尹 康，胡純兵，周 濱，吳國平△，趙利平

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院外科，四川瀘州 646000；2.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院燒傷整形科，山東濟(jì)寧 272029；3.南京醫(yī)科大學(xué)附屬友誼整形外科醫(yī)院，南京 210029)

不同時(shí)機(jī)轉(zhuǎn)染基因?qū)ο骂M骨牽引區(qū)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響研究*

尹 康1，胡純兵2，周 濱2，吳國平2△，趙利平3▲

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院外科，四川瀘州 646000；2.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院燒傷整形科，山東濟(jì)寧 272029；3.南京醫(yī)科大學(xué)附屬友誼整形外科醫(yī)院，南京 210029)

目的 通過觀察不同時(shí)機(jī)轉(zhuǎn)染基因?qū)ο骂M骨牽引區(qū)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響，探討基因治療促進(jìn)牽引成骨的分子機(jī)制及最佳時(shí)機(jī)。方法 48只新西蘭大白兔建立雙側(cè)下頜骨牽引成骨模型后均分為A、B、C、D組。A、B、C組分別于術(shù)后即刻、術(shù)后第4天、術(shù)后第14天在牽引區(qū)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pIRES-hBMP2-hVEGF165，并局部給予電穿孔刺激。4組動物均在術(shù)后第4天，以1 mm/d的速度持續(xù)牽引10 d后進(jìn)入固定期。于固定期第7、14、28、56天各組分別處死動物3只，通過免疫組織化學(xué)染色檢查牽引區(qū)新生骨組織cyclin A、D1、E的表達(dá)。結(jié)果 在固定期第7、14天時(shí)，A、B、C組牽引間隙cyclin A、D1、E的表達(dá)較強(qiáng)，在第7天時(shí)表達(dá)最強(qiáng)烈，并且A、B、C組均較D組表達(dá)強(qiáng)；第28、56天時(shí)各組表達(dá)均較弱。在第7天時(shí)，B組表達(dá)較A、C、D組強(qiáng)(P<0.05)，A、C組間表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但均較D組強(qiáng)(P<0.05)；在第14天時(shí)，B、C組表達(dá)較A、D組強(qiáng)(P<0.05)，B、C組間及A、D組間表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 cyclin A、D1、E的高表達(dá)能促進(jìn)牽引區(qū)細(xì)胞分裂、增殖和分化，進(jìn)而加快牽引區(qū)新骨形成，牽引期是基因治療干預(yù)下頜骨牽引成骨的最佳時(shí)機(jī)。

轉(zhuǎn)染時(shí)機(jī)；電穿孔；基因療法；牽引成骨；細(xì)胞周期蛋白

目前，牽引成骨技術(shù)被廣泛應(yīng)用于顱頜面外科[1]，但如何減少因療程長所致的并發(fā)癥(創(chuàng)面感染、牽引器松動、骨不連及延遲愈合等)是學(xué)術(shù)界關(guān)注的焦點(diǎn)[2]。筆者通過在下頜骨牽引區(qū)不同時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)染基因，并觀察其對牽引區(qū)新生組織細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響，研究基因轉(zhuǎn)染促下頜骨牽引區(qū)新骨形成的最佳時(shí)機(jī)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 實(shí)驗(yàn)動物及飼養(yǎng)由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供(實(shí)驗(yàn)動物許可證號SYXK、川2008-065)，重組質(zhì)粒pIRES-hBMP2-hVEGF165(-8 ℃保存)由本課題組構(gòu)建[3]。

A：A組；B：B組；C：C組；D：D組

圖1 固定期第7天時(shí)cyclin E的表達(dá)情況(SP×400)

A：A組；B：B組；C：C組；D：D組

圖2 固定期第14天時(shí)cyclin E的表達(dá)情況(SP×400)

