鄭 輝，孫作乾，王志亮，魏正風，馮 炎，張興柱，王付蒼，史永強，高肇林#(.棗莊科技職業(yè)學院醫(yī)學技術(shù)系，山東滕州 77500;.山東益康藥業(yè)股份有限公司山東省晶型藥物重點實驗室，山東滕州 7753)

神經(jīng)酸對帕金森病模型小鼠運動障礙的緩解作用及機制研究

鄭 輝1，2＊，孫作乾1，王志亮1，魏正風2，馮 炎2，張興柱2，王付蒼2，史永強2，高肇林2#(1.棗莊科技職業(yè)學院醫(yī)學技術(shù)系，山東滕州 277500;2.山東益康藥業(yè)股份有限公司山東省晶型藥物重點實驗室，山東滕州 277513)

目的:研究神經(jīng)酸對帕金森病(PD)模型小鼠運動障礙的緩解作用及機制。方法:將小鼠隨機分為空白對照組(生理鹽水)、模型組(生理鹽水)、多巴絲肼片組(陽性對照，按左旋多巴計120mg/kg)和神經(jīng)酸低、中、高劑量組(20.0、40.0、80.0mg/kg)，每組10只。除空白對照組外，其余各組小鼠均建立PD模型。成模后，每天ig相應(yīng)藥物1次，連續(xù)14 d。末次給藥后，觀察各組小鼠行為學變化，采用高效液相色譜法測定小鼠腦紋狀體內(nèi)多巴胺(DA)及其代謝物二羥苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)的含量。結(jié)果:與空白對照組比較，模型組小鼠爬桿時間延長、滾筒時間縮短、自發(fā)運動次數(shù)減少(P＜0.05)，腦紋狀體內(nèi)DA、DOPAC、HVA含量均降低(P＜0.05)。與模型組比較，多巴絲肼片組和神經(jīng)酸各劑量組小鼠爬桿時間縮短、滾筒時間延長(P＜0.05)，腦紋狀體內(nèi)DA、DOPAC、HVA含量均升高(P＜0.05);多巴絲肼片組和神經(jīng)酸高劑量組小鼠自發(fā)運動次數(shù)增加(P＜0.05)。結(jié)論:神經(jīng)酸可有效改善PD模型小鼠的運動障礙癥狀，其機制可能與增加腦紋狀體內(nèi)DA含量有關(guān)。

神經(jīng)酸;帕金森病;小鼠;運動障礙;多巴胺

帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)為一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為靜止震顫、肌肉強直、自發(fā)運動障礙等癥狀，患者生活自理能力較差。中國現(xiàn)有PD患者約170萬人，并保持每年約6%的增長速度[1]。中樞擬膽堿藥左旋多巴目前為治療PD的公認藥物，但這種藥物長期服用后的不良反應(yīng)較大，制約了其在臨床上的使用。所以，尋找新的藥物是目前PD研究領(lǐng)域的熱點。

神經(jīng)酸(Nervonic acid)為一種具有24個碳原子的單不飽和脂肪酸，最先是從哺乳類動物腦神經(jīng)內(nèi)分離出來的，室溫條件下為白色片狀結(jié)晶性固體。神經(jīng)酸作為腦神經(jīng)細胞中的一種核心神經(jīng)營養(yǎng)因子，能夠修復(fù)受損的神經(jīng)元末梢、促進神經(jīng)細胞生長發(fā)育和提高腦神經(jīng)活躍程度，是腦細胞生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)[2]。研究證明，神經(jīng)酸具有增強免疫功能[3]、防治艾滋病、防治惡性腫瘤、治療阿爾茨海默病[4]、治療齊薇格綜合征[5]等作用，但未見其在治療帕金森病方面的應(yīng)用。本文研究神經(jīng)酸對模型小鼠PD的緩解作用及機制，為其開發(fā)及臨床使用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Alliance2695液相色譜儀、2475熒光檢測器(美國Waters公司);TGL-20M臺式高速冷凍離心機(長沙平凡儀器儀表有限公司)。

1.2 藥品與試劑

神經(jīng)酸(上海恒棵生物科技有限公司，批號:151011，純度:90.0%);多巴絲肼片(商品名:美多芭，上海羅氏公司，批號:SH2443，規(guī)格:每片含左旋多巴200mg、芐絲肼50mg);1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)、多巴胺(DA)、二羥苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)等均購自美國Sigma公司。

1.3 動物

C57BL/6小鼠，SPF級，♀♂各半，8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，由山東大學實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK(魯)2009-0001。

