鄒 斌，周學(xué)亮#，詹宇亮，陳紫晴，賴松青，吳 霞，劉季春△

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院:1.心胸外科;2.心血管內(nèi)科，南昌 330006)

慢病毒載體介導(dǎo)HIF1α穩(wěn)定表達(dá)A549細(xì)胞系構(gòu)建*

鄒 斌1，周學(xué)亮1#，詹宇亮2，陳紫晴1，賴松青1，吳 霞1，劉季春1△

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院:1.心胸外科;2.心血管內(nèi)科，南昌 330006)

目的 利用慢病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)HIF1α的A549細(xì)胞系。方法 以NCBI人HIF1α基因編碼序列為模板，設(shè)計(jì)并合成引物，PCR法擴(kuò)增HIF1α。酶切回收的HIF1α片段與制備的慢病毒載體HBLV-RFP-Puro重組反應(yīng)。PCR和基因測序鑒定重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。包裝好的病毒經(jīng)過濾、濃縮后，利用稀釋計(jì)數(shù)法測定病毒滴度。制備好的慢病毒感染A549細(xì)胞，采用藥物篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。熒光顯微鏡及Western blot檢測觀察轉(zhuǎn)染及篩選效果。結(jié)果 PCR擴(kuò)增HIF1α片段經(jīng)鑒定成功，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、基因測序鑒定構(gòu)建成功。成功包裝獲得高滴度LV-HIF1α。LV-HIF1α感染A549細(xì)胞后經(jīng)藥物篩選，熒光顯微鏡下細(xì)胞帶有紅色熒光，Western blot結(jié)果顯示LV-HIF1α組HIF1α的表達(dá)水平明顯高于對照組。結(jié)論 慢病毒載體介導(dǎo)HIF1α穩(wěn)定表達(dá)的A549細(xì)胞系構(gòu)建成功。

HIF1α；慢病毒載體；穩(wěn)定表達(dá)；A549

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，其導(dǎo)致的死亡人數(shù)居各類惡性腫瘤之首[1]。在過去的研究中，盡管在腫瘤生物學(xué)、臨床研究等方面取得了不斷的進(jìn)展，但肺癌的5年生存率僅提高了5%[2]。基于分子分型的個體化治療及靶向治療是肺癌治療的發(fā)展方向之一。因此，肺癌的生物學(xué)研究聚焦于尋找關(guān)鍵驅(qū)動基因或信號通路。由于腫瘤缺氧激活的缺氧反應(yīng)信號通路對腫瘤生物學(xué)行為(血管生成、侵襲、轉(zhuǎn)移等)產(chǎn)生重要影響[3-4]。HIF1α是缺氧反應(yīng)信號通路關(guān)鍵調(diào)控因子。臨床研究發(fā)現(xiàn)，肺癌組織HIF1α的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期、癌細(xì)胞分化等相關(guān)，腫瘤組織HIF1α陽性的肺癌患者5年生存率和總生存率明顯低于陰性患者，HIF1α可能是具有潛質(zhì)的預(yù)后生物標(biāo)志物[5]。本研究基于慢病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建HIF1α慢病毒表達(dá)載體(LV-HIF1α)，篩選穩(wěn)定表達(dá)HIF1α的A549細(xì)胞系，為深入探討HIF1α在肺癌中的生物學(xué)作用建立基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 慢病毒包裝系統(tǒng)(HBLV-RFP-Puro、pSPAX2、pMD2G)購于漢恒生物科技有限公司；A549細(xì)胞、293T細(xì)胞購于ATCC。大腸桿菌菌株DH5α購于Invitrogen公司；限制性內(nèi)切酶購于Fermentas公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購于Axygen公司；一步式克隆試劑盒購于南京諾唯贊生物科技有限公司；質(zhì)粒DNA大抽提取試劑盒購于Qiagen公司；LipofiterTM購于漢恒生物科技有限公司；嘌呤霉素(Puromycin)購于Sigma公司；mouse monoclonal to HIF1α Antibody購于Stan Cruz biotechnology公司；β-Actin Mouse Monoclonal Antibody 購于Cell signaling technology公司；HRP laaffinipure goat anti-Mouse IgG購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。PCR引物合成和目的基因測序由漢恒生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 重組慢病毒質(zhì)粒pHBLV- HIF1α- RFP-Puro構(gòu)建 根據(jù)NCBI人HIF1α基因編碼序列設(shè)計(jì)引物，正向序列：5′-GGA TCT ATT TCC GGT GAA TTC GCC ACC ATG GAG GGC GCC GGC GG-3′，反向序列：5′-GGA TCC GCG GCC GCT TCT AGA GTT AAC TTG ATC CAA AG-3′，下劃線序列為酶切位點(diǎn)。按試劑操作說明進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，50 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為:95℃，預(yù)變性5 min;94 ℃，20 s;55 ℃，20 s;72 ℃，2.5 min;25個循環(huán);72 ℃，延伸10 min。1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。EcoRⅠ、XbaⅠ雙酶切后回收目的片段。載體HBLV-RFP-Puro經(jīng)雙酶切后回收，處理好的目的片段和載體進(jìn)行重組反應(yīng)(37 ℃ 30 min)，后轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)胞，接種于含氨芐青霉素(100 μg/mL)的培養(yǎng)皿過夜，挑選單克隆菌落，搖菌后用菌液進(jìn)行PCR鑒定，將陽性克隆菌液測序。軟件對測序的克隆序列和基因庫中的序列比對分析。