基因脈沖導(dǎo)入儀(LN-301型，天津理工大學(xué)研制)；下頜骨牽引器CBX0105-10(兔專用，寧波慈北口腔器械公司)；生物素標(biāo)記羊抗鼠IgG，兔抗cyclin A、D1、E抗體，SP、DAB 顯色試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)公司)；多功能真彩色病理圖像分析系統(tǒng)(CMIAS-2001A，北京麥克奧迪圖像技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物模型與基因?qū)?將48只新西蘭大白兔(體質(zhì)量2.5～3.0 kg，雌雄不限)實(shí)驗(yàn)前3 d連續(xù)監(jiān)測體溫、呼吸及脈搏，個(gè)體間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在西南醫(yī)科大學(xué)外科手術(shù)學(xué)技能中心完成，動物手術(shù)動物處置符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。參照本課題組前期研究[4]建立兔雙側(cè)下頜骨牽引成骨動物模型后，隨機(jī)摸球法將動物均分為A組(潛伏期給藥組)、B組(牽引期給藥組)、C組(固定期給藥組)、D組(對照組)。4組都經(jīng)過3 d潛伏期后進(jìn)入牽引期(即于術(shù)后第4天)，開始以1 mm/d的速度連續(xù)牽引10 d后進(jìn)入固定期。A、B、C組分別于術(shù)后即刻、術(shù)后第4天(牽引開始時(shí))、術(shù)后第14天(牽引結(jié)束時(shí))在牽引區(qū)局部注射2 μg(0.1 μg/μL)重組質(zhì)粒pIRES-hBMP2-hVEGF165，待擴(kuò)散10 min后，4組動物在牽引間隙部位均給以相同電穿孔刺激1次(電脈沖參數(shù)：平均脈寬2 ms、電壓300 V、頻率0.2 Hz、6個(gè)單脈沖、3個(gè)脈沖后更換正負(fù)極)。

1.2.2 標(biāo)本制作與切片 于固定期第7、14、28、56天各組分別處死(空氣栓塞法)實(shí)驗(yàn)動物3只，收獲牽引區(qū)組織，經(jīng)生理鹽水洗滌后立刻浸于多聚甲醛(40 g/L、4 ℃、pH 7.4)中固定24 h，以20%EDTA2Na脫鈣(3～5 d更換脫鈣液1次，2～3周)滿意后，用梯度乙醇脫水，再用二甲苯透明，石蠟包埋，制成切片(5 μm)。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色(SP法) 石蠟切片脫蠟、脫水，3%H2O237 ℃孵育10 min，0.01 mol/L PBS(pH 7.2)沖洗3次，每次5分鐘；置于0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)中，用微波抗原修復(fù)10 min；自然冷卻后，再用0.01 mol/L PBS沖洗3次，每次5分鐘；滴加PBS(0.01 mol/L)稀釋的10%山羊血清進(jìn)行封閉，室溫(37 ℃)孵育20 min；傾去血清后，直接加一抗(0.01 mol/L PBS稀釋，1∶50至1∶100)，37 ℃孵育1 h后，4 ℃過夜；0.01 mol/L PBS沖洗3次，每次5分鐘，滴加生物素標(biāo)記二抗(0.01 mol/L PBS稀釋，1∶100)，37 ℃孵育1 h；PBS(0.01 mol/L)洗3次，每次5分鐘，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液(SP，0.01 mol/L PBS稀釋，1∶100)，37 ℃孵育1 h；0.01 mol/L PBS沖洗3次，每次5分鐘，DAB顯色，鏡下觀察控制顯色效果；蘇木素淺染色，脫水，透明，封片。對照設(shè)置：以PBS(0.01 mol/L)代替一抗作陰性對照，其余步驟同上。結(jié)果判定：胞核呈黃色或淺藍(lán)色，胞漿呈棕黃色為陽性結(jié)果。

1.2.4 圖像分析及定量方法 采用CMIAS-2001A多功能真彩色病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析及定量，在光鏡10×40倍視野下，每個(gè)樣本隨機(jī)選取5個(gè)視野，檢測陽性表達(dá)蛋白的積分光密度(IOD)值和平均光密度(MOD)。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)動物數(shù)量分析 實(shí)驗(yàn)動物均耐受全部實(shí)驗(yàn)過程并進(jìn)行結(jié)果分析。