2 方法

2.1 樣品的制備

神經(jīng)酸按每100 g加入30m L聚山梨酯80的比例混合研磨，加純化水制成白色均勻乳液，用時以純化水配制成所需濃度即可。

2.2 分組與給藥

將小鼠隨機分為空白對照組、模型組、多巴絲肼片組(陽性對照，按左旋多巴計120mg/kg)[6]和神經(jīng)酸低、中、高劑量組(20.0、40.0、80.0mg/kg，給藥劑量在參考文獻[7]及前期預(yù)實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上確定)。除空白對照組外，其余各組小鼠ip生理鹽水溶解的MPTP溶液25 mg/kg，每天1次，連續(xù)5 d。選取步長變短、活動減少、運動緩慢、全身震顫、豎毛豎尾等行為改變的小鼠作為合格PD模型小鼠，每組10只，♀♂各半。5 d后，各給藥組小鼠ig相應(yīng)藥物0.2m L/10 g，空白對照組和模型組小鼠ig等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)14 d。末次給藥24 h后，進行行為學實驗。

2.3 行為學實驗

2.3.1 爬桿實驗 將一個圓形小球(直徑3 cm)固定于一根竹桿(長50 cm，直徑1 cm)的頂部，竹桿表面纏繞多層紗布以免打滑。夾住小鼠尾尖，鼠頭朝下放在桿頂，并保證其雙后肢落在小球表面，然后使其順著竹桿順勢爬下。自小鼠適應(yīng)環(huán)境4 d后開始計時，從附在桿頂頭朝下開始，到雙前肢接觸小桿底端結(jié)束，記錄小鼠爬桿時間。

2.3.2 滾筒實驗 將小鼠放在滾筒儀的表面上，調(diào)整儀器旋轉(zhuǎn)速度為35 r/m in。自小鼠適應(yīng)環(huán)境4 d后開始計時，小鼠站在筒上滾筒旋轉(zhuǎn)開始，到從滾筒上掉落結(jié)束，記錄小鼠在滾筒上的持續(xù)時間。

2.3.3 自發(fā)運動實驗 參考文獻[8]進行實驗。把小鼠放在自發(fā)運動儀中心，確保環(huán)境安寧不嘈雜。打開自發(fā)運動監(jiān)測儀，使紅外線自由穿過，當小鼠活動時可阻擋紅外線，自小鼠適應(yīng)環(huán)境2m in后開始計時，記錄5min內(nèi)小鼠運動次數(shù)。

2.4 腦紋狀體內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物DOPAC、HVA含量的測定

[9]測定各組小鼠腦紋狀體內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物DOPAC、HVA含量。

2.4.1 色譜條件色譜柱:ZORBAX SB C18(250mm× 4.6 mm，5μm);流動相:(0.02 mol/L枸櫞酸鈉-0.05 mol/L磷酸氫二鈉)-甲醇(95∶5);流速:1.0m L/min;柱溫:35℃;發(fā)射波長:285 nm，激發(fā)波長:333 nm;進樣量: 20μL。

2.4.2 線性關(guān)系 分別精密稱取DA、DOPAC、HVA適量，用流動相稀釋制成300、50、50μg/m L的貯備液。精密量取各貯備液適量，按需要用流動相稀釋成系列質(zhì)量濃度，按“2.4.1”項下方法進樣測定，記錄峰面積。以藥物質(zhì)量濃度為橫坐標(x)、峰面積為縱坐標(y)進行回歸分析。

2.4.3 準確度、基質(zhì)效應(yīng)、精密度 按相關(guān)方法操作考察本方法的準確度、基質(zhì)效應(yīng)和精密度。

2.4.4 測定方法 行為學實驗完成后，小鼠剪頭取腦放在冰盤表面并迅速剝離出紋狀體，稱質(zhì)量后置于2m L EP管內(nèi)，準確加入0.1mol/L冰冷高氯酸溶液1.0m L，在冰浴條件下超聲(5 kHz，30 s)使細胞壁破損，4℃下10 000 r/min(離心半徑為10 cm)離心30min，取上清液進樣測定。

2.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)用±s表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 行為學考察結(jié)果

與空白對照組比較，模型組小鼠的爬桿時間明顯延長，滾筒持續(xù)時間明顯縮短，自發(fā)運動次數(shù)明顯減少(P＜0.05)。與模型組比較，各給藥組小鼠的爬桿時間均明顯縮短，滾筒持續(xù)時間均明顯延長(P＜0.05);多巴絲肼片組和神經(jīng)酸高劑量組小鼠的自發(fā)運動次數(shù)明顯增加(P＜0.05)。各組小鼠行為學考察相關(guān)指標測定結(jié)果見表1。

