姚文蓮，徐 薪

原子力顯微鏡對結(jié)合HER-2后乳腺癌細(xì)胞膜的觀察

姚文蓮，徐 薪

目的 通過原子力顯微鏡(atomic force microscopy，AFM)觀察人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞膜的表面形態(tài)變化，為提高乳腺癌HER-2檢測的敏感性和精確性提供新方法。方法 利用AFM分別觀察不同組織學(xué)類型的人類表皮生長因子受體抗體陽性表達(dá)和陰性表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞膜表面形態(tài)特征并對特征參數(shù)平均粗糙度、平均峰高度、平均凹陷深度和表面積差值進(jìn)行定量測量，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行差異性分析。結(jié)果 HER-2陽性表達(dá)組的乳腺癌細(xì)胞形態(tài)和陰性表達(dá)組相比具有明顯的不同：HER2陰性表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞膜隆起較“尖銳”，隆起物高且偏細(xì)，每個單倍計(jì)數(shù)面積內(nèi)的隆起物數(shù)目較多；而HER2陽性表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞膜隆起較“粗大”，隆起物低且偏粗，每個單位計(jì)數(shù)面積內(nèi)的隆起物數(shù)目明顯減少。兩組細(xì)胞在平均粗糙度[(21.87±2.46)/(32.65±1.03),P<0.000]、平均峰高度[(13.94±1.01)/(31.15±3.89),P<0.001]、平均凹陷深度[(11.09±6.36)/(33.58±3.15),P<0.001]和表面積差值[(6.27±2.03)/(19.65±1.13),P<0.001]方面具有明顯差異(P<0.05)。不同組織學(xué)類型的乳腺癌細(xì)胞膜表面形態(tài)變化趨勢與此一致。結(jié)論 細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu)因細(xì)胞功能狀態(tài)的不同而不相同。相同腫瘤細(xì)胞在不同功能狀態(tài)下，其細(xì)胞膜在形態(tài)結(jié)構(gòu)上存在很大的差異，這為探討腫瘤的發(fā)生機(jī)制、發(fā)展過程和早期診斷及細(xì)胞診斷提供依據(jù)，為提高HER-2的陽性率診斷提供新方法。

原子力顯微鏡；乳腺癌；人類表皮生長因子受體2；細(xì)胞膜；形態(tài)特征

乳腺癌是危害女性健康的主要惡性腫瘤之一。近幾年來，我國乳腺癌的發(fā)病率以每年3%的幅度逐年上升[1]，并且呈現(xiàn)年輕的趨勢。有數(shù)據(jù)顯示，目前北京、上海等地區(qū)乳腺癌的發(fā)病率高達(dá)30/10萬，在女性惡性腫瘤中居第一位，成為威脅女性健康和生命的主要疾病[2]。大量研究表明，定位于染色體17q12-21.32上的HER-2基因，即HER-2基因的過度表達(dá)在乳腺癌細(xì)胞增殖方面起重要作用，與腫瘤患者的病情發(fā)展、腫瘤轉(zhuǎn)移及患者生存期的長短有關(guān)，并且還與患者對化療和內(nèi)分泌治療的耐藥性有關(guān)，是獨(dú)立的不良預(yù)后因素。但是，HER-2的表達(dá)狀態(tài)的改變是如何體現(xiàn)在腫瘤的細(xì)胞膜上的？為什么不同HER-2表達(dá)狀態(tài)的腫瘤對治療的反應(yīng)不同？在腫瘤的形態(tài)結(jié)構(gòu)上有什么與之相對應(yīng)的結(jié)構(gòu)改變？目前尚未見此方面的報道。

AFM作為20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)[3，4]，與傳統(tǒng)的掃描電子顯微鏡相比，它具有很高的橫向和縱向分辨率。隨著納米醫(yī)學(xué)的發(fā)展，AFM于20世紀(jì)90年代后期開始成功地應(yīng)用到生命科學(xué)領(lǐng)域的研究[5-7]，利用其精密的分辨率，可以清晰地觀察細(xì)胞乃至細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)形態(tài)，成功地獲取細(xì)胞膜的形態(tài)并測量其相關(guān)特征參數(shù)。從而觀察腫瘤細(xì)胞的改變和不同，為其不同的生物學(xué)特性和治療提供形態(tài)學(xué)的證據(jù)。本研究利用AFM的這些優(yōu)勢來達(dá)到預(yù)期的目的。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本 選取我院病理科2013-07至2014-07接收到的新鮮乳腺癌切除標(biāo)本，共計(jì)53例。其中，男4例，女49例，18～76歲，平均(38.64±4.16)歲。乳腺浸潤性導(dǎo)管癌32例，黏液癌2例，小葉原位癌13例，其他類型6例。所有標(biāo)本均經(jīng)HE染色和免疫組織化學(xué)一步法染色后由3位以上高年資病理醫(yī)師作出明確診斷。

