咸 杰，何本祥，吳 驍，檀亞軍

(成都體育學(xué)院，成都 610041)

自體富血小板血漿對兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的治療效果觀察*

咸 杰，何本祥△，吳 驍，檀亞軍

(成都體育學(xué)院，成都 610041)

目的 探討富血小板血漿(PRP)對膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)的治療機制及作用。方法 取成年清潔級新西蘭大白兔32只，分為空白對照組(A組)、模型對照組(B組)、PRP治療組(C組)、玻璃酸鈉治療組(D組)。A組行模擬造模，B、C、D組按Hulth方法誘發(fā)建立兔KOA動物模型。動物模型建立成功后，C組予PRP 0.5 mL關(guān)節(jié)腔注射治療，3周1次，共2次；D組予玻璃酸鈉注射液關(guān)節(jié)腔注射，每周1次，連續(xù)5周；A、B組于C組同一時間點給予等量無菌生理鹽水注射。在普通光學(xué)顯微鏡下觀察關(guān)節(jié)軟骨的組織結(jié)構(gòu)、細胞數(shù)量、潮線的完整性和甲苯胺藍染色等情況，比較各組間Mankin′s評分的差異。收集適量關(guān)節(jié)液測定各組花生四烯酸的表達情況。結(jié)果 A組關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，無明顯破壞；B、C、D組關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)形態(tài)均有不同程度的破壞，尤以B組軟骨結(jié)構(gòu)改變較大，C、D組軟骨形態(tài)結(jié)構(gòu)雖有改變，但與A組軟骨結(jié)構(gòu)較接近。A組Mankin′s評分最低，B組評分最高，C、D組經(jīng)干預(yù)治療后評分明顯降低；B組與C、D組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，C組與D組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。A組花生四烯酸水平最低，B組最高，C、D組水平介于A、B組之間，且C組低于D組(P<0.05)。結(jié)論 PRP對KOA具有較為明顯的治療及緩解作用。

膝關(guān)節(jié)；骨性關(guān)節(jié)炎；運動醫(yī)學(xué)；富血小板血漿；花生四烯酸

富血小板血漿(platelets-rich plasma，PRP)是自體血小板的濃縮物,對治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)有較好的前景[1]，但由于其療效及作用機制尚未明了，限制了其在臨床應(yīng)用。PRP含有高于正常血漿3～5倍的生長因子，這些內(nèi)在的生長因子都是以正常生物性比率存在的。在過去的20年中，它已經(jīng)在口腔科、頜面外科、普通外科等臨床學(xué)科被廣泛使用[2]。PRP中的α-顆粒可以釋放許多生長因子和細胞因子，主要有轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)、血小板源性生長因子、胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)、成纖維細胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、肝細胞生長因子等，這些細胞因子在細胞分化和細胞增殖等方面起著重要的作用[3]。PRP在治療膝關(guān)節(jié)軟骨退變方面的研究已經(jīng)取得了很多進展，但是其對軟骨退變的作用機制仍需做深入的研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 成年新西蘭純種雄性大白兔32只，體質(zhì)量1.80～2.50 kg，平均(2.20±0.16)kg，由達碩生物科技有限公司提供。清潔級環(huán)境條件下飼養(yǎng)于成都體育學(xué)院運動醫(yī)學(xué)重點實驗室動物實驗中心飼養(yǎng)室?；ㄉ南┧崴綑z測的ELISA試劑盒由四川生工科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 PRP的制備 自兔耳中心動脈采血。拔除兔耳中心動脈耳背走行處擬進針部位兔毛后，拍打兔耳4～5次，見動脈充盈后，用蘸75%乙醇的棉簽擦拭進針部位4～5次，使動脈繼續(xù)擴張充血，以利于進針及采血，同時對進針部位進行消毒。取10 mL無菌注射器拔除針頭后連接一次性輸液針，將輸液針于進針部位向兔耳耳根方向進針刺入兔耳中心動脈，緩慢抽取約5 mL動脈血，注入肝素抗凝的真空采血管中，反復(fù)晃動采血管15～20次以使抗凝劑與血液完全混合，防止血液凝固。參照Landesberg等[4]采用二次離心法將5 mL自體全血制備為0.2 mL PRP，并在血細胞分析儀中對PRP進行血小板計數(shù)。