3.2 含量測定結(jié)果

本文色譜條件下，其他輔料均不干擾DA、DOPAC和HVA的測定，其日內(nèi)精密度試驗的含量RSD分別為5.4%～11.4%、4.9%～12.6%、5.1%～11.9(n=5)，日間精密度試驗的含量RSD分別為7.1%～10.1%、10.8%～12.4%、11.8%～13.1(n=3);準確度分別為99.6%～106.6%、99.8%～111.0%、99.4%～108.0%(n=3);基質(zhì)效應(yīng)分別為86.9%～105.3%、91.7%～102.8%、94.5%～102.1%。DA、DOPAC和HVA的線性關(guān)系見表2。

表1 各組小鼠行為學考察相關(guān)指標測定結(jié)果(±s，n=10)Tab 1 Determ ination results of related indexes in behavioral study ofm ice in each group(±s，n= 10)

表1 各組小鼠行為學考察相關(guān)指標測定結(jié)果(±s，n=10)Tab 1 Determ ination results of related indexes in behavioral study ofm ice in each group(±s，n= 10)

注:與空白對照組比較，＊P＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05Note:vs.blank controlgroup，＊P＜0.05;vs.modelgroup，#P＜0.05

組別空白對照組模型組多巴絲肼片組神經(jīng)酸低劑量組神經(jīng)酸中劑量組神經(jīng)酸高劑量組滾筒持續(xù)時間，s 601±21.55 256±14.89＊421±18.66#314±16.08#367±15.99#388±17.05#爬桿時間，s 6.21±1.52 36.66±5.08＊8.62±1.14#11.59±1.23#10.01±1.11#9.83±1.03#自發(fā)運動次數(shù)96.5±17.9 70.8±16.8＊92.8±17.2#79.7±16.7 84.6±17.6 89.8±17.4#

表2 DA、DOPAC和HVA的線性關(guān)系Tab 2 Linear relationshipsof DA，DOPAC and HVA

3.3 腦紋狀體內(nèi)DA、DOPAC和HVA含量測定結(jié)果

與空白對照組比較，模型組小鼠腦紋狀體內(nèi)DA、DOPAC、HVA含量明顯減少(P＜0.05)。與模型組比較，各給藥組小鼠腦紋狀體內(nèi)DA、DOPAC、HVA含量明顯增加(P＜0.05)。各組小鼠腦紋狀體內(nèi)DA、DOPAC、HVA含量的測定結(jié)果見表3。

表3 各組小鼠腦紋狀體內(nèi)DA、DOPAC、HVA含量的測定結(jié)果(±s，n=10，ng/m g)Tab 3 Determ ination results of DA，DOPAC，HVA concentrations in the striatum ofm ice in each grou(p±s，n=10，ng/mg)

表3 各組小鼠腦紋狀體內(nèi)DA、DOPAC、HVA含量的測定結(jié)果(±s，n=10，ng/m g)Tab 3 Determ ination results of DA，DOPAC，HVA concentrations in the striatum ofm ice in each grou(p±s，n=10，ng/mg)

注:與空白對照組比較，＊P＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05Note:vs.blank controlgroup，＊P＜0.05;vs.modelgroup，#P＜0.05

組別空白對照組模型組多巴絲肼片組神經(jīng)酸低劑量組神經(jīng)酸中劑量組神經(jīng)酸高劑量組HVA 0.83±0.10 0.16±0.03＊0.71±0.09#0.37±0.06#0.46±0.08#0.60±0.07#DA 5.66±0.83 0.48±0.03＊4.18±0.94#1.09±0.27#1.75±0.43#2.41±0.38#DOPAC 0.99±0.17 0.17±0.06＊0.89±0.15#0.50±0.14#0.62±0.24#0.76±0.06#

4 討論

PD的發(fā)病機制相對復(fù)雜，目前認為其病理變化部位為中腦部黑質(zhì)-紋狀體DA能神經(jīng)元。由于DA是抑制運動行為的關(guān)鍵性神經(jīng)遞質(zhì)，而乙酰膽堿(Ach)則是興奮運動行為的關(guān)鍵性神經(jīng)遞質(zhì)，故黑質(zhì)-紋狀體DA能神經(jīng)元發(fā)生退行性改變，導致DA濃度顯著下降，致使膽堿能神經(jīng)功能相對亢進，從而出現(xiàn)PD癥狀。當DA含量降低至50%以下時，會導致紋狀體內(nèi)DA和Ach平衡嚴重失調(diào)，產(chǎn)生靜止震顫、肌肉強直、自發(fā)運動障礙等PD癥狀。目前，臨床上常用藥物進行治療，作用機制為使紋狀體內(nèi)DA和Ach重新達到平衡，從而緩解PD癥狀[10]。