1.2.2 慢病毒包裝及滴度測定 Qiagen試劑盒大量抽提制備好的慢病毒重組質(zhì)粒及其輔助包裝載體質(zhì)粒，按LipofiterTM轉(zhuǎn)染試劑說明，將重組慢病毒質(zhì)粒pHBLV-HIF1α-RFP-Puro和輔助包裝載體pSPAX2、pMD2G共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6 h更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h和72 h后收集富含慢病毒顆粒的上清液，0.45 μm濾器過濾后離心濃縮病毒。稀釋計(jì)數(shù)法測定LV-HIF1α滴度。病毒做3倍梯度稀釋(連續(xù)6個稀釋度)，準(zhǔn)備6個1.5 mL EP管，第1管加入105 μL培養(yǎng)液及15 μL病毒原液，混勻后從第1個管吸取40 μL加入第2個管(含有80 μL培養(yǎng)液)，依次類推。稀釋好的病毒液分別加入293T細(xì)胞，24 h后更換為含Puromycin(2.5 μg/mL)的培養(yǎng)液。因該慢病毒帶有Puromycin抗性，通過感染后活細(xì)胞數(shù)目來判定滴度。顯微鏡下活細(xì)胞在10%～30%的孔計(jì)算病毒滴度。滴度(TU/mL)=細(xì)胞數(shù)×百分比×1(MOI)×病毒稀釋倍數(shù)×103。

1.2.3 LV-HIF1α介導(dǎo)的A549穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系篩選 將狀態(tài)良好的A549細(xì)胞接種于6孔板(5×105/孔)，分為LV-HIF1α組和慢病毒空載組(LV-RFP-Puro)并做好標(biāo)記。培養(yǎng) 24 h 后至融合度達(dá)70%～80%，估計(jì)細(xì)胞數(shù)目，更換含慢病毒的培養(yǎng)液1 mL(含5 μg/mL Polybrene)，MOI取20，4 h補(bǔ)充另半量培養(yǎng)液1 mL(含5 μg/mL Polybrene),感染24 h后換完全培養(yǎng)基。利用該病毒攜帶有Puromycin抗性基因，采用藥物篩選法篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。48 h后，更換含Puromycin(2 μg/mL)的完全培養(yǎng)液進(jìn)行篩選。由于該病毒同時帶有RFP基因，成功轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞將存活并表達(dá)紅色熒光蛋白，在熒光顯微鏡觀察到紅色熒光。每隔2～3天換液、傳代，反復(fù)篩選2周左右，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞逐漸被篩除，帶有紅色熒光的細(xì)胞即為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。在此基礎(chǔ)上，Western blot方法檢測目的基因的表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)染、篩選是否成功。穩(wěn)定表達(dá)目的基因的細(xì)胞系命名為A549-HIF1α，對照組命名為A549-RFP-Puro，待穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長穩(wěn)定后凍存細(xì)胞以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需。