1.2 主要儀器及規(guī)格 (1)Nanoscope a型AFM(購自Digital InstrumentsInc，SantaBarbara，CA)(懸臂：氮化硅(Si3N4)懸臂；針尖：NSC-Ⅱ型，曲率半徑為20～30 nm；Tapping掃描模式，即輕敲模式)；(2)倒置相差顯微鏡(NIKONECLIPSETE2000-U，日本NIKON公司)

1.3 實(shí)驗(yàn)條件 空氣濕度60%左右，溫度25 ℃左右。

1.4 方法

1.4.1 印片法制備AFM的細(xì)胞觀察樣品 將收集的新鮮乳腺癌組織用潔凈鋒利的刀片剖開，用吸水紙反復(fù)吸去剖面上的血跡、水分和組織液，然后將預(yù)先用1%的甲醛溶液處理好的載玻片輕輕的按壓于組織的剖面上，力求使細(xì)胞均勻的印在玻片上。每個組織剖面印5張切片，每個組織選擇3個切面。將印好細(xì)胞的載玻片置于1%的甲醛溶液中固定20 min，然后取出，置于潔凈的環(huán)境中晾干，分組，保存以備掃描。

1.4.2 分組 用免疫組織化學(xué)的EnVision法檢測HER-2的表達(dá)，并且根據(jù)其蛋白表達(dá)的強(qiáng)度進(jìn)行評分(0、1+、2+、3+，其中2+和3+視為陽性，0和1+視為陰性)[8]。具體結(jié)果判讀如下：(1)0，完全沒有著色或者少于10%的腫瘤細(xì)胞有細(xì)胞膜著色；(2)1+，大于10%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)微弱、不完整的細(xì)胞膜著色；(3)2+，大于10%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)弱至中度完整的細(xì)胞膜著色；(4)3+，大于10%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)的、完整的細(xì)胞膜著色[9]。

1.4.3 AFM掃描各組細(xì)胞樣品 將樣本置于AFM載物臺上，利用Nikon倒置顯微鏡選取合適的細(xì)胞區(qū)域(分散度較好、呈點(diǎn)狀分布的區(qū)域)，調(diào)整激光光斑于顯示器的中心位置，選擇自動調(diào)頻，自動下針以逐步靠近樣本直至接觸到樣本并開始掃描。動態(tài)觀察顯示屏出現(xiàn)的細(xì)胞圖像并隨時調(diào)節(jié)掃描位置，按照掃描由大到小的順序逐步掃描單個完整細(xì)胞和細(xì)胞膜并獲取圖像。每張樣品選取10個細(xì)胞，每個細(xì)胞掃描范圍介于35～500 nm之間。根據(jù)掃描需求在0.5～2.0 Hz調(diào)節(jié)掃描頻率。掃描完成的細(xì)胞和獲取的相應(yīng)圖像進(jìn)行特殊定位和標(biāo)記，以備后續(xù)免疫組織化學(xué)染色進(jìn)一步確認(rèn)分組的準(zhǔn)確性和目標(biāo)細(xì)胞的正確性。掃描圖像保存后用AFM分析軟件進(jìn)一步分析，分別觀察HER-2陽性組和陰性組細(xì)胞的細(xì)胞膜形態(tài)并對表面平均粗糙度、平均峰高度、平均凹陷深度和表面積差值等細(xì)胞膜形態(tài)參數(shù)進(jìn)行定量測量。

1.4.4 免疫組織化學(xué)染色復(fù)核 將掃描完成的乳腺癌印片細(xì)胞進(jìn)行HER-2受體的免疫組織化學(xué)染色，由3名主治以上的病理醫(yī)師讀片確認(rèn)病例分組的準(zhǔn)確性，并且根據(jù)定位，確認(rèn)每個掃描細(xì)胞的HER-2受體著色分組無誤。

