張麗香

Bacillus subtilis ZH168多酚氧化酶特性研究

張麗香

（北京市經(jīng)濟(jì)管理學(xué)校，北京100142）

從Bacillus subtilis ZH168發(fā)酵液中提取多酚氧化酶，通過分光光度計(jì)法對(duì)其pH值、溫度、底物、抑制劑及激活劑等特性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，鄰苯二酚做底物時(shí)，pH值為7時(shí)活性最大，多巴做底物時(shí)最適pH值為8；該酶最適溫度40℃，具有較好熱穩(wěn)定性；多酚氧化酶可催化不同酚類物質(zhì)，催化活性不同；SDS，Triton X-100和尿素對(duì)酶均具有激活作用；Cys，NaHSO3，EDTA，VC，苯甲酸和Gly對(duì)酶有抑制作用；金屬離子Cu2+可以顯著提高酶活，Al3+和Mn2+顯著抑制酶活。

黑色素；枯草芽孢桿菌；酪氨酸酶；多酚氧化酶；酶活性

0 引言

黑色素（Melanin）是一種在細(xì)菌、真菌、動(dòng)植物中均有分布的天然色素，其應(yīng)用前景廣闊，可用于研發(fā)防曬霜、染發(fā)劑、太陽傘、抗紫外眼鏡、生物殺蟲劑的保護(hù)劑等。酪氨酸酶（Tyosinaes）是微生物體內(nèi)產(chǎn)生的催化黑色素形成的最重要的多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）之一，多酚氧化酶活性控制成為研究的熱點(diǎn)問題[1]。已有報(bào)道枯草芽孢桿菌能產(chǎn)生催化黑色素形成的多酚氧化酶，且已經(jīng)被純化[2]，該酶是一種具有催化活性的蛋白質(zhì)，不同來源的酪氨酸酶其特性有較大差異[3]，其酶活性受底物、溫度、pH值等多種條件影響。試驗(yàn)對(duì)Bacillus subtilis ZH168所產(chǎn)胞外多酚氧化酶pH值、溫度、底物、激活劑及抑制劑等進(jìn)行較為系統(tǒng)研究。

1 材料和方法

1.1 材料

供試菌株：產(chǎn)黑色素菌株，B.subtilis ZH168[1]。

培養(yǎng)基：①種子培養(yǎng)基，5 g牛肉膏，10 g蛋白胨，10 g NaCl，pH值7，蒸餾水1 L。②產(chǎn)酶培養(yǎng)基，F(xiàn)d培養(yǎng)基；LB培養(yǎng)基，酵母浸膏1.5 g、胰蛋白胨1.5 g、NaCl 5 g、蒸餾水1 L；肉湯培養(yǎng)基，5 g牛肉膏，10 g蛋白胨，10 g NaCl，pH值7，蒸餾水1 L培養(yǎng)基121℃蒸汽滅菌20 min，L-Tyr 115℃。

試劑和儀器：L-Tyr，L-dopa（Sigma），其他供試生化試劑，除特別說明外，使用的培養(yǎng)基材料和化學(xué)試劑分別為生化試劑和分析純?cè)噭?，均購自北京化學(xué)試劑公司、北京欣經(jīng)科試劑有限公司和北京藍(lán)弋試劑有限公司。752型紫外/可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 B.subtilis ZH168多酚氧化酶（PPO）的發(fā)酵及提取

液體種子培養(yǎng)：在250 mL三角瓶中裝50 mL種子培養(yǎng)基，接種ZH168菌種，置于恒溫?fù)u床上，轉(zhuǎn)速為140 r/min，于37℃培養(yǎng)8～12 h，至波長630 nm下OD值為0.800時(shí)接種入發(fā)酵培養(yǎng)基。

酶發(fā)酵：在50 mL/300 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，按4%接種量接種種子，控制培養(yǎng)溫度37℃，轉(zhuǎn)速140 r/min，發(fā)酵24 h后，以轉(zhuǎn)速9 000 r/min離心10 min，除去大部分菌體，收集發(fā)酵液上清液。將收集到的粗蛋白液在冰浴中用硫酸銨進(jìn)行沉淀，使硫酸銨飽和度為75%，待硫酸銨完全溶解后，將容器放至4℃冰箱中靜置過夜。取出后離心，以10 000×g，4℃條件下離心20 min，收集沉淀，20 mmol/L磷酸緩沖液溶解后，裝入8 000 Da透析袋內(nèi)，透析除鹽后進(jìn)行冷凍干燥濃縮蛋白，即得粗酶。稱取適量粗酶，溶于pH值為7的磷酸緩沖液，4℃冰箱保藏，為供試粗酶液。