1.2.2 動物分組及模型建立 32只新西蘭大白兔按照Huth[5]法建立KOA動物模型，A組行模擬造模(假造模)；B、C、D組按照Hulth方法誘發(fā)建立兔KOA動物模型[5]。B、C、D組動物造模步驟：備皮及麻醉滿意后，取仰臥位將實驗動物固定在兔手術(shù)操作臺上，通過10%水合氯醛(按0.15 mL/100 g比例[6])腹腔麻醉后，取膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)弧形切口，依次切開皮膚、皮下組織，然后切斷內(nèi)側(cè)副韌帶，切開關(guān)節(jié)囊，打開關(guān)節(jié)腔。稍屈曲膝關(guān)節(jié)，向外側(cè)牽開髕骨、髕韌帶及關(guān)節(jié)囊，暴露關(guān)節(jié)腔，切除內(nèi)側(cè)半月板，切斷前、后交叉韌帶，術(shù)中應(yīng)注意避免損傷關(guān)節(jié)軟骨面。用生理鹽水注射液反復(fù)沖洗關(guān)節(jié)腔，切口內(nèi)注入硫酸慶大霉素注射液2萬單位，關(guān)閉關(guān)節(jié)囊，逐層縫合關(guān)閉切口，外用防水創(chuàng)可貼包扎切口。A組行假造模，術(shù)前準備、麻醉方式、消毒鋪巾同B、C、D組；手術(shù)過程中，不切斷內(nèi)側(cè)副韌帶，打開關(guān)節(jié)腔后，探查關(guān)節(jié)腔，觀察關(guān)節(jié)腔內(nèi)無原發(fā)病變后關(guān)閉切口，切口關(guān)閉方法亦同B、C、D組。

1.2.3 干預(yù)手段 動物模型穩(wěn)定后，C組予自體PRP關(guān)節(jié)腔注射治療，3周1次，每次0.5 mL,共2次；D組予玻璃酸鈉關(guān)節(jié)腔注射，給藥劑量根據(jù)Meeh-Riibner公式計算，將按體表面積折算的臨床常用量等效劑量約為每只兔子0.2 mL，每周1次，連續(xù)5周；A、B組于C組同一時間點給予等量生理鹽水注射。

1.2.4 檢測指標 治療6周后用空氣栓塞法處死所有實驗動物。(1)一般情況：通過Huth法誘發(fā)造模成功后，觀察各組兔存活狀況及造?；贾P(guān)節(jié)腫脹程度及局部皮溫是否升高、膚色狀況。(2)花生四烯酸水平測定：干預(yù)及治療周期結(jié)束后，處死動物，同時收集造?；贾P(guān)節(jié)液，通過ELISA雙抗夾心法測定其濃度。

1.2.5 組織形態(tài)學(xué)觀察 切取標本全層膝關(guān)節(jié)軟骨組織，置于10%中性甲醛固定，石蠟切片，片厚6 μm，常規(guī)HE及甲苯胺藍染色，400倍光鏡下觀察關(guān)節(jié)軟骨的組織結(jié)構(gòu)、細胞數(shù)量、甲苯胺藍染色和潮線完整性。根據(jù)Mankin′s 評分標準對關(guān)節(jié)軟骨評分[7]。

2 結(jié) 果

2.1 C組外周血與PRP濃度之比 離心前全血細胞為(361.37±107.46)×109/L，二次離心后血細胞為(1 407.75±317.92)×109/L，其濃度之比均在3～5倍，符合PRP要求標準。見表1。

表1 C組外周血與PRP濃度之比(×109/L)