1.4.5 細(xì)胞膜表面參數(shù)定量分析 整理掃描范圍為1 μm區(qū)域的測量結(jié)果，利用AFM圖像分析系統(tǒng)對兩組細(xì)胞的細(xì)胞膜形態(tài)參數(shù)進(jìn)行定量測量。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞印片法獲取的細(xì)胞樣本染色結(jié)果 采用新鮮組織印片法獲取的乳腺癌細(xì)胞樣本經(jīng)1%的甲醛溶液固定后細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞膜、細(xì)胞核、核仁均清晰，利于AFM的觀察。印片法獲取的細(xì)胞分布均勻，重疊較少。在常規(guī)蘇木精-尹紅(HE)染色下，細(xì)胞質(zhì)紅染，細(xì)胞核、核仁著藍(lán)色，核仁位于細(xì)胞的中央或者偏于一側(cè)(圖1)。免疫組織化學(xué)一部法染色結(jié)果，HER-2陽性表達(dá)的病例有21例，陰性表達(dá)的病例有32例；其中，浸潤性導(dǎo)管癌(14例陽性；18例陰性)，黏液癌(0例陽性；2例陰性)，小葉原位癌(5例陽性；8例陰性)，其他類型(2例陽性；4例陰性)。

圖1 印片法獲取乳腺癌細(xì)胞病理圖(HE，×100)

2.2 膜表面重要參數(shù)測量結(jié)果

2.2.1 乳腺癌膜表面重要參數(shù)測量結(jié)果 兩組(HER-2表達(dá)陰性組和陽性組)乳腺癌細(xì)胞膜在4個膜表面參數(shù)(最大峰高度、平均粗糙度、表面積差值和平均凹陷度)的比較上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

2.2.2 不同組織學(xué)類型的乳腺癌細(xì)胞膜表面重要參數(shù)測量結(jié)果 不同組織學(xué)類型的乳腺癌細(xì)胞膜的表面重要參數(shù)因HER-2的表達(dá)不同而差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表1 不同HER-2表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞膜表面平均峰高度、粗糙度、表面積差值和凹陷度 (n=7950；nm；

2.2.3 AFM掃描細(xì)胞成像三維圖形 不同組織學(xué)類型、不同HER-2表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞在較大掃描范圍(40～30 μm)下呈現(xiàn)細(xì)胞的完整結(jié)構(gòu)，細(xì)胞形狀為球形/橄欖球形，而隨著掃描范圍的不斷縮小，細(xì)胞膜的表面凹凸不平，出現(xiàn)不同程度的隆起，而隆起的形態(tài)因HER-2的表達(dá)不同而出現(xiàn)差異，這種差異在不同組織學(xué)類型的乳腺癌細(xì)胞的規(guī)律相似，即：HER-2陰性表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞膜隆起較“尖銳”，隆起物高且偏細(xì)，每個單倍計(jì)數(shù)面積內(nèi)的隆起物數(shù)目較多；而HER-2陽性表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞膜隆起較“粗大”，隆起物低且偏粗，每個單位計(jì)數(shù)面積內(nèi)的隆起物數(shù)目明顯減少。

表2 不同組織學(xué)類型及不同HER-2表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞膜表面平均峰高度、粗糙度、表面積差值和凹陷度 (nm；

注：入組中黏液癌例數(shù)過少，尚不能進(jìn)行比較分析

3 討 論

隨著近些年乳腺癌發(fā)病率和死亡率的明顯增高，探討乳腺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找其早期精確診斷和預(yù)后判斷的敏感指標(biāo)，從而探尋治療的新靶點(diǎn)、新突破，成為了當(dāng)前乳腺癌研究的重點(diǎn)。1987年Slamon等[10]首先在乳腺癌細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)了HER-2。而后續(xù)的眾多研究都進(jìn)一步明確了其在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后和治療中的作用。

