和照射時(shí)間注射造影劑0.2 mL，并注射生理鹽水1 mL，使用超聲波照射兔腦部顳窗。各組均隨后加0.5%的伊文思藍(lán)溶液(3 mL/kg)。實(shí)驗(yàn)后頸動(dòng)脈插管灌注，斷頭取腦取材。所取腦組織分別用4%的多聚甲醛固定，進(jìn)行常規(guī)HE染色切片、免疫組化檢查。

1.3 觀察指標(biāo) 血腦屏障開放情況：肉眼觀察腦組織伊文思藍(lán)染色情況(伊文思藍(lán)在活體動(dòng)物中可以與循環(huán)蛋白結(jié)合而形成伊文思藍(lán)蛋白復(fù)合物而著色，但是完整的內(nèi)皮可以阻止這種結(jié)合的發(fā)生，因此可以用是否染色來判斷血腦屏障開放情況[3])。腦組織損傷情況：取腦組織冠狀切片，常規(guī)石蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察腦組織有無組織出血、壞死等表現(xiàn)。

1.4 腦損傷組織IL-1、ICAM-1蛋白的表達(dá) 采用免疫組化法。取腦損傷組織常規(guī)石蠟包埋，石蠟切片脫蠟至水。3% H2O2室溫孵育 5～10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗，PBS浸泡 5 min×2次。5%～10% 正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育10 min，傾去血清，滴加IL-1、ICAM-1一抗工作液，37 ℃ 孵育1～2 h或 4 ℃過夜。PBS沖洗，5 min×3次。滴加適量生物素標(biāo)記二抗工作液，37 ℃孵育10～30 min。PBS沖洗，5 min×3次。滴加適量的辣根酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37 ℃ 孵育10～30 min。PBS沖洗，5 min ×3次。顯色劑顯色3～15 min(DAB或NBT/BCIP)。自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。免疫組化結(jié)果以染色為棕黃色為陽性表達(dá)，根據(jù)陽性細(xì)胞的分布情況，每張切片拍攝5個(gè)陽性視野，每例標(biāo)本的切片隨機(jī)選取5個(gè)400倍視野，計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 血腦屏障開放情況 對(duì)照組肉眼觀未見藍(lán)色染色，實(shí)驗(yàn)各組肉眼觀察可見藍(lán)色染色 。

2.2 腦組織形態(tài)學(xué)變化 對(duì)照組光鏡下未見腦組織水腫和形態(tài)學(xué)變化。實(shí)驗(yàn)組肉眼觀察可見藍(lán)色染色，光鏡下可見細(xì)胞水腫，紅細(xì)胞滲出，個(gè)別細(xì)胞壞死。

2.3 各組腦損傷組織IL-1、ICAM-1陽性細(xì)胞數(shù)比較 光鏡下見IL-1、ICAM-1的陽性表達(dá)產(chǎn)物呈棕色，對(duì)照組IL-1、ICAM-1不表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組IL-1、ICAM-1陽性細(xì)胞數(shù)增多，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；實(shí)驗(yàn)組間比較，B1、B2組較A1、A2組IL-1、ICAM-1陽性細(xì)胞數(shù)增加(P均<0.05)，A1、A2組及B1、B2組之間比較，P均>0.05。見表1。

表1 各組腦損傷組織ICAM-1、IL-1陽性細(xì)胞數(shù)比較(個(gè)/400倍視野，

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，與B1、B2組比較，★P<0.05。

3 討論

本課題組前期研究表明，超聲聯(lián)合造影劑能夠有效開放血腦屏障，但可造成一定程度的腦組織損傷。本研究結(jié)果顯示，照射區(qū)大鼠腦組織出現(xiàn)水腫，紅細(xì)胞滲出，并有少量細(xì)胞出現(xiàn)壞死。超聲聯(lián)合造影劑開放血腦屏障的機(jī)制，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是超聲波與造影劑之間相互作用的結(jié)果，其中主要生物學(xué)效應(yīng)是空化效應(yīng)、熱效應(yīng)及機(jī)械效應(yīng)[4]。這幾種效應(yīng)均可引起組織內(nèi)摩擦，使蛋白質(zhì)變性、細(xì)胞和組織變形，破壞靶區(qū)的細(xì)胞及其支持結(jié)構(gòu)，改變細(xì)胞功能，在形態(tài)學(xué)上主要表現(xiàn)為血管壁損傷、紅細(xì)胞漏出、腦組織水腫等特征[5]。

