張樹(shù)天，崔 凱，徐春盛，鐘代星△

1．第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員一旅四營(yíng)十四連(西安710032)，2．第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院胸腔外科(西安710038)3．解放軍第537醫(yī)院(寶雞721006)

MSP58沉默對(duì)肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞生物學(xué)行為的影響*

張樹(shù)天1，崔 凱2，徐春盛3，鐘代星2△

1．第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)員一旅四營(yíng)十四連(西安710032)，2．第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院胸腔外科(西安710038)3．解放軍第537醫(yī)院(寶雞721006)

目的：探討沉默MSP58基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞A549增值，細(xì)胞周期和侵襲能力的影響。方法：化學(xué)合成針對(duì)MSP58基因的siRNA，轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞A549，RT-PCR和Western-blot檢測(cè)MSP58基因的mRNA和蛋白水平，利用MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期，Transwell小室實(shí)驗(yàn)觀察侵襲能力。結(jié)果：針對(duì)MSP58基因的siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48h后，與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，siRNA組顯著降低MSP58的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)，細(xì)胞的增值受到抑制，并隨著時(shí)間延長(zhǎng)抑制明顯，細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，細(xì)胞的侵襲力下降。結(jié)論：利用特異性siRNA沉默MSP58基因的表達(dá)，可以顯著抑制肺癌A549細(xì)胞增值和侵襲能力，MSP58有可能成為肺癌治療的新靶點(diǎn)。

肺癌在中國(guó)是發(fā)病率最高的腫瘤之一[1]。盡管肺癌的靶向治療及其他治療取得了一定的進(jìn)展，但肺癌的預(yù)后仍然很差，5年生存率只有16%左右[2]。MSP58(58-kDa microspherule protein)在細(xì)胞核及核仁中具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，與多種細(xì)胞周期相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子可發(fā)生相互作用，比如：轉(zhuǎn)錄因子Daxx，STRA13，Nrf1和RNA結(jié)合蛋白FMR[3-6]。前期試驗(yàn)證實(shí)，MSP58在結(jié)直腸癌、肝癌、膠質(zhì)瘤和胃癌中的表達(dá)明顯增加，并且與患者的預(yù)后有明顯的相關(guān)。本研究針對(duì)MSP58合成特異性siRNA，沉默該基因在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中的表達(dá)，探討MSP58基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞A549惡性表型的影響并探討其相關(guān)機(jī)制。

材料與方法

1 細(xì)胞及試劑 細(xì)胞系A(chǔ)549從中科院上海細(xì)胞研究所購(gòu)買(mǎi)； RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)；胎牛血清(杭州四季青生物工程公司)；Total RNA 提取劑Trizol，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 ( TaKaRa 公司)；Transwell 小室( Corning 公司)；MSP58一抗(Abnova，抗鼠，1∶500)β-actin(武漢博士德公司抗兔 1∶1000)；lipofectamine 2000(Invitrogen公司)；MTT(北京鼎國(guó)生物公司)。

2 化學(xué)合成siRNA片段 siRNA-MSP58序列：正義鏈:5`- CAGCUCAUCAUCGAACUUCdTdT-3`，反義鏈: 5`-GAAGUUCGAUGAUGAGCUGdTdT-3`。 siRNA-negative control 序列：正義鏈：5`-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3`，反義鏈：5`-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3`。siRNA 序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

3 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 細(xì)胞系A(chǔ)549用RPMI-1640(含10%胎牛血清)常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前換液并鋪板，轉(zhuǎn)染方法按Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)完成。細(xì)胞轉(zhuǎn)染6 h后，換含10%胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。細(xì)胞分組：實(shí)驗(yàn)組為轉(zhuǎn)染針對(duì)MSP58基因的特異性siRNA，陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染siRNA-陰性對(duì)照組，空白對(duì)照組為正常培養(yǎng)的A549細(xì)胞。

4 利用RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)各組細(xì)胞中MSP58 mRNA的表達(dá)量 轉(zhuǎn)染48 h后根據(jù)Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取各組細(xì)胞的總RNA。RT-PCR反應(yīng)根據(jù)Takara反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)完成，上游引物： 5' -ACGCCCTGCTCTACGAT -3'，下游引物：5' -TCATGCCTGTGATGCTGTC -3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度483bp。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性 5 min ；94℃ 30 s，退火 58℃30 s，延伸 72℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)；最后延伸 72℃7 min。反應(yīng)結(jié)束后吸取10 μl產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，并觀察目的片段。