1.2.2 B.subtilis ZH168 PPO活性測(cè)定[4-7]

多酚氧化酶（PPO）活性測(cè)定：①鄰苯二酚底物：參照Zauberman方法，稍加改進(jìn)。在3 mL的反應(yīng)體系中，加1.8 mL 0.1 mol/L pH值7磷酸緩沖液，1 mL 0.1 mol/L鄰苯二酚、0.2 mL酶液，從酶液加入后15 s開始記錄每30 s反應(yīng)體系于波長420 nm處的吸光度，連續(xù)測(cè)定5 min。以每1 h吸光度變化0.01為1個(gè)酶活力單位（U）。酶活性表示為U/（mL·min），重復(fù)3次。②多巴底物：反應(yīng)體系同上，底物換成1 mmol/L多巴，于波長475 nm處測(cè)定吸光度變化，多巴儲(chǔ)備液用去氧的二次蒸餾水配制，在低于20℃的室溫下可存放約1周。③3,5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛或丁香醛（Syringaldazine）作底物。

1.2.3 B.subtilis ZH168菌PPO的底物專一性

按照上述酶活性的體系更換不同底物溶液測(cè)定PPO的活性。用于測(cè)定的底物為多巴、鄰苯二酚，焦棓酸，間苯二酚，間苯三酚，對(duì)苯二酚，愈創(chuàng)木酚和L-酪氨酸。以相對(duì)酶活性表示，最高活性為100，其他與最高活性相比來表示，重復(fù)3次。

1.2.4 pH值對(duì)B.subtilis ZH168菌PPO活性的影響

將醋酸緩沖液、磷酸緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液分別配置成1.0 mol/L pH值3～5，6～8，9～12的緩沖液。在體積為3 mL的測(cè)定體系中，加入1 mL 0.1 mol鄰苯二酚，1.8 mL不同pH值的緩沖液，0.2 mL酶液。在分光光度計(jì)上于波長420 nm處測(cè)定吸光度。以相對(duì)酶活性表示，最高活性100為基準(zhǔn)，其他與最高酶活性相對(duì)值來表示，重復(fù)3次。

1.2.5 溫度對(duì)B.subtilis ZH168菌PPO活性及穩(wěn)定性的影響[8-10]

溫度對(duì)PPO活性的影響：將離心上清液各取1 mL到小離心管中，分別放在20，30，40，50，60，70，80，90，100℃下水浴加熱10 min后，然后于10 000×g下離心10 min，收集上清液，按照上述酶活性的體系測(cè)定PPO活性。以相對(duì)酶活性表示，最高活性100為基準(zhǔn)，其他與最高酶活性相對(duì)值來表示，重復(fù)3次。

PPO熱穩(wěn)定性：將裝有1 mL酶液的小離心管分別放在50，60，70，80℃水浴加熱5，10，15，20，25，30 min，迅速冰浴冷卻，然后于10 000×g下離心10 min，收集上清液，按照酶活性的體系測(cè)定PPO的活性。以相對(duì)酶活性表示，最高活性100為基準(zhǔn)，其他與最高酶活性相對(duì)值來表示，重復(fù)3次。

1.2.6 抑制劑及激活劑對(duì)B.subtilis ZH168菌PPO的影響

按照上述的酶活體系測(cè)定產(chǎn)PPO的活性，加入不同濃度的抑制劑和激活劑，相應(yīng)減少緩沖液的加入量。試驗(yàn)所用的激活劑為SDS，曲拉通和尿素，抑制劑為cys，EDTA，抗壞血酸，苯甲酸和亞硫酸鈉，以相對(duì)酶活表示，不加抑制劑和激活劑為100%，其他與之的相對(duì)值來表示，重復(fù)3次。

1.2.7 金屬離子對(duì)B.subtilis ZH168菌PPO的影響

將一系列濃度為0.005，0.050，0.500 mmol/L的金屬離子（Cu2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Al3+）加入到PPO酶的反應(yīng)液中，研究金屬離子對(duì)酶活的影響。

1.3 結(jié)果與分析

1.3.1 B.subtilis ZH168菌催化黑色素酶反應(yīng)的時(shí)間掃描光譜

從該菌發(fā)酵黑色素的優(yōu)化Fd培養(yǎng)基中必需添加L-Tyr作底物才能形成黑色素，可見該菌能產(chǎn)生催化酪氨酸酶，而且發(fā)酵上清提取的粗酶也能催化多巴和鄰苯二酚的氧化，但不能催化漆酶的底物取代酚，可見該菌能產(chǎn)生的一種胞外多酚氧化酶，即酪氨酸酶。