MPTP作為一種常用的造模用特殊神經(jīng)毒物，其脂溶性高，易經(jīng)血液循環(huán)穿過血腦屏障進入腦內(nèi)，能損傷DA能神經(jīng)元。本實驗采用MPTP誘發(fā)小鼠PD模型，結(jié)果顯示，PD模型小鼠自發(fā)活動較少，啃食東西及整理皮毛動作明顯減少，攀爬行為減少，有的小鼠甚至出現(xiàn)啃食艱難、體質(zhì)量降低、姿勢協(xié)調(diào)功能較差等。此外，模型小鼠腦紋狀體中DA、DOPAC和HVA含量較正常小鼠明顯降低，這些現(xiàn)象與現(xiàn)有PD模型報道[11-13]一致。因此，本實驗建立的小鼠PD模型科學可靠。

本研究結(jié)果顯示，PD模型小鼠ig神經(jīng)酸后，其爬桿時間縮短，滾筒持續(xù)時間延長，自發(fā)活動次數(shù)增加，說明神經(jīng)酸能提高PD模型小鼠的活動平衡及運動協(xié)調(diào)能力，可有效改善PD模型小鼠運動遲緩和肌肉強直等運動功能障礙癥狀。DOPAC和HVA為DA代謝產(chǎn)物，腦內(nèi)DOPAC和HVA的含量能間接反映DA含量的高低。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠腦紋狀體中DA、DOPAC和HVA含量較空白對照組明顯降低，而神經(jīng)酸各劑量組和多巴絲肼片組小鼠腦紋狀體中DA、DOPAC和HVA含量較模型組明顯增加，說明神經(jīng)酸緩解PD模型小鼠運動功能障礙癥狀的機制可能與增加腦紋狀體內(nèi)DA含量有關(guān)。

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(編輯:鄒麗娟)

Study on the A lleviation Effect and Its M echanism of Nervonic Acid on M ovement Disorder of M odel M ice w ith Parkinson’s Disease

ZHENG Hui1，2，SUN Zuoqian1，WANG Zhiliang1，WEI Zhengfeng2，F(xiàn)ENG Yan2，ZHANG Xingzhu2，WANG Fucang2，SHIYongqiang2，GAO Zhaolin2(1.Dept.of Medical Technology，Zaozhuang Vocational College of Science &Technology，Shandong Tengzhou 277500，China;2.Shandong Province Key Laboratory of Polymorph Drugs，Shandong Yikang Pharmaceutical Co.，Ltd.，Shandong Tengzhou 277513，China)

OBJECTIVE:To study the alleviation effect of nervonic acid on movement disorder ofmodelmice w ith Parkinson’s disease(PD).METHODS:M ice were random ly divided into blank control group(normal suline)，model group(normal saline)，Levodopa and benserazide hydrochloride tablet group(positive control，calculated by L-dopam ine 120 mg/kg)，nervonic acid low-dose，medium-dose，high-dose groups(20.0，40.0，80.0 mg/kg)，10 in each group.Except for blank control group，m ice in other groups were inducced for PD models.After modeling，m ice were intragastrically given relevantmedicines，once a day，for 14 d.After the last administration，behavioral changes ofm ice in each group were observed.HPLC was conducted to detect dopam ine(DA)and itsmetabolites dihydroxybenzoic acid(DOPAC)，homovanillic acid(HVA)concentrations in the striatum ofm ice. RESULTS:Compared w ith blank control group，climbing time was extended in model group，drum time was shortened，spontaneous movement times was decreased，and DA，DOPAC，HVA contents in the striatum were reduced(P＜0.05).Compared w ith model group，climbing time was shortened in Levodopa and benserazide hydrochlo ride tablet group，nervonic acid dose groups，drum time was extended，and DA，DOPAC，HVA contents in the striatum were increased(P＜0.05);and spontaneousmovement times was increased in Levodopa and benserazide hydrochloride tablet group，and nervonic acid high-dose group(P＜0.05).CONCLUSIONS:Nervonic acid can effectively improve symptoms of movement dysfunction of modelmice w ith PD.The mechanism may associate w ith increasing DA content in the striatum.

Nervonic acid;Parkinson’s disease;M ice;Movement disorder;Dopam ine

R965

A

1001-0408(2017)19-2648-04

2016-10-24

2016-12-09)

＊講師，碩士。研究方向:新藥開發(fā)。電話:0632-5953070。E-mail:zhenghui198334@163.com

#通信作者:高級工程師，博士。研究方向:新藥開發(fā)。電話: 0632-5953070。E-mail:sdykyy@126.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.19.16