5 利用Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞中MSP58蛋白的表達(dá)量 轉(zhuǎn)染48 h后采集細(xì)胞并進(jìn)行裂解，提取蛋白，按比例加入上樣緩沖液煮沸7 min，每孔加樣20 μl，常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入1∶500MSP58抗體或1∶1000的β-actin抗體，置入4°C冰箱過(guò)夜。1∶4000的羊抗小鼠或羊抗兔二抗室溫下孵育1 h，利用化學(xué)法發(fā)光，膠片顯色后進(jìn)行結(jié)果分析。

6 利用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板中(2×103個(gè)細(xì)胞/孔)，每組細(xì)胞設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，另設(shè)置調(diào)零對(duì)照組(不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)基)，細(xì)胞貼壁后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，6 h后換成完全培養(yǎng)基。分別于轉(zhuǎn)染后24 h，48 h，72 h，96 h，120 h，144 h加入20 μl的MTT( 5 mg /ml) /孔，37℃溫箱孵育4 h后棄去上清，各孔加入150 μL二甲基亞砜，持續(xù)振蕩10 min，直至紫色結(jié)晶完全溶解，利用酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔的光密度值，重復(fù)3次，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果繪制細(xì)胞增殖曲線(xiàn)。

7 利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況 轉(zhuǎn)染48 h后的收集細(xì)胞，用 0.9 ml PBS制成單細(xì)胞懸液，緩慢加入純乙醇2.1 ml固定細(xì)胞，置入4℃冰箱過(guò)夜。離心后棄去乙醇，PBS洗滌細(xì)胞2次。100 μl PBS充分懸浮細(xì)胞，后加入300 μl碘化丙啶染色液，充分反應(yīng)15 min。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況并詳細(xì)記錄。

8 利用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 轉(zhuǎn)染24 h后，收集細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)基充分重懸細(xì)胞，調(diào)整其密度至1×105個(gè)/ml，在Transwell 小室的上室接種200 μL細(xì)胞懸液，下室放置500 μl RPMI-1460完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，培養(yǎng)24 h。4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色15 min。隨機(jī)選取膜上5個(gè)高倍鏡下視野，讀取穿膜細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值。

結(jié) 果

1 siRNA對(duì)A549細(xì)胞中MSP58的mRNA和蛋白表達(dá)量影響 根據(jù)RT-PCR和Western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，siRNA-MSP58轉(zhuǎn)染組的MSP58 基因mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05)；而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的MSP58基因mRNA與蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖1。

A：siRNA轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組MSP58mRNA含顯著低于對(duì)照組(*P<0.01)；B：實(shí)驗(yàn)組MSP58的蛋白表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(*P<0.01)

圖1 siRNA對(duì)A549細(xì)胞中MSP58mRNA和蛋白表達(dá)影響

2 細(xì)胞增殖曲線(xiàn)結(jié)果 與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，siRNA-MSP58組A549細(xì)胞數(shù)量明顯少于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.01)，而兩對(duì)照組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖2。

實(shí)驗(yàn)組增殖能力顯著小于空白對(duì)照組，*P<0.01；實(shí)驗(yàn)組增殖能力顯著小于陰性對(duì)照組，P<0.01

圖2 siRNA- MSP58對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響

3 siRNA-MSP58對(duì)肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞周期分布情況的影響 流式細(xì)胞檢測(cè)的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組G0/G1期細(xì)胞比例顯著低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.01)，而兩對(duì)照組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3。

4 siRNA- MSP58對(duì)A549細(xì)胞侵襲力的影響 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染MSP58 siRNA 48 h后，siRNA-MSP58轉(zhuǎn)染組穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)量明顯少于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.05)，而兩對(duì)照組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖4。

轉(zhuǎn)染siRNA-MSP58后，A549細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，S期細(xì)胞數(shù)量顯著小于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(***P<0.01)

轉(zhuǎn)染siRNA-MSP58后，A549細(xì)胞侵襲能力顯著弱于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(***P<0.01)