2.2 一般情況 所有實驗動物均存活至實驗完成。除手術(shù)組動物出現(xiàn)KOA外，所有動物均未出現(xiàn)其他原因所致關(guān)節(jié)腔感染及病灶的感染。3組動物造?；贾P(guān)節(jié)略紅腫，皮溫略高于正常。

2.3 各組花生四烯酸水平比較 A、B、C、D組花生四烯酸水平分別為(33.15±4.61)、(55.90±4.31)、(38.65±0.88)、(46.39±4.89)mg/g，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=47.507，P=0.000)。B、D組與A組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，C組與A組相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。C、D組與B組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，C組與D組相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 組織形態(tài)學(xué)觀察 A組在電鏡下切片顯示為正常軟骨形態(tài)，細胞排列規(guī)整，層次分明，細胞大小一致，軟骨表面完整，潮線清晰完整。B組可見細胞排列紊亂，層次不清晰，且可見較為明顯的軟骨缺損，局部細胞數(shù)量明顯增多，細胞分裂增多，潮線模糊，基質(zhì)失染較為明顯。C組可見軟骨層增厚，細胞排列較為規(guī)整，層次分明，細胞數(shù)量較B組明顯減少，未見明顯彌漫性數(shù)量增生，細胞核未見明顯分裂，潮線清晰層次分明，基質(zhì)未見明顯失染。D組可見軟骨細胞排列較為有序，但細胞層次清晰不如C組，細胞數(shù)量輕度增生，但較B組較少，潮線較為清晰完整，甲苯胺藍染色較弱。見圖1、2。

2.5 各組mankin′s評分比較 軟骨組織結(jié)構(gòu)：C、D組與B組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。軟骨細胞數(shù)量:C、D組與B組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；D組與C組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。AB-PAS染色：B、D組與A組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；C、D組與B組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；D組與C組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。潮線：C、D組與B組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；D組與C組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

圖1 各組電鏡下HE染色切片(×400)

A：A組；B：B組；C：C組；D：D組

圖2 各組電鏡下甲苯胺藍染色切片(×400)

*：P<0.05，與A組比較；#：P<0.05，與B組比較；△：P<0.05，與C組比較

3 討 論

本實驗研究證實了采用Hulth方法誘發(fā)建立的兔KOA動物模型，其病理過程基本與人類臨床上KOA的病理變化十分相似，適用于KOA病理改變和膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)藥物注射探討其作用機制等方面的研究；并且動物模型誘發(fā)成功率高，穩(wěn)定性好，本實驗所需的動物實驗?zāi)Ｐ途T發(fā)成功。

本次實驗采用Landesberg二次離心法制備PRP，操作方法簡便穩(wěn)定，制備濃度高，結(jié)果證實其濃度之比為3～5倍，與國內(nèi)外多數(shù)文獻吻合。