2 結(jié) 果

2.1 重組慢病毒質(zhì)粒pHBLV-HIF1α-RFP-Puro成功構(gòu)建 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物(圖1)，大小與預(yù)期一致。擴(kuò)增的目的基因片段及慢病毒載體經(jīng)酶切回收，在適當(dāng)?shù)臈l件下重組反應(yīng)，構(gòu)建重組慢病毒質(zhì)粒pHBLV-HIF1α-RFP-Puro。重組慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)胞，挑選單克隆菌落PCR鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳可見與預(yù)計(jì)相符的特異性條帶(圖2)，由于PCR鑒定用的是載體上的一段通用引物，故比理論大小大400 bp左右。挑選陽性克隆菌液測序，測序的克隆序列和NCBI 數(shù)據(jù)庫中基因序列比對分析，核苷酸序列完全一致。

Lane1:HIF1α PCR產(chǎn)物；Lane2:DNA Marker

圖1 目的基因HIF1α PCR產(chǎn)物鑒定

Lane1:DNA Marker；Lane2～12:單克隆PCR產(chǎn)物

圖2 pHBLV-HIF1α-RFP-Puro單克隆PCR產(chǎn)物鑒定

2.2 慢病毒包裝、滴度測定 采用三質(zhì)粒系統(tǒng)(pHBLV-HIF1α-RFP-Puro、pSPAX2和pMD2G)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝病毒，高效轉(zhuǎn)染試劑盒提高轉(zhuǎn)錄效率。經(jīng)過濾、濃縮后采用稀釋計(jì)數(shù)法測定滴度。病毒做3倍梯度稀釋，連續(xù)6個濃度，分別感染293T細(xì)胞，后加入Puromycin篩除未感染慢病毒的細(xì)胞，通過感染后活細(xì)胞數(shù)目來判定病毒滴度。如果某稀釋度中有10個活細(xì)胞，那么說明該稀釋度中至少含有10個病毒顆粒。顯微鏡下觀察加入不同量的慢病毒存活細(xì)胞數(shù)目(圖3)。LV-HIF1α組0.033 μL病毒孔細(xì)胞數(shù)目估計(jì)為4×104×10%左右，病毒稀釋了30倍。滴度(TU/mL)=細(xì)胞數(shù)×10%×1(MOI)×病毒稀釋倍數(shù)×103=1×108TU/mL。同樣方法計(jì)算對照組LV-RFP-Puro病毒滴度。

2.3 LV-HIF1α介導(dǎo)的A549穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系成功構(gòu)建 LV-HIF1α及LV-RFP-Puro分別感染A549細(xì)胞，利用載體同時帶有RFP報告基因及Puromycin抗性基因的特點(diǎn)，采用Puromycin進(jìn)行反復(fù)篩選。熒光顯微鏡觀察，實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞均帶有紅色熒光(圖4)，獲得目的基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系A(chǔ)549-HIF1α和陽性對照穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系A(chǔ)549-RFP-Puro。提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測兩組細(xì)胞HIF1α的表達(dá)，結(jié)果顯示LV-HIF1α組HIF1α的表達(dá)明顯高于LV-RFP-Puro組(圖5)，熒光顯微鏡及Western blot結(jié)果共同證實(shí)LV-HIF1α介導(dǎo)的A549細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系構(gòu)建成功。

圖3 慢病毒載體滴度測定

A、B:熒光顯微鏡下觀察到紅色熒光；C、D：普通觀察結(jié)果

圖4 熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染及篩選效果

圖5 Western blot檢測HIF1α的表達(dá)