研究充分證實(shí)，HER-2能夠通過各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響細(xì)胞骨架的重建、細(xì)胞運(yùn)動、細(xì)胞間黏附以及蛋白酶表達(dá)和激活[11]。其過度表達(dá)能夠促進(jìn)乳腺癌腫瘤的發(fā)生和惡性轉(zhuǎn)化。體外研究證實(shí)，轉(zhuǎn)染HER-2基因的乳腺癌腫瘤細(xì)胞株DNA合成能力增強(qiáng)，細(xì)胞生長速度加快，侵襲性增強(qiáng)，并且可以增強(qiáng)裸鼠的成瘤性和腫瘤的轉(zhuǎn)移能力。眾多的研究進(jìn)一步表明，HER-2在判斷乳腺癌的預(yù)后包括病理學(xué)類型、TNM分期以及癌組織中ER、PR水平表達(dá)中可以作為獨(dú)立的指標(biāo)[12，13]。同時，HER-2的表達(dá)水平還影響臨床中對乳腺癌患者手術(shù)方式的選擇；指導(dǎo)治療方案的制定和預(yù)測治療，甚至可以作為腫瘤對內(nèi)分泌治療和化學(xué)藥物治療的預(yù)示指標(biāo)。例如，HER-2過度表達(dá)提示預(yù)后不良，TNM分期為Ⅰ期的患者可以行乳腺全切，相反則可以選擇保乳治療[14]。

HER-2在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展、治療和預(yù)后的過程中具有舉足輕重的地位。早期、精確、準(zhǔn)確的測定其表達(dá)的特點(diǎn)，有助于臨床早期進(jìn)行治療的選擇和不良預(yù)后的干預(yù)。HER-2作為細(xì)胞膜上的受體，直觀的觀察和測定會更有說服意義。而AFM的發(fā)現(xiàn)，為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)提供了可能。就針對乳腺癌的AFM研究，2009年P(guān)lodinec等[15]利用AFM觀察人乳腺癌細(xì)胞結(jié)合表皮生長因子抗體(HER-2)后細(xì)胞膜表面的變化，結(jié)合熒光成像發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞的細(xì)胞膜在粗糙程度等方面有明顯的變化并獲得了變化的立體結(jié)構(gòu)圖像。2012年，Jin等[16]利用AFM發(fā)現(xiàn)骨形成蛋白(BMP2)通過改變細(xì)胞的支架和降低細(xì)胞的黏附來促進(jìn)如下年息報的遷移和侵襲。而在國內(nèi)，陳勇和蔡繼業(yè)[17]也利用AFM觀察乳腺癌細(xì)胞外纖連蛋白原纖維空間分布和排列規(guī)律的形態(tài)學(xué)特征來探討乳腺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制。

在本研究中，借助AFM觀察細(xì)胞形態(tài)的優(yōu)勢，筆者發(fā)現(xiàn)，乳腺細(xì)胞在發(fā)生癌變后，細(xì)胞膜的形態(tài)特征會發(fā)生變化，在細(xì)胞膜形態(tài)參數(shù)的量值上具有明顯改變。乳腺癌細(xì)胞膜的表面均呈現(xiàn)為不同程度的隆起，而隆起的形狀則因HER-2的表達(dá)狀態(tài)不同而有明顯差異(P<0.05)：HER-2陰性表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞膜隆起較“尖銳”，隆起物高且偏細(xì)，隆起之間的間隔“溝壑”較深，每個單倍計(jì)數(shù)面積內(nèi)的隆起物數(shù)目較多；而HER-2陽性表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞膜隆起較“粗大”，隆起物低且偏粗，隆起之間的間隔“溝壑”較淺，每個單位計(jì)數(shù)面積內(nèi)的隆起物數(shù)目明顯減少。 而對于不同組織學(xué)類型(浸潤性導(dǎo)管癌、小葉原位癌、及其他類型的乳腺癌)的乳腺癌的細(xì)胞膜形態(tài)特征的變化趨勢與整體相一致(均P<0.05)。在本研究中，因收集病例中黏液癌的數(shù)量過少，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)不合理，結(jié)論尚不明確。

分析乳腺癌細(xì)胞膜形態(tài)的這種變化，是與其疾病的發(fā)生和進(jìn)展相一致的。HER-2陰性表達(dá)的乳腺癌患者體內(nèi)的基因尚未發(fā)生突變，其癌細(xì)胞膜表面的受體結(jié)合位點(diǎn)較多，在臨床中選擇基因靶向治療藥物的治療意義不大，相反，因?yàn)橛泄δ苁荏w位點(diǎn)的存在，選擇受體拮抗劑(內(nèi)分泌治療)的治療意義較大。HER-2陽性表達(dá)的乳腺癌患者體內(nèi)的基因發(fā)生了突變，其癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展軌跡改變，體現(xiàn)在癌細(xì)胞膜表面的受體結(jié)合位點(diǎn)減少，功能降低甚至喪失。對于此類患者，因基因改變的緣故，對中晚期患者而言，手術(shù)治療和內(nèi)分泌治療意義有限，而基因靶向治療的選擇就非常必要。

