劉 慧，張 薇，盧少平

第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院心內(nèi)科(西安 710038)

槲皮素在大鼠心肌損傷中的抗氧化作用*

劉 慧，張 薇，盧少平△

第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院心內(nèi)科(西安 710038)

目的:評(píng)價(jià)槲皮素對(duì)異丙腎上腺素(ISO)誘導(dǎo)的大鼠損傷心肌的氧化應(yīng)激活動(dòng)功能的影響。方法:以Wistar大鼠為試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，分為?duì)照組、ISO組(70mg/kg)干預(yù)組、ISO+不同濃度槲皮素干預(yù)組,分別測(cè)定Na+- K+ATP酶，Ca2+- Mg2+ATP酶和MPO的活性、心肌脂質(zhì)過(guò)氧化水平、心肌谷胱甘肽水平(GSH)、SOD、CAT、GSH- Px活性。結(jié)果: 與對(duì)照組相比，ISO組的Na+- K+ATP酶，Ca2+- Mg2+ATP酶、心肌谷胱甘肽水平、SOD、CAT、GSH-Px活性均明顯降低(P<0.01),而MPO的活性、心肌脂質(zhì)過(guò)氧化物水平明顯增加(P<0.01)； 與ISO組相比，三個(gè)劑量槲皮素干預(yù)組可劑量依賴型地增加、心肌組織Na+-K+ATP酶，Ca2+-Mg2+ATP酶活性，GSH水平和SOD、CAT、GSH-Px活性(P<0.01),并劑量依賴型降低MPO活性及心肌脂質(zhì)過(guò)氧化水平(P<0.01)。結(jié)論：槲皮素有對(duì)抗心肌細(xì)胞氧化損傷的作用，其作用機(jī)制與槲皮素的抗氧化活性有關(guān)。

缺血可導(dǎo)致許多重要的疾病，如心梗、心絞痛、血栓性腦卒中等。異丙基腎上腺素(Isoprenaline，ISO)為兒茶酚胺類經(jīng)典藥物，可導(dǎo)致急性心肌損傷甚至壞死。槲皮素是類黃酮家族中最具有代表性的化合物，口服槲皮素可增加血漿抗氧化能力并明顯使肝臟免受缺血再灌注損傷[1]。此外，在在體和離體中，槲皮素均具有細(xì)胞功能保護(hù)效應(yīng)。本研究利用ISO誘導(dǎo)心肌細(xì)胞缺血損傷建立模型，觀察槲皮素對(duì)心肌抗氧化損傷的作用，為進(jìn)一步研究其心肌保護(hù)作用奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)標(biāo)本制備 在動(dòng)物區(qū)馴化6～7d的Wistar大鼠。所有的大鼠圈養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)條件下(溫度(20±1)℃，濕度(60±10)%，光照從上午6點(diǎn)到下午6點(diǎn))，給予普通飼料，飲水無(wú)限量。解剖心臟，變冷，并灌注冰鹽水。用冰鹽水清洗后，拍干心臟，稱重。在磷酸緩沖液(50 Mm,pH7.4)中制備10%W/V的勻漿(用心臟組織)。用7000 g的離心力離心勻漿10 min(4℃下)。浮在表面的用于檢驗(yàn)MDA，Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶、MPO、SOD、CAT和GPx。

2 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)措施 實(shí)驗(yàn)分為5組(每組8只)，組1為對(duì)照組，在第29天和第30天給予蒸餾水(0.5 ml/kg)，間隔24 h。組2：ISO組，在第29天和第30天給與ISO(70 mg/kg)各一次(間隔24 h)；組3，4，5：ISO+槲皮素組。每天給予槲皮素(50、100、150 mg/kg)，共30 d，在第29天和第30天給與ISO(70 mg/kg)各一次(間隔24 h)。

3 主要試驗(yàn)藥品、試劑 槲皮素構(gòu)自南京澤朗醫(yī)藥有限公司(南京，中國(guó))。Na+-K+ATP酶，Ca2+-Mg2+ATP酶測(cè)定所用的ATP二鈉鹽由sigma公司提供(布里斯托，英國(guó))。心肌谷胱甘肽(GSHpx)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物歧化酶(SOD)、髓過(guò)氧化物酶(MPO)、脂質(zhì)過(guò)氧化物(LOP)測(cè)定均使用的主要試劑均購(gòu)自南京建成生物工程研究所(南京，中國(guó))。

4 Na+-K+ATP酶和Ca2+-Mg2+ATP酶的測(cè)定 培養(yǎng)組織提取物中的ATP二鈉鹽后，通過(guò)光譜光度測(cè)量法測(cè)量大量的無(wú)機(jī)磷釋放來(lái)分析Na+-K+ATP酶，Ca2+-Mg2+ATP酶活性。

5 MPO活性的測(cè)定 組織在三羥甲基氨基緩沖液(包括蛋白酶抑制劑)中變成勻漿，然后勻漿在4℃中離心30 min，20 ml上層液隨后與1.6 mM的四甲基聯(lián)苯胺二鹽酸和0.1 mM H2O2的溶液反應(yīng)。用波長(zhǎng)為620 mM的分光光度計(jì)測(cè)量吸光度。

