劉軍政，張書艷，高建強(qiáng)

1.陜西省第四人民醫(yī)院(西安 710043)，2.西安市東方醫(yī)院(西安 710043)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)軟骨誘導(dǎo)分化過程中microRNA調(diào)控機(jī)制

劉軍政1，張書艷1，高建強(qiáng)2

1.陜西省第四人民醫(yī)院(西安 710043)，2.西安市東方醫(yī)院(西安 710043)

目的：探討microRNA(miRNA)在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)軟骨誘導(dǎo)分化過程中的調(diào)控機(jī)制。方法：以大鼠骨髓中分離出的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)作為研究對(duì)象，用轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)誘導(dǎo)MSCs軟骨分化，利用基因芯片技術(shù)檢測軟骨誘導(dǎo)分化過程中miRNA表達(dá)情況，并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證；采用SAM軟件篩選出軟骨誘導(dǎo)過程中差異表達(dá)的miRNA。結(jié)果：基因芯片技術(shù)共篩選出BMSCs向軟骨分化過程中9個(gè)表達(dá)差異miRNA，其中表達(dá)上調(diào)的共有7個(gè)，分別為miR-34a、miR-130b、miR-193b、miR-30a、miR-152、miR-90a、miR-99a；表達(dá)下調(diào)的共有2個(gè)，分別為miR-424、miR-135。選擇軟骨誘導(dǎo)分化過程中表達(dá)明顯升高的miR-130b、miR-193b，及表達(dá)明顯降低的miR-424、miR-135；在原樣本中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，結(jié)果顯示實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果與基因芯片結(jié)果一致，證實(shí)了芯片結(jié)果真實(shí)可信。結(jié)論:高表達(dá)的miR-34a、miR-130b、miR-193b、miR-30a、miR-152、miR-90a、miR-99a和低表達(dá)的miR-424、miR-135共同參與了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨分化的調(diào)節(jié)過程。

microRNA(miRNA)是一種存在于生物體中、參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的小RNA，其通過與靶基因mRNA堿基配對(duì)，導(dǎo)致靶基因mRNA堿基翻譯受阻或直接使其降解，進(jìn)而發(fā)揮調(diào)控作用[1]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Mesenchymal stem cells,BMSCs)具有多向分化和自我更新潛能的一類干細(xì)胞，國外研究證實(shí)BMSCs能夠分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞等多種細(xì)胞株，亦是軟骨自我修復(fù)主要的種子細(xì)胞。雖然已有研究[2]稱將BMSCs用于治療關(guān)節(jié)軟骨缺損，然而這種干細(xì)胞治療方法的安全性依然存在較大爭議；究其原因，可能與BMSCs來源、誘導(dǎo)方式不同所致miRNA有較大差異有關(guān)。鑒于此，本研究分離大鼠骨髓來源的MSCs，并誘導(dǎo)軟骨分化，通過基因芯片技術(shù)觀察miRNA差異表達(dá)，篩選出與軟骨分化調(diào)節(jié)相關(guān)的miRNA，旨在探討miRNA在軟骨分化中的調(diào)控機(jī)制，現(xiàn)將研究成果報(bào)告如下。

材料和方法

1 動(dòng)物來源 5只SPF級(jí)SD大鼠購自陜西省第四人民醫(yī)院動(dòng)物中心，周齡4～6周，體質(zhì)量110～140g，雌雄不限，所有大鼠均給予自由進(jìn)食進(jìn)水，保持室溫20℃～22℃；光照12 h、黑暗12 h晝夜交替飼養(yǎng)，使用1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究方案經(jīng)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 試劑與儀器 生物標(biāo)志物兔抗大鼠單克隆抗體CD29- FITC(異硫氰酸熒光素)、CD45-FITC、CD54-FITC、CD90-FITC均購自美國Santa公司，轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)、兔抗大鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuron-specific enolase,NSE)單克隆抗體、兔抗大鼠神經(jīng)巢蛋白(Nestin)單克隆抗體由上海嵐派生物科技有限公司提供。PCR引物由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)、合成，Trizol試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑Transfectamin 2000由美國Invitrogen公司提供，miRNA Isolation Kit由羅氏公司提供。

美國ABI GeneAmp 9700 PCR儀，倒置相差顯微鏡購自日本奧林巴斯公司， FC500MCL/MPL流式細(xì)胞儀購自貝克曼庫爾特公司。

3 方 法

3.1 BMSCs細(xì)胞分離與培養(yǎng)：喂養(yǎng)1周后，將大鼠頸椎脫臼處死，解剖分離大鼠下肢股骨，于無菌環(huán)境下抽取大鼠股骨骨髓，置于肝素抗凝管中，磷酸鹽緩沖液稀釋，加入人淋巴細(xì)胞分離液，1 400 g離心10 min，取中間層，PBS沖洗2次，再接種于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)密度1×109/L。培養(yǎng)條件：5%CO2、37℃、培養(yǎng)濕度95%，培養(yǎng)第3 d首次換液，以后每2 d換液1次。每次換液后于顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長情況，待細(xì)胞單層融合至80%時(shí)，胰蛋白酶消化，按照1∶2比例傳代培養(yǎng)，此為第1代細(xì)胞(P1，以后培養(yǎng)代數(shù)記為P2、P3…，以此類推)。