3 討 論

腫瘤細(xì)胞快速分裂、增殖而腫瘤內(nèi)異常血管形成，這將導(dǎo)致腫瘤組織氧供需失衡。包括肺癌在內(nèi)的許多實(shí)體腫瘤普遍存在缺氧的現(xiàn)象[6-8]。缺氧的腫瘤細(xì)胞將主要通過HIFs激活一系列的轉(zhuǎn)錄程序，如血管內(nèi)皮生長因子、糖酵解酶、轉(zhuǎn)化生長因子等，改變代謝，促進(jìn)血管生成、侵襲、轉(zhuǎn)移，并且影響腫瘤細(xì)胞對放化療的敏感性[3]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，HIF1α與肺癌患者臨床病理學(xué)和預(yù)后相關(guān)，HIF1α可能是具有潛質(zhì)的預(yù)后生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)[5-9]。近來研究發(fā)現(xiàn)，缺氧和HIFs可誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞獲得腫瘤干細(xì)胞特性[10-12]。然而，作為缺氧反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子，HIF1α在腫瘤干細(xì)胞中的作用及機(jī)制目前還不明了。因此本研究擬構(gòu)建慢病毒載體介導(dǎo)HIF1α穩(wěn)定表達(dá)的A549細(xì)胞系，為進(jìn)一步研究HIF1α在肺癌干細(xì)胞中的作用及機(jī)制建立前期基礎(chǔ)。

體外細(xì)胞缺氧模型通常采用缺氧或缺氧模擬物如二氯化鈷來建立，雖然可以激活HIF1α信號通路，但其同時也激活了HIF2α，因此特異性較差。而且該缺氧細(xì)胞模型不適合用于體內(nèi)腫瘤移植實(shí)驗(yàn)。慢病毒介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)移具有高效、穩(wěn)定、精準(zhǔn)等特點(diǎn)，是目前細(xì)胞分子生物學(xué)研究常用的工具[13-14]。慢病毒可以將其攜帶的目的基因整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中，目的基因在細(xì)胞內(nèi)長期穩(wěn)定表達(dá)。慢病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)是構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)或干擾細(xì)胞系的主要方式[15]。本研究涉及體內(nèi)腫瘤移植實(shí)驗(yàn)，因此選擇慢病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建HIF1α過表達(dá)載體，進(jìn)一步篩選其介導(dǎo)的HIF1α穩(wěn)定表達(dá)的A549細(xì)胞系。

該病毒同時攜帶有Puromycin抗性基因和RFP基因，利用該特點(diǎn)，采用藥物篩選法篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。未成功轉(zhuǎn)染或非穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞對藥物敏感，經(jīng)反復(fù)藥物篩選將逐漸篩除。成功轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞在熒光顯微鏡下可以觀察到紅色熒光。經(jīng)反復(fù)篩選，本研究觀察到細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，70%～80%的細(xì)胞可見紅色熒光，剩余細(xì)胞未見熒光或熒光較弱。這可能有以下2種情況：(1)本研究所選的篩選濃度可能非最佳篩選濃度，未成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞產(chǎn)生了耐藥；(2)成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞活力受到影響，Puromycin抗性基因和RFP基因表達(dá)較弱，但對該濃度的Puromycin抵抗。筆者已采用較低病毒濃度轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以盡量減小病毒對細(xì)胞活力的影響。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)前有必要對細(xì)胞活力進(jìn)行檢測，通過熒光強(qiáng)度能間接反映目的基因的表達(dá)情況。Western blot結(jié)果顯示LV-HIF1α組HIF1α表達(dá)明顯高于LV-RFP-Puro組，進(jìn)一步證實(shí)LV-HIF1α介導(dǎo)的A549穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系構(gòu)建成功。

[1]Torre LA,Bray F,Siegel RL,et al.Global cancer statistics,2012[J].CA Cancer J Clin,2015,65(2):87-108.

[2]Johnson DH,Schiller JH,Bunn PA.Recent clinical advances in lung cancer management[J].J Clin Oncol,2014,32(10):973-982.

[3]Wigerup C,Pühlman S,Bexell D.Therapeutic targeting of hypoxia and hypoxia-inducible factors in cancer[J].Pharmacol Ther,2016,164(2):152-169.

[4]Keith B,Simon MC.Hypoxia-inducible factors,stem cells,and cancer[J].Cell,2007,129(3):465-472.

[5]Yang SL,Ren QG,Wen L,et al.Clinicopathological and prognostic significance of hypoxia-inducible factor-1 alpha in lung cancer:a systematic review with meta-analysis[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2016,36(3):321-327.