6 TBARS、SOD、GSH水平、CAT、GSH-Px 用TBARS法監(jiān)測(cè)脂質(zhì)過(guò)氧化物。結(jié)果用nmolMDA/ml中占nmolMDA/g來(lái)表示。SOD活性的測(cè)定參照Kakkal等介紹的方法。CAT活性測(cè)定參照sinha[2]介紹的方法。用谷胱甘肽過(guò)氧化物酶試劑盒A005測(cè)定谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩組均數(shù)間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同濃度槲皮素對(duì)ISO誘導(dǎo)下Na+-K+ATP酶，Ca2+-Mg2+ATP酶和MPO的活性的影響 在缺血再灌注損傷的大鼠心臟中，Na+-K+ATP酶，Ca2+-Mg2+ATP酶和MPO的活性。在缺血再灌注損傷的大鼠中，與對(duì)照組相比，ISO干預(yù)組心肌Na+-K+ATP酶，Ca2+-Mg2+ATP酶明顯降低(P<0.01)，而MPO活性明顯增高(P<0.01)。與ISO組相比，ISO+槲皮素(50、100、150 mg/Kg組)可劑量依賴型明顯增加心肌組織Na+-K+ATP酶，Ca2+-Mg2+ATP酶活性(P<0.01)，并降低MPO活性(P<0.01),見(jiàn)表1。

2 不同濃度槲皮素對(duì)心肌TBARS、GSH水平、SOD、CAT、GSH-Px活性的影響 與對(duì)照組相比，ISO組心肌脂質(zhì)過(guò)氧化水平明顯增加(P<0.05),但心肌谷胱甘肽水平、SOD、CAT、GSH-Px活性降低。與ISO組相比，ISO+槲皮素(50,100,150 mg/Kg組)心肌脂質(zhì)過(guò)氧化水平明顯降低，心肌GSH和SOD、CAT、GSH-Px活性增加(P<0.01)。且以上效應(yīng)呈劑量依賴型,見(jiàn)表2。

表1 槲皮素Na+-K+ ATP酶、Ca2+-Mg2+ ATP酶、MPO的影響

注：與對(duì)照組相比，*P<0.01 ； 與ISO干預(yù)組相比，#P<0.01

表2 槲皮素對(duì)心肌TBARS、GSH水平、SOD、CAT、GSH-Px活性的影響

注：與對(duì)照組相比，*P<0.01 ； 與ISO干預(yù)組相比，#P<0.01

討 論

心肌缺血、心肌梗死的發(fā)生率在我國(guó)呈逐年上升趨勢(shì)，隨著治療手段的不斷進(jìn)步和改善，心肌組織能及時(shí)重獲血供。然而，心肌組織在重獲血供過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)組織、器官功能障礙和結(jié)構(gòu)功能損傷加重，嚴(yán)重時(shí)可表現(xiàn)為不可逆的損傷，這種現(xiàn)象稱為心肌缺血再灌注損傷[3]。

ISO可誘導(dǎo)心內(nèi)膜下心肌缺血、組織缺氧、壞死，可導(dǎo)致心肌順應(yīng)性下降，并抑制心臟舒張和收縮功能。而且，ISO被廣泛應(yīng)用于作為介質(zhì)，來(lái)評(píng)價(jià)藥物在缺血性疾病中對(duì)心肌的影響。槲皮素被認(rèn)為具有抗氧化特性。槲皮素的心肌保護(hù)作用大部分歸功于抗氧化特性，它就是被人們所熟知的增強(qiáng)GSH，抗氧化酶水平，并清除過(guò)氧化脂質(zhì)。槲皮素被預(yù)測(cè)具有明顯的心肌保護(hù)特性。有研究顯示，多酚類黃酮化合物之一的二氫槲皮素可通過(guò)抗氧化自由基損傷從而達(dá)到對(duì)缺血心肌保護(hù)的作用[4]。

在本研究中，ISO誘導(dǎo)心肌缺血后，通過(guò)50、100、150 mg/kg槲皮素的慢性給藥可導(dǎo)致心肌GSH水平、SOD、GSH-Px和CAT活性的增高，和心肌MDA水平的下降。這個(gè)適應(yīng)性可能有助于它的心肌保護(hù)作用，并加強(qiáng)心臟的防御機(jī)制。

綜上所述，槲皮素有抗異丙腎誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化損傷的作用，該心肌保護(hù)作用可能部分是通過(guò)增強(qiáng)過(guò)氧化物活性并刺激免疫功能來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

[1] Su JF,Gou CJ,Wei JY,etal.Protection against hepatic ischemia-reperfusion injury in rats by oral pretreatment with quercetin.Biomed.Environ[J].Sci,2003,16:1-8.

[2] Sinha AK.Colorimetric assay of catalase[J]. Anal Biochem, 1972, 47: 389-395.

[3] 楊潔瓊，胡明珠，杜 斌，等.AMPK/PGC1α信號(hào)通路在硫化氫抗心肌缺血/再灌注損傷中的作用[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2015，31(7)：951-956.

[4] 盧 寧，韓吉春，任博雪，等.二氫槲皮素預(yù)處理對(duì)心肌缺血/再灌注損傷抗氧化作用的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2017，33(4)：487-491.

(收稿：2017-02-16)

*國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81470537)

心肌缺血 抗氧化劑 @槲皮素

R542.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.08.004

△通訊作者