3.2 大鼠BMSCs細(xì)胞鑒定：取P4代大鼠BMSCs細(xì)胞，PBS洗滌3次，細(xì)胞濃度1.0×106個(gè)/L，制成細(xì)胞懸液1 ml，置于EP管中，分別加入CD29- FITC、CD45-FITC、CD54-FITC、CD90-FITC單克隆抗體5 μL，并設(shè)立同型陰性對(duì)照，37 ℃反應(yīng)30 min，800 g離心20 min，PBS重懸細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

3.3 大鼠BMSCs軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)及鑒定：將P4代大鼠BMSCs細(xì)胞以5×106個(gè)/L濃度抽取1 ml，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液，按照培養(yǎng)液的組成將細(xì)胞分為兩組：陽性組和對(duì)照組，陽性組基礎(chǔ)培養(yǎng)液組成：1g/ml TGF-β1、1×10-7mmol/L地塞米松、6.25 ng/L胰島素、0.05 mg/L維生素C、1.25 μg/ml牛血清白蛋白；對(duì)照組不加TGF-β1，其余同陽性組；兩組細(xì)胞培養(yǎng)3 d后首次更換培養(yǎng)液，以后每2 d更換1次培養(yǎng)液，共培養(yǎng)21 d。誘導(dǎo)結(jié)束后棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，以4%的多聚甲醛固定20 min，常規(guī)石蠟包埋并切片，蒸餾水脫蠟沖洗，甲苯胺藍(lán)染色，顯微鏡下觀察并拍照記錄。

3.4 基因芯片檢查miRNA表達(dá)：分別收集軟骨誘導(dǎo)前(T0)，培養(yǎng)后7 d(T1)、14 d(T2)、21 d(T3)的BMSCs細(xì)胞，一步法提取總RNA，用miRNA Isolation Kit將低于100nt的RNA片段分離，再進(jìn)行poly(A)加尾及反轉(zhuǎn)錄，將擴(kuò)增后的RNA樣品進(jìn)行熒光標(biāo)記，雙通道激光掃描儀進(jìn)行掃描；用Significance Analysis of Microarrays (SAM version 2.1) 分析軟骨誘導(dǎo)后存在差異表達(dá)的miRNA，篩選出表達(dá)差異的miRNA為對(duì)照組表達(dá)2倍以上。

3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證：將軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板、實(shí)時(shí)定量miRNA作為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：引物濃度0.3 μmmol/L，96℃變性20 s，60℃退火45 s，總計(jì)35個(gè)循環(huán)。70℃～94℃繪制熔解曲線，分析PCR熔解曲線，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)平行孔，以miRNA U6作為內(nèi)參照計(jì)算miRNA的相對(duì)表達(dá)量。

結(jié) 果

1 大鼠BMSCs細(xì)胞及軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)特征 BMSCs細(xì)胞原代培養(yǎng)1 d后即可見細(xì)胞貼壁生長，細(xì)胞形態(tài)均一，外觀多呈梭型；培養(yǎng)3～4 d后貼壁生長的細(xì)胞可單層融合(圖1A)。P4代的BMSCs細(xì)胞經(jīng)軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d后，細(xì)胞呈圓形改變，細(xì)胞核明顯縮??；經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后可見細(xì)胞漿呈均一藍(lán)色，提示軟骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)存在大量的糖胺多糖成分(圖1B)。

2 誘導(dǎo)BMSCs軟骨分化鑒定 流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測顯示，P4代BMSCs細(xì)胞中CD29、CD90呈陽性表達(dá)，CD45、CD54呈陰性表達(dá)，與間充質(zhì)干細(xì)胞特性一致(圖2)。

3 軟骨分化后差異表達(dá)miRNA檢測 BMSCs細(xì)胞軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21d后，經(jīng)基因芯片檢測，并由SAM分析共篩選出9個(gè)表達(dá)差異相對(duì)于對(duì)照組2倍以上的miRNA，其中表達(dá)上調(diào)的共有7個(gè)，分別為miR-34a、miR-130b、miR-193b、miR-30a、miR-152、miR-90a、miR-99a；表達(dá)下調(diào)的共有2個(gè)，分別為miR-424、miR-135。