2.2 各組cyclins表達(dá) 在牽引區(qū)組織的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均可見cyclin A、D1、E的表達(dá)。固定期第7天時(shí)，cyclin A、D1、E表達(dá)最強(qiáng)烈，主要在肉芽組織中的炎細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及骨周圍結(jié)締組織中表達(dá)，cyclin A、D1、E表達(dá)B組較A、C、D組強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；A、C組表達(dá)較D組強(qiáng)(P<0.01)，A、C組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第14天時(shí)，cyclin A、D1、E表達(dá)強(qiáng)度較第7天時(shí)有所減弱，主要在牽引間隙間充質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和新生骨小梁中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，B、C組表達(dá)較A、D組強(qiáng)(P<0.05)，B組與C組間、A組與D組間表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第28天時(shí)，主要在骨小梁表面的成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和骨周圍結(jié)締組織及成纖維細(xì)胞中表達(dá)，各組表達(dá)均較固定期第14天時(shí)進(jìn)一步減弱。B、C組仍呈陽性表達(dá)，較A、C組表達(dá)強(qiáng)烈。第56天時(shí)，有少許在成纖維細(xì)胞及骨周圍結(jié)締組織、骨小梁表面的成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞中表達(dá)，各組表達(dá)均較弱或無表達(dá)。各組cyclin A、D1、E表達(dá)較弱且組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1～4，表1～3。

A：A組；B：B組；C：C組；D：D組

圖3 固定期第28天時(shí)cyclin D1的表達(dá)情況(SP×400)

A：A組；B：B組；C：C組；D：D組

圖4 固定期第56天時(shí)cyclin A的表達(dá)情況(SP×400)

表2 各組cyclin D1的IOD、MOD比較

表3 各組cyclin A的IOD、MOD比較

3 討 論

隨著牽引成骨在顱頜面外科的廣泛應(yīng)用，學(xué)者們通過基因治療途徑來促進(jìn)牽引區(qū)新骨的形成以減少創(chuàng)面感染、牽引器松動、骨不連及延遲愈合等術(shù)后并發(fā)癥。目前一致認(rèn)為：(1)生長因子表達(dá)順序、分泌水平和時(shí)相的影響因素不僅有力學(xué)，還有因子間的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)，它們是一組有序、有規(guī)律作用的因子[5]；牽張成骨過程的調(diào)節(jié)涉及多種生長因子，主要包括堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、骨形成蛋白(BMPs)、血小板源性生長因子(PDGF)。(2)多種組織干細(xì)胞作為種子細(xì)胞在多種因子修飾下分化并促進(jìn)牽引區(qū)新骨形成，其中主要種子細(xì)胞有人牙髓干細(xì)胞(SHED)、間質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)、脂肪源干細(xì)胞(ADSCs)[6-7]。課題組前期實(shí)驗(yàn)通過不同時(shí)間點(diǎn)在下頜骨牽引區(qū)轉(zhuǎn)染基因后觀察牽引區(qū)新骨X線、骨密度、組織學(xué)檢測及形態(tài)計(jì)量分析證明牽引期行基因轉(zhuǎn)染更能促進(jìn)新骨生成[8-9]，但其分子機(jī)制尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：固定期第7天時(shí)，B組的表達(dá)較A、C及D組強(qiáng)，A、C組間無顯著差異，但均較D組強(qiáng)；固定期第14天時(shí)，B、C組表達(dá)較A、D組強(qiáng)，B、C組間及A、D組間無顯著差異；固定期第28、56天時(shí)，表達(dá)均較弱?？梢姞恳谵D(zhuǎn)染組牽引區(qū)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)明顯增強(qiáng)且時(shí)限延長，提示基因轉(zhuǎn)染時(shí)機(jī)與表達(dá)水平密切相關(guān)，機(jī)械牽張力可增加轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)而引起細(xì)胞周期蛋白表達(dá)增強(qiáng)，進(jìn)而加速新骨形成。其機(jī)制可能是牽引間隙新骨形成過程包括血管的再生、成骨細(xì)胞的增殖及分化、膠原纖維的形成和基質(zhì)的鈣化等過程[10]，而細(xì)胞周期的調(diào)控決定細(xì)胞的增殖與分化。cyclin A為S期周期蛋白，可能調(diào)控G1/S期轉(zhuǎn)化；cyclin D1它是生長因子的感應(yīng)器及細(xì)胞周期的啟動因子；cyclin E在G1/S期與CDK2結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期；具有催化功能的細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶(CDKs)和具有調(diào)節(jié)功能的cyclins是在細(xì)胞周期進(jìn)程中主要的兩類調(diào)節(jié)因子[11-12]，二者所形成的復(fù)合體是細(xì)胞周期調(diào)控的核心機(jī)制[13]；當(dāng)處于靜止期G0細(xì)胞可因生長因子、激素等刺激后，可產(chǎn)生多種cyclins并誘導(dǎo)相應(yīng)CDK的表達(dá)，最終促使細(xì)胞分裂、增殖[14]。牽引期轉(zhuǎn)染，在牽張力的刺激下，骨組織通過一系列復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)外信號傳導(dǎo)后，局部轉(zhuǎn)染基因誘導(dǎo)成骨細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞首先改變形狀，并有協(xié)同促進(jìn)各種細(xì)胞生長因子合成、分泌作用及cyclinA、D1、E的表達(dá)[15]，使?fàn)恳齾^(qū)產(chǎn)生高濃度的生長因子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，促進(jìn)成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等細(xì)胞的分裂、增殖，從而促進(jìn)牽引間隙新骨、新生血管的形成。在潛伏期和固定期行基因轉(zhuǎn)染，雖在局部可形成高濃度的生長因子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，但由于牽引間隙細(xì)胞無機(jī)械應(yīng)力作用，生長因子的生成會受到影響。另外，潛伏期質(zhì)粒其轉(zhuǎn)染率可能受牽引間隙存在大量的滲血所稀釋或沖走，以及炎癥介質(zhì)釋放的影響。本實(shí)驗(yàn)研究表明在牽引期進(jìn)行基因治療能增強(qiáng)牽引區(qū)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)并延長其時(shí)限，促新骨生成。