酶催化底物時(shí)間掃描光譜見圖1。

如圖1（a），酶催化鄰苯二酚的時(shí)間掃描譜，圖1（b），是該酶催化多巴氧化的時(shí)間掃描譜，2種底物的酶催化反應(yīng)時(shí)間在前5 min，反應(yīng)呈直線，所以測(cè)定酶活的反應(yīng)時(shí)間為5 min。

1.3.2 B.subtilis ZH168菌PPO的底物專一性

PPO催化不同底能力見圖2。

由圖2可知，以多巴和鄰苯二酚為底物時(shí)，該菌所產(chǎn)的PPO活性最強(qiáng)。底物專一性由高至低的趨勢(shì)依次為多巴＞鄰苯二酚＞焦棓酸＞間苯二酚＞間苯三酚＞對(duì)苯二酚，愈創(chuàng)苯酚和酪氨酸為底物時(shí)，PPO的活力幾乎為零。最適底物是多巴，鄰苯二酚僅次之。分析試驗(yàn)中對(duì)于酪氨酸的催化活力為零，但在發(fā)酵產(chǎn)黑色素過程中，卻是以酪氨酸為底物獲得的黑色素，所以可以確定該菌所產(chǎn)的PPO肯定能催化酪氨酸，但對(duì)酪氨酸的催化存在一個(gè)較長的遲滯期，而此次試驗(yàn)測(cè)定的是相同的短時(shí)間酶對(duì)不同底物的催化能力，所以對(duì)酪氨酸催化能力未表現(xiàn)出來。

圖1 酶催化底物時(shí)間掃描光譜

圖2 PPO催化不同底能力

1.3.3 pH值對(duì)B.subtilis ZH168菌PPO活性的影響pH值對(duì)PPO活性的影響見圖3。

圖3 pH值對(duì)PPO活性的影響

分別以鄰苯二酚和多巴為底物，在不同pH值的緩沖液中測(cè)定ZH168所產(chǎn)PPO的活性，2種底物的最適pH值，基本趨勢(shì)相同，鄰苯二酚做底物時(shí)，pH值為7時(shí)活性最大，在pH值6～8時(shí)有較高的活性，多巴做底物時(shí)的最適pH值為8，但偏堿的環(huán)境更利于對(duì)多巴的氧化催化形成黑色素。

1.3.4 溫度對(duì)B.subtilis ZH168菌PPO活性的影響及其熱穩(wěn)定性

測(cè)定多巴為底物，菌株ZH161產(chǎn)生的PPO在不同的溫度下的酶活力，可見此菌的PPO最適溫度為50℃。

PPO最適溫度見圖4。

圖4 PPO最適溫度

以多巴為底物，在pH值8的條件下，將酶液分別于30～100℃，間隔10℃，保溫酶液10 min后，立即進(jìn)行冰浴冷卻，然后于室溫測(cè)定多酚氧化酶活性，算出相對(duì)活性。

溫度對(duì)B.subtilis ZH168菌PPO活性的影響見圖5。

圖5 溫度對(duì)B.subtilis ZH168菌PPO活性的影響

由圖5可知，溫度在30～60℃時(shí)酶活性保持較高水平，經(jīng)10 min的40℃保溫后，酶活性有所提高，可見該酶的最適溫度在40℃左右，且該酶比較耐高溫。60℃以后酶的活性隨著溫度的升高而降低。70～80℃時(shí)，酶活性急劇下降，到70℃時(shí)，酶活性僅為最大活性的31%，80℃時(shí)，酶活性僅為最大活性的5.5%，90℃及以上高溫時(shí)，酶活性基本消失。

以多巴為底物，在pH值8的條件下，分別于40，50，60，70℃加熱酶液5～30 min后，立即進(jìn)行冰浴冷卻，室溫測(cè)定PPO活性。

PPO熱穩(wěn)定性見圖6。

40～70℃范圍內(nèi)，PPO活性隨時(shí)間的延長和溫度的升高而降低。其中PPO在40～60℃時(shí)具有較好的熱穩(wěn)定性，40℃保溫15 min，酶活基本不變，50，60℃下加熱30 min其酶活性仍分別保持37%和22%；而溫度再升高酶活性則迅速失活，如70℃加熱10 min，其活性就迅速下降到了最高活性31%。