A BMSCs細(xì)胞的形態(tài)特征 B 成軟骨細(xì)胞的形態(tài)特征

圖1 BMSCs與成軟骨細(xì)胞培養(yǎng)中的形態(tài)特征 圖2 細(xì)胞表面抗原的表達(dá)水平

4 差異表達(dá)miRNA的驗(yàn)證 選擇軟骨誘導(dǎo)分化過程中表達(dá)明顯升高的miR-130b、miR-193b，及表達(dá)明顯降低的miR-424、miR-135，在原樣本中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，結(jié)果顯示實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果與基因芯片結(jié)果一致，見表1。

表1 RT-PCR檢測miRNA表達(dá)(2-△△CT)

注：與 T0比較，*P<0.05

討 論

BMSCs細(xì)胞作為具有多向分化和自我更新能力的一類干細(xì)胞。目前研究已證實(shí)miRNA參與調(diào)節(jié)BMSCs的多向分化，然而miRNA調(diào)節(jié)作用是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，當(dāng)前對(duì)其尚處于初步研究階段。Clark等[3]報(bào)道稱miR-90參與了BMSCs向軟骨分化的調(diào)控；Ham等[4]則證實(shí)miR-23b同時(shí)參與了BMSCs向成骨、軟骨和脂肪的分化。由于BMSCs的來源及誘導(dǎo)方式的不同，導(dǎo)致各家報(bào)道中miRNA種類差異較大，因此究竟何種miRNA參與調(diào)控BMSCs向軟骨分化還需要更大的樣本證實(shí)。

本研究通過基因芯片檢測及實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，共篩選出9種表達(dá)差異的miRNA，包括高表達(dá)趨勢的miR-34a、miR-130b、miR-193b、miR-30a、miR-152、miR-90a、miR-99a和低表達(dá)趨勢的miR-424、miR-135。周峰等[5]報(bào)道稱miR-130b、miR-193b主要參與調(diào)控CAMTA1、GDF11、CD44等基因，而上述這些基因在維持干細(xì)胞分化特性方面發(fā)揮著重要作用。低表達(dá)的miR-135、miR-424參與調(diào)節(jié)COL4A1、BMP8A等骨形成基因。Crobu等[6]亦證實(shí)miR-424在誘導(dǎo)成骨轉(zhuǎn)化的BMSCs細(xì)胞中高表達(dá)，結(jié)合本研究結(jié)論，似乎可以驗(yàn)證上述結(jié)論。

綜上所述，高表達(dá)的miR-34a、miR-130b、miR-193b、miR-30a、miR-152、miR-90a、miR-99a和低表達(dá)的miR-424、miR-135共同參與了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨分化的調(diào)節(jié)過程。然而需要注意的是，人類基因組中有多達(dá)1000多種miRNA，由于miRNA之間也會(huì)相互調(diào)節(jié)，導(dǎo)致整個(gè)調(diào)節(jié)過程異常復(fù)雜；加之本研究選擇的樣本僅為大鼠來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，因此本研究結(jié)論仍需要進(jìn)一步證實(shí)。

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(收稿：2017-03-13)

Regulation mechanism of microRNA on bone mesenchymal stemcells during chondrogenic differentiation

Liu Junzheng，Zhang Shuyan，Gao Jianqiang

The Fourth People’s Hospital of Shaanxi(Xi’an 710043)

Objective: To explore the regulation mechanism of microRNA on bone mesenchymal stem cells during chondrogenic differentiation.Methods: Bone mesenchymal stem cells (BMSCs) isolated from rat bone marrow were used as the research objects,chondrogenic differentiation of BMSCs was induced by transforming growth factor-β1(TGF-β1),the expression of miRNA in during differentiation was detected by gene chip technology,and validation by real time fluorescent quantitative PCR,screened the differentially expressed miRNA in the process of cartilage induction by SAM software.Results: A total of 9 differentially expressed miRNA of BMSCs during chondrogenic differentiation was screened by gene chip technology,and increased expression with 7,included miR-34a，miR-130b，miR-193b，miR-30a，miR-152，miR-90a，miR-99a,2 with down expression,included miR-424 and miR-135.The significantly increased expression of miR-130b，miR-193,and the significantly decreased expression of miR-424 and miR-135 were selected,real time fluorescence quantitative PCR was used in the original sample,the results showed that the results of real-time fluorescence quantitative PCR were consistent with the results of gene chip,confirmed the authenticity of the chip results.Conclusion: High expression of miR-34a，miR-130b，miR-193b，miR-30a，miR-152，miR-90a，miR-99a and low expression of miR-424，miR-135 together to participate the bone mesenchymal stem cells during chondrogenic differentiation.

Hematopoietic stem cells Bone marrow Chondrogenic differentiation Micro RNA/immunology

造血干細(xì)胞 骨髓 軟骨分化 微小RNA/免疫學(xué)

R446.63

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.08.002