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Effect of gene transfecting at different time on expression of cyclins in mandibular distraction area*

YinKang1,HuChunbing2,ZhouBing2,WuGuoping2△,ZhaoLiping3▲

(1.DepartmentofSurgery,AffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China;2.DepartmentofBurnandPlasticSurgery,AffiliatedHospitalofJiningMedicalUniversity,Jining,Shandong272029,China; 3.AffiliatedFriendshipPlasticSurgeryHospital,NanjingMedicalUniversity,Nanjing,Jiangsu210029,China)

Objective To investigate the optimal time and molecular mechanism of gene therapy for promoting distraction osteogenesis by observing the effect of gene transfecting at different time on expression of cyclins in mandibular distraction area.Methods Forty eight New-Zealand rabbits were employed.After accomplishing bilateral mandibular distraction osteogenesis model,the rabbits were randomly divided into the group A,B,C and D.The group A,B and C were transfected by recombinant plasmids pIRES-hBMP2-hVEGF165 2 μg(0.1 μg/μL)at the distraction area instantly after operation,on postoperative 4,14 d and given local electroporation stimulation.The four groups entered the consolidation stage after 10 d continuous traction at a rate of 1 mm/d on postoperative 4 d.Three rabbits in each group were respectively sacrificed on 7,14,28,56 d of the consolidation stage.The expression of cyclin A,D1,and E of fresh bone tissue in distraction area were detected by immunohistochemical staining.Results Cyclin A,D1,and E were strongly expressed in the traction gap on 7,14 d of consolidation stage found,which was strongest on 7 d,moreover the group A,B and C were stronger than the group D.The expression in each group was weakened on 28,56 d.The expression on 7 d in the group B was stronger than that in the4 group A,C and D(P<0.05),the expression had no statistical difference between the group A and C(P>0.05),but all were stronger than the group D(P<0.05);the expression in the group B and C on 14 d was stronger than that in the group A and D,but the expression had no statistical difference between the group B and C and between the group A and D(P>0.05).Conclusion The high expression of cyclin A,D1 and E can promote the cellular division,proliferation and differentiation in distraction area,thus accelerates the new bone formation in the distraction area,prompting that the distraction period is the best time for distraction osteogenesis under gene therapeutic intervention.

transfection time;electroporation;gene therapy;distraction osteogenesis;cyclins

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30600653)；四川省衛(wèi)生廳科研課題(12226)。 作者簡介：尹康(1974-)，碩士，主要從事外科手術(shù)技能及整形美容方面的研究?！?/p>

，E-mail:drgpwu@yahoo.com.cn。▲通信作者,E-mail:zlping86@163.com。

? 著·

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.20.001

R622.9

A

1671-8348(2017)20-2737-04

2017-02-03

2017-04-08)