圖6 PPO熱穩(wěn)定性

1.3.5 激活劑對(duì)B.subtilis ZH168菌PPO的影響

不同激活劑對(duì)產(chǎn)黑色素酶的激活作用見圖7。

圖7 不同激活劑對(duì)產(chǎn)黑色素酶的激活作用

由圖7可知，SDS和Triton X-100作為該酶的激活劑，濃度與激活能力呈負(fù)相關(guān)，低濃度激活效果明顯，1mmol/L的SDS可以將酶的活性提高100%，0.1%Triton X-100能提高55%的酶活力，與之相反，另一種該酶激活劑尿素對(duì)酶的激活作用與濃度呈正相關(guān)，濃度增大激活能力也升高。

1.3.6 抑制劑對(duì)B.subtilis ZH168菌PPO的影響

研究半胱氨酸、亞硫酸鈉、EDTA、抗壞血酸、苯甲酸和甘氨酸6種抑制劑對(duì)PPO酶得抑制作用。

抑制劑對(duì)PPO活性影響見圖8。

圖8 抑制劑對(duì)PPO活性影響

其中半胱氨酸的抑制效果最為明顯，25 mmol/L的半胱氨酸就基本上可以抑制PPO的83%的酶活性。此外，抗壞血酸和亞硫酸鈉對(duì)此酶的活性抑制效果也比較明顯，苯甲酸和EDTA的抑制效果相對(duì)較差，2 mmol/L的苯甲酸抑制率約35%的酶活性，而2 mmol/L的EDTA僅能抑制20%的酶活性，整體趨勢(shì)看，在一定的濃度范圍內(nèi)，苯甲酸、EDTA、甘氨酸對(duì)PPO抑制能力隨著濃度增大而提高。

1.3.7 金屬離子對(duì)B.subtilis ZH168菌PPO的影響

以多巴為底物，測(cè)定不同金屬離子對(duì)枯草芽孢桿菌ZH161所產(chǎn)PPO酶的影響。

金屬離子對(duì)PPO酶活的影響見圖9。

Cu2+可以明顯提高酶的活力，0.5 mmol/L時(shí)PPO酶活力提高了127%，0.5 mmol/L的Mg2+對(duì)酶活稍有提高，低濃度的Ca2+也能微弱提高PPO酶的活力，但這2種離子對(duì)酶活的提高均不太明顯。3個(gè)濃度的Al3+和Mn2+都顯示了抑制PPO酶對(duì)多巴的催化作用，Mn2+隨著濃度的升高，抑制作用有降低的趨勢(shì)。

2 討論及結(jié)論

圖9 金屬離子對(duì)PPO酶活的影響

菌株B.subtilis ZH168能分泌胞外多酚氧化酶，能夠催化酪氨酸氧化生成黑色素，具酪氨酸酶活性，沒發(fā)現(xiàn)其具有漆酶活性，該菌的PPO具有較好熱穩(wěn)定性，最適反應(yīng)溫度為40℃。據(jù)報(bào)道蘇云金芽抱桿菌酪氨酸酶熱穩(wěn)定性超強(qiáng)，在100℃，10 min仍有一半的酶活性，pH值會(huì)影響酶結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，過酸、過堿都會(huì)影響酶蛋白的構(gòu)象，甚至使酶變性而失活[3]。pH值不但會(huì)影響酶分子的解離狀態(tài)，也會(huì)影響底物分子的解離狀態(tài)，從而影響酶與底物的結(jié)合，影響酶活性，鄰苯二酚為底物時(shí)該菌PPO的最適pH值為7，多巴作底物的最適值pH值為8，SDS，Triton X-100和尿素對(duì)酶均具有激活作用，半胱氨酸，亞硫酸鈉、EDTA、抗壞血酸、苯甲酸和甘氨酸抑制劑對(duì)酶有抑制作用，其中半胱氨酸抑制作用最強(qiáng)。與其不同的是Triton X-100不是蘇云金芽抱桿菌的酪氨酸酶的激活劑[3]。以潛伏態(tài)方式存在的PPO能被多種生化物質(zhì)激活，如去污劑、脂肪酸、胰蛋白酶等，一些研究人員發(fā)現(xiàn)低濃度的SDS也可以激活酶的活性。這可能是因?yàn)槊冈诩?xì)胞內(nèi)以酶原的形式存在，或者是因?yàn)槿コ薖PO結(jié)合的抑制子，或者是因?yàn)闃?gòu)象的改變。金屬離子Cu2+可以明顯提高酶的活力，以多巴為底物時(shí)，0.5 mmol時(shí)，PPO酶活力提高了127%，Mg2+、Ca2+有微弱的激活作用，3個(gè)濃度的Al3+和Mn2+都顯示了抑制PPO酶對(duì)多巴的催化作用，且Mn2+隨著濃度的升高，抑制作用有降低的趨勢(shì)，可能高濃度的Mn2+能促進(jìn)多巴的催化，據(jù)有關(guān)報(bào)道在pH值5.5的弱酸性緩沖溶液中，錳和鋁離子對(duì)多巴氧化生成黑色素的過程具有協(xié)同催化作用。鋁不是過渡金屬，本身不能啟動(dòng)氧化作用。錳離子可啟動(dòng)多巴的氧化，生成中間體多巴色素。鋁離子可催化多巴色素轉(zhuǎn)化為5,6-二羥基吲哚的反應(yīng)，它是黑色素形成過程中很重要的一步反應(yīng)，其產(chǎn)物可進(jìn)一步氧化并聚合生成黑色素。因此，錳和鋁離子的協(xié)同作用促進(jìn)了多巴氧化生成黑色素，增加了體系的氧化壓力。Cu2+激活作用是由于PPO是含銅的酶，外加的銅離子對(duì)其有一定的激活作用。