[6]Le QT,Chen E,Salim A,et al.An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers[J].Clin Cancer Res,2006,12(5):1507-1514.

[7]TrinkausME,BlumR,RischinD,etal.Imaging of hypoxia with 18F-FAZA PET in patients with locally advanced non-small cell lung cancer treated with definitive chemoradiotherapy[J].J Med Imaging Radiat Oncol,2013,57(4):475-481.

[8]Osinsky S,Zavelevich M,Vaupel P.Tumor hypoxia and malignant progression[J].Exp Oncol,2009,31(2):80-86.

[9]Ren W,Mi D,Yang K,et al.The expression of hypoxia-inducible factor-1α and its clinical significance in lung cancer:a systematic review and meta-analysis[J].Swiss Med Wkly,2013,143(5):w13855.

[10]Mathieu J,Zhang Z,Zhou W,et al.HIF induces human embryonic stem cell markers in cancer cells[J].Cancer Res,2011,71(13):4640-4652.

[11]Murakami A,Takahashi F,Nurwidya F,et al.Hypoxia increases gefitinib-resistant lung cancer stem cells through the activation of insulin-like growth factor 1 receptor[J].PLoS One,2014,9(1):e86459.

[12]Zhao M,Zhang Y,Zhang H,et al.Hypoxia-induced cell stemness leads to drug resistance and poor prognosis in lung adenocarcinoma[J].Lung Cancer,2015,87(2):98-106.

[13]孟凡榮，陳琛，萬海粟，等．慢病毒載體及其研究進(jìn)展[J]．中國肺癌雜志，2014(12)：870-876．

[14]張曼，孫秀萍，宋銘晶．慢病毒載體用于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究進(jìn)展[J/CD]．中華臨床醫(yī)師雜志(電子版)，2014，8(10)：1949-1953．

[15]Khetawat D,Broder CC.A functional henipavirus envelope glycoprotein pseudotyped lentivirus assay system[J].Virol J,2010,7(1):312.

Establishment of A549 cell line with stable expression of HIF1α mediated by lentiviral vector*

ZouBin1,ZhouXueliang1#,ZhanYuliang2,ChenZiqing1,LaiSongqing1,WuXia1,LiuJichun1△

(1.DepartmentofCardiothoracicSurgery;2.DepartmentofCardiology,FirstAffiliatedHospital,NanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330006,China)

Objective To establish the A549 cell line with stable expression of HIF1α by using lentiviral vector system.Methods Primers were designed and synthesized with human HIF1α gene coding sequence by the National Center of Biotechnogical Information(NCBI) as the template.HIF1α was amplified by PCR.The HIF1α fragment recycled by enzyme digestion was recombined with prepared lentiviral vector HBLV-RFP-Puro.The recombinant plasmid was identified by PCR and gene sequencing.The recombinant plasmid and the auxiliary plasmid were co-transfect into 293T cell.After filtration and concentration of packaged virus,the viral titer was detected by using the dilution counting method.The prepared lentivirus was infected A549 cells.The drug screening was adopted to stabilize the transfected cell line.The transfection effect was detected and observed by fluorescence microscope and Western blotting.Results The HIF1α fragment amplified by PCR was successfully verified and the recombinant plasmid was successfully constructed by PCR and gene sequencing identification.High-titer LV-HIF1α was obtained by successful package.After LV-HIF1α infecting A549 cells,the cells showed the red fluorescence by fluorescence microscope.The expression level of HIF1α in the LV-HIF1α group was significant higher than that in the control group by Western blot.Conclusion The 549 cell line with HIF1α stable expression mediated by lentivirus is constructed successfully．

HIF1α;lentivirrus;stable expression;A549

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81260024)。 作者簡介：鄒斌(1980-)，主治醫(yī)師，博士，主要從事肺癌綜合治療研究。#共同第一作者:周學(xué)亮(1980-)，主治醫(yī)師，博士，主要從事肺癌綜合治療研究?！?/p>

E-mail:liujichun999@163.com。

??·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.20.003

R734.2

A

1671-8348(2017)20-2744-03

2017-02-09

2017-04-14)