討 論

目前研究認(rèn)為，MSP58是一個(gè)癌基因。MSP58可以特異的被癌基因v-jun誘導(dǎo)表達(dá)，使纖維母細(xì)胞惡變，細(xì)胞的增殖能力大幅度加強(qiáng)，并出現(xiàn)非錨定依賴(lài)生長(zhǎng)的表型[7]。抑癌基因PTEN 通過(guò)c-端區(qū)域可以抑制MSP58誘導(dǎo)纖維母細(xì)胞惡變[8]。同時(shí)，MSP58在結(jié)直腸癌、肝癌、膠質(zhì)瘤和胃癌中的表達(dá)明顯增加，與腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，MSP58表達(dá)量越高，患者的預(yù)后越差。本研究證實(shí)MSP58基因在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中高表達(dá)，提示MSP58基因可能與A549的惡性表型相關(guān)，在肺癌中可能是一種癌基因。

RNA干涉(siRNA)作為一個(gè)有效的工具，被廣泛應(yīng)用與基因功能的研究，并有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，包括腫瘤的治療[9]。本研究化學(xué)合成的siRNA-MSP58，可以特異性的抑制A549細(xì)胞中MSP58的表達(dá)，為進(jìn)一步研究MSP58的功能提供了研究基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，轉(zhuǎn)染MSP58 siRNA后，A549細(xì)胞的體外增殖能力明顯下降。研究還發(fā)現(xiàn)，MSP58 siRNA能夠有效的降低A549細(xì)胞的侵襲能力。這與前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。MSP58沉默后，可明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲[10]，并降低了膠質(zhì)瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤能力。在食管癌細(xì)胞中，MSP58 siRNA通過(guò)調(diào)節(jié)P21，CDK4 和cyclin D1分子的表達(dá)，抑制食管癌細(xì)胞在體內(nèi)和體外的增殖。

多數(shù)抑制細(xì)胞增殖的因子是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期而實(shí)現(xiàn)的。MSP58的表達(dá)依賴(lài)于細(xì)胞周期，組織分部實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在外周血的白細(xì)胞、胸腺以及睪丸等增殖旺盛的細(xì)胞和組織中MSP58的表達(dá)含量顯著升高。并且，MSP58與周期相關(guān)分子P120，STRA13以及P78可發(fā)生相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的改變，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖。本實(shí)驗(yàn)中，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：沉默MSP58基因的表達(dá)后，細(xì)胞周期發(fā)生了G0/G1阻滯，部分解釋了MSP58 siRNA抑制A549細(xì)胞增殖的原因，其分子機(jī)制及體內(nèi)的功能需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

綜上所述，在肺癌細(xì)胞A549的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中，MSP58基因可能發(fā)揮著重要作用，利用RNA干擾技術(shù)能夠特異性地阻斷MSP58的表達(dá)，可有效抑制肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。

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(收稿：2017-06-10)

RNAi-mediated silencing of MSP58 suppressesproliferation and migration in lung cancer cells A549

Zhang Shutian, Cui Kai， Xu Chunsheng，et al.

14 Company 4 Battalion 1 Brigade, the Fourth Military Medical University(Xi’an 710032)

Objective：To determine the effect of MSP58 knockdown by RNA interference (RNAi) on the proliferation and migration in lung cancer cells A549. Methods：The siRNA targeting MSP58 gene and negative control siRNA were synthesized and transfected to lung cancer cells A549. RT-PCR and Western-blot were applied to observe the expression of mRNA and protein level of MSP58. The cell growth curve was drawn by MTT. Cell cycle was analyzed by flow cytometry. The cell migration ability was detected by Transwell assay. Results: After transfected 48h, comparing to the negative group and blank group, the expression of MSP58 mRNA and protein was down-regulated by siRNA targeting MSP58 gene. The cell proliferation of A549 in siRNA group was suppressed in a time-dependent manner, cell cycle was blocked in G1 phrase, and the ability of migration declined significantly. Conclusion: Specific siRNA targeting MSP58 efficiently inhibits the proliferation and migration in A549 cells，and the MSP58 gene is a promising anti-tumor target of lung cancer.

Lung Neoplasms @MSP58 Cell Biology

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81402545)

肺腫瘤 @MSP58 細(xì)胞生物學(xué)

R734.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.08.003

△通訊作者