腦組織損傷形態(tài)學(xué)的改變均與炎癥反應(yīng)有密切關(guān)系。以往大量文獻(xiàn)研究顯示，腦組織創(chuàng)傷后，炎癥反應(yīng)是腦損傷病理生理過程中的重要組成環(huán)節(jié)。腦損傷后炎性細(xì)胞成分的積聚，均會(huì)誘發(fā)炎癥前細(xì)胞因子、化學(xué)因子以及內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞黏附因子的表達(dá)上調(diào)[6～8]。本研究結(jié)果顯示，超聲聯(lián)合造影劑開放血腦屏障時(shí)，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組腦損傷組織中IL-1、ICAM-1表達(dá)量增加，說明IL-1、ICAM-1參與了腦組織損傷。

IL-1是體內(nèi)最重要的促炎細(xì)胞因子[9]。在炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)證明，腦損傷可導(dǎo)致IL-1合成增加。在微血管受到損傷時(shí)，參與炎癥反應(yīng)的黏附分子及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在炎癥反應(yīng)和炎癥蔓延中發(fā)揮著重要作用[10]。ICAM-1是血細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞膜受損后釋放的一系列糖蛋白分子，在炎性反應(yīng)、免疫應(yīng)答、凝血與血小板形成以及維持正常內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)方面有重要作用，其在創(chuàng)傷性腦損傷后的病理生理過程中也起著重要作用。腦損傷后ICAM-1表達(dá)，在促進(jìn)炎性細(xì)胞黏附并穿越血腦屏障時(shí)，將可能對(duì)血腦屏障細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變起調(diào)節(jié)甚至破壞作用，從而引起血腦屏障通透性增加，導(dǎo)致腦水腫形成[11，12]。

本研究結(jié)果顯示，超聲聯(lián)合造影劑開放血腦屏障時(shí)，隨著超聲強(qiáng)度的增加，IL-1、ICAM-1陽性表達(dá)量增加，而隨著照射時(shí)間的增加，IL-1、ICAM-1陽性表達(dá)量增加不明顯，說明隨著超聲強(qiáng)度的加大，腦組織損傷程度加大，炎癥程度加重，超聲強(qiáng)度是影響腦組織損傷的一個(gè)重要因素，而超聲照射時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)腦組織損傷程度影響不大，分析其原因可能是超聲造影劑的代謝時(shí)間所致，一般情況下，超聲造影劑的有效排出機(jī)體時(shí)間大約為5 min,在機(jī)體注射造影劑后，造影劑的濃度明顯下降，超聲照射對(duì)腦組織的影響明顯降低[13]。

綜上所述，超聲聯(lián)合造影劑開放大鼠血腦屏障能夠造成腦組織損傷，且腦組織損傷與炎癥因子表達(dá)密切相關(guān)，證實(shí)了高頻超聲聯(lián)合造影劑開放動(dòng)物血腦屏障造成腦組織損傷的病理學(xué)基礎(chǔ)可能是炎癥反應(yīng)。為將來臨床應(yīng)用超聲波聯(lián)合微泡造影劑開放人血腦屏障進(jìn)行藥物的傳遞和治療及對(duì)腦組織損傷的預(yù)防提供一定的理論基礎(chǔ)。

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翟虹(E-mail: zhaishuanghai@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.29.011

R725.54

A

1002-266X(2017)29-0036-03

2017-05-22)