無論哪種類型癌癥的治療，時機(jī)的選擇非常重要，而最關(guān)鍵的則在于早期診斷和早期治療。盡管目前針對HER-2的檢測方式非常多，例如DNA水平上的PCR熒光原位雜交、顯色原位雜交和非熒光原位雜交等以及蛋白質(zhì)水平上的免疫組織化學(xué)檢測法和酶標(biāo)免疫法等，但是任何一種檢測方法均受到組織處理方法、固定時間、試劑等的影響，其結(jié)果判讀和解釋中存在較大的變異。因此實(shí)際操作中，HER-2的檢測結(jié)果敏感性和精確性都較低。相反，AFM值通過直接觀察乳腺癌細(xì)胞膜上的形態(tài)特征，組織來源于新鮮標(biāo)本，對于組織的處理和試劑的需求較少，獲得的結(jié)果是直觀的可用數(shù)據(jù)說明的三維立體圖像。結(jié)果真實(shí)、可靠、敏感是其區(qū)別于其他檢查方式的特點(diǎn)。除此之外，AFM的測定對組織體積的需求較低，穿刺組織、針吸細(xì)胞均可實(shí)現(xiàn)測定。因此可以提高早期對HER-2狀態(tài)的發(fā)現(xiàn)，結(jié)合后期其他技術(shù)方法的測定大大提高臨床的HER-2檢測準(zhǔn)確性和敏感性，為臨床的治療工作提高可靠的依據(jù)指導(dǎo)。

綜上所述，AFM的發(fā)明和應(yīng)用將在未來的醫(yī)學(xué)中具有很大的價值，尤其是現(xiàn)如今納米醫(yī)學(xué)、納米診斷和納米治療環(huán)境下對疾病早期診斷和微小診斷的需求中，AFM具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢。

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(2016-12-11收稿 2017-04-21修回)

(責(zé)任編輯 岳建華)

Surface morphology of breast cancer cells combined with HER-2 by AFM

YAO Wenlian and XU Xin.
Department of Pathology，General Hospital of Chinese People’s Armed Police Force, Beijing 100039 China

Objective To observe the morphological changes in the surface of breast cancer cell’s membrane with different expressions of human epidermal growth factor receptor-2 under the atomic force microscope(AFM)in order to provide a new method for improving the sensitivity and accuracy of HER-2 detection in breast cancer and stimulate new ideas for early diagnosis of tumor at the sub-cellular level.Methods Beast cancer cells of different histological types were divided into two groups based on their expression levels of human epidermal growth factor receptor-2: the positive group and negative group. The surface morphology of cells’ membrane was observed with atomic force microscopy respectively. Such characteristic morphological parameters as average roughness，mean peak-height，average maximum depth and surface area difference of these cells were quantitatively measured ,and the results were statistically analyzed.Results There was significant difference between the two groups in cellular morphology. The surface of positive cell membrane of human epidermal growth factor receptor-2(HER-2) was rough and uneven, and the tuberositas was high and thin, but the tuberositas was heavy and wide in the HER-2 negative group.There were more tuberosities in the positive group than in the negative group in each count area.The difference in morphological characteristics between the two groups was obvious in the average roughness[(21.87±2.46)/(32.65±1.03),P<0.000]，mean peak-height[(13.94±1.01)/(31.15±3.89),P<0.001]， average maximum depth[(11.09±6.36)/(33.58±3.15),P<0.001]and surface area[(6.27±2.03)/(19.65±1.13),P<0.001].Conclusions The surface structure of cell membrane varies with different functional states, which may give us an insight into the mechanism, development and early diagnosis of cancer. It could also provide a new method for the diagnosis of the positive rate of HER-2.

atomic force microscopy; breast cancer; HER-2; cell membrane; morphological characteristics

院級臨床類推廣應(yīng)用項(xiàng)目(WZ2014042)

姚文蓮，碩士研究生，醫(yī)師。

100039 北京，武警總醫(yī)院病理科

徐 薪，E-mail:xxblaeflower@163.com

R730.5