[1]張麗香，劉強(qiáng)，孫忠偉，等.一株產(chǎn)黑色素芽孢桿菌的分離與鑒定[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，31（2）：63-67.

[2]張麗香.Bacillus subtilis ZH168多酚氧化酶分離純化研究[J].食品科技，2015，40（11）：19-23.

[3]劉楠.蘇云金芽抱桿菌酪氨酸酶純化、性質(zhì)研究及其mel基因的克隆和表達(dá)[D].武漢：武漢大學(xué)，2004.

[4]王斐，李俊霞，張麗香，等．產(chǎn)黑色素菌株發(fā)酵條件的研究[J].食品工業(yè)與技，2008（5）：19-23.

[5]狄俊偉，畢樹平.多巴氧化生成黑色素過程中錳和鋁協(xié)同作用的紫外-可見光譜研究[J].光譜學(xué)與光譜分析，2005（11）：83-85.

[6]丁大鵬，馬文麗，鄭文嶺.酪氨酸酶抑制劑的研究進(jìn)展[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2005，21（12）：1 364-1 367.

[7]陳麗鳳，吳可克，王舫，等.無機(jī)陽離子對(duì)酪氨酸酶活性的上調(diào)作用[J].大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，19（3）：175-177.

[8]Ruan L F，Yu Z N，F(xiàn)ang B，et al.Melanin pigment formation and increased UV resistance in bacillus thuringiensis following high temperature induction[J].System Appl Microbiol，2004，27：286-289.

[9]Yuzo F，Masahiro A，Masakatsu I，et al.Fungal melanin inhibitor and related compounds from Penicillium decumbens[J].Phytochemistry，2002，60：703-708.

[10]Metal L B.Specificities of the tyrosinase-related proteins[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，1998（3）：579-585.

[11]Liu N，Zhang T，Wang Y J，et al.A heat inducible tyrosinase with distinct properties from Bacillus thuringiensis[J]. Letters in Applied Microbiology，2004，39：407-412.

[12]Junwei D，Shuping B.Aluminum ions accelerated the oxidative stress of coppermediated melanin formation[J]. Spectrochimica Acta Part A，2003，59：3 075-3 083.◇

Study on Characteristics of Polyphenol Oxidase from Bacillus subtilis ZH168

ZHANG Lixiang
（Beijing Economic Management School，Beijing 100142，China）

Polyphenol oxidase is extracted from fermented liquid of Bacillus subtilis ZH168，and the effects of pH，temperature，substrate，activator，and inhibitor on its properties are explored by spectrophotometry.When catechol is used as the substrate，the enzyme showed high activity at pH 7；when levodopa is used as the substrate，the optimal pH is 8.The enzyme shows good thermal stability and the optimum temperature is 40℃.The enzyme has low substrate specialty，it is activated by SDS，Triton X-100，urea，and inhibited by Cys，NaHSO3，EDTA，VC，benzoic acid and Gly.In addition，the enzyme activity is significantly enhanced by Cu2+but inhibited strongly by Al3+and Mn2+.

melanin melanin；Bacillus subtilis；tyrosinase；PPO；enzymatic activity

S626

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.07.004

1671-9646（2017）07a-0015-02

2017-03-01

張麗香（1976—），女，博士，講師，研究方向?yàn)槭称肺⑸镔Y源開發(fā)利用及微生物檢測(cè)。