伴隨關(guān)節(jié)軟骨的退變，關(guān)節(jié)液分泌多種炎性介質(zhì)誘導(dǎo)炎性反應(yīng)[8]，其中花生四烯酸是較為主要的炎性介質(zhì)產(chǎn)物之一?；ㄉ南┧嶙鳛榍傲邢偎谽2(PGE2)的前體，通過環(huán)氧化酶(COX)的誘導(dǎo)產(chǎn)生后者誘發(fā)一系列的炎癥反應(yīng)[9-10]。正常關(guān)節(jié)液中并不含或僅含少量花生四烯酸，關(guān)節(jié)發(fā)生炎癥反應(yīng)后花生四烯酸的水平與關(guān)節(jié)炎性程度呈直接正相關(guān)，同時活化后的花生四烯酸能夠通過多種白介素因子促進軟骨細胞的降解[11]。實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過6周治療后PRP與玻璃酸鈉對關(guān)節(jié)液中花生四烯酸濃度均有不同程度的下降，提示兩組治療效果較模型對照組較為明顯，具有較為理想的治療效果。同時，PRP治療組及玻璃酸鈉治療組Mankin′s評分均有較為明顯的下降，提示二者均能一定程度促進早期關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)，減輕關(guān)節(jié)軟骨的磨損。而PRP治療組評分優(yōu)于玻璃酸鈉治療組，提示PRP在延緩關(guān)節(jié)軟骨早期退變進程上優(yōu)于玻璃酸鈉。PRP可能通過釋放一系列活性物質(zhì)[5],促進受損軟骨及局部血管的再生，抑制局部炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，降低COX的表達[12]，使花生四烯酸活性降低,與此同時，PRP所釋放的活性因子可下調(diào)COX-2的表達，降低炎性介質(zhì)類產(chǎn)物的活性，從而降低花生四烯酸在炎性反應(yīng)中的作用。此外，PRP還能上調(diào)肝細胞因子及腫瘤壞死因子α(TNF-α)的表達，二者能阻斷核因子κB(NF-κB)的表達，抑制炎性反應(yīng)的發(fā)展，從而減輕關(guān)節(jié)局部的腫脹[13]。盡管如此，PRP的制備過程尚未統(tǒng)一，且在制備過程中可產(chǎn)生含白細胞的PRP(L-PRP)及不含白細胞的PRP(R-PRP)，二者在對膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎干預(yù)過程中的機制及對比尚需進一步完善。

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Observation on effect of autologous platelet-rich plasma in treating rabbit knee osteoarthosis*

XianJie,HeBenxiang△,WuXiao,TanYajun

(ChengduSportUniversity,Chengdu,Sichuan610041,China)

Objective To investigate the treatment mechanism and effect of platelet-rich plasma(PRP) in treating rabbit knee osteoarthosis(KOA).Methods Thirty-two New Zealand adult clean class rabbits were randomly divided into the blank control group(A),model control group(B),PRP treatment group(C) and sodium hyaluronate treatment group(D).The group A conducted the simulated model construction,while the group B,C and D established the KOA rabbit model by using the Hulth method.After establishing the animal model,the group C was given PRP 0.5mLl by knee articular cavity injection,once every 3 weeks,twice in total;the group D was given sodium hyaluronate by knee articular cavity injection,once per week for 5 continuous weeks.The group A and B were injected with equal amount of normal saline at the same time point in the group C.The histological structure of articular cartilage,cell number,integrity of tidal line,and toluidine blue staining were observed by common optical microscope.The differences of Mankin′s scores were compared among various groups.The proper amount of knee joint fluid was collected for measuring the arachidonic acid expression in each group.Results The structure and morphology of articular cartilage in the group A were normal without obvious damage,while which in the group B,C and D had different degrees of damage,especially the cartilage structure in the group B had greater changes.Although the group B and C had the morphological and structure change of articular cartilage,but which was close to the cartilage structure in the group A.The Mankin′s score in the group A was lowest,while which in the group B was highest,which in the group C and D was significantly decreased after intervention treatment;the difference between the group B with the group C and D had statistical significance(P<0.05).The difference between the group C and D had statistical significance(P<0.05).The arachidonic acid level in the group A was lowest and which in the group B was highest,which in the group C and group D ranged between the group A and B,moreover the group C was lower than the group D (P<0.05).Conclusion PRP has obvious therapeutic and alleviated effect in treating KOA.

knee joint;osteoarthrosis;sports medicine;platelet-rich plasma;arachidonic acid

四川省科技廳重點項目(2016JY0052)；四川省科技廳支撐項目(2014SZ0003)；成都體育學(xué)院碩士點建設(shè)基金項目(16SSZX01)。 作者簡介：咸杰(1989-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事運動創(chuàng)傷防治研究?！?/p>

，E-mail:1210075193@qq.com。

??·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.20.004

R684.3

A

1671-8348(2017)20-2747-04

2017-02-11

2017-04-16)