唐 策，文 檢，楊 娟，左 芳，孟憲麗，張 藝(成都中醫(yī)藥大學民族醫(yī)藥學院，成都 611137)

·民族醫(yī)藥·

藏藥翼首草抗類風濕性關節(jié)炎活性成分靶點的網絡藥理學研究Δ

唐 策＊，文 檢，楊 娟，左 芳，孟憲麗，張 藝#(成都中醫(yī)藥大學民族醫(yī)藥學院，成都 611137)

目的:探索藏藥翼首草治療類風濕性關節(jié)炎(RA)的多成分、多靶點、多途徑作用機制。方法:將選取的目標化合物(即翼首草10個化學成分結構)采用相關軟件進行數據的導入和存儲，使用PharmMapper和DrugBank數據庫進行靶點預測和篩選，通過MAS 3.0數據庫對靶點進行通路獲取并分析，最后使用Cytoscape 3.4.0軟件構建翼首草“活性成分-靶點-通路”網絡。結果:將PharmMapper數據庫中獲得的靶點信息與DrugBank數據庫中與炎癥相關藥物的靶點進行比對，得到26個可能與翼首草治療RA相關的潛在作用靶點，其中MAPK14、RXRA、ALB、PDE4D、VDR等靶點可能是翼首草活性成分治療RA的主要潛在靶點基因群;26個作用靶點通過通路注釋后得到57條作用通路，除27條與RA相關外，還涉及與內分泌調節(jié)、免疫相關的其他30條作用通路。結論:根據網絡藥理學研究結果認為，翼首草可通過作用于炎癥、免疫、內分泌等相關的靶點及通路，發(fā)揮治療RA的作用。

藏藥翼首草;網絡藥理學;類風濕性關節(jié)炎;活性成分;靶點

類風濕性關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)在藏醫(yī)學中稱為“真布病”。藏醫(yī)對“真布病”的臨床治療，以干黃水，調節(jié)培根、隆等紊亂為重要途徑。藏醫(yī)臨床治療“真布病”注重內外合治，從飲食起居開始調節(jié)，使用藏醫(yī)獨特復方藥物配合藏藥浴、推拿按摩、放血、火炙等特色外治手段，對“真布病”的治療取得了獨具特色的臨床效果[1]。

翼首草(藏語名:榜姿多沃)[2]為川續(xù)斷科翼首花屬植物匙葉翼首花[Pterocephalushookeri(C.B.Clarke)H?e-ck]的干燥全草，是2015年版《中國藥典》(一部)[3]收載的常見藏藥，具有解毒除瘟、清熱止痢、祛風通痹的功效。翼首草用藥歷史悠久，在藏醫(yī)經典名著《四部醫(yī)典》[4]和《晶珠本草》[5]中均有記載。本課題組前期對其進行的化學成分和藥理作用研究表明，翼首草主要含有皂苷類和環(huán)烯醚萜類成分[6-10]，對佐劑炎癥模型動物具有明顯的改善作用。盡管目前對翼首草的藥理研究已有較多的報道，但針對翼首草治療RA的作用機制仍不清楚。因此，本文以網絡藥理學的方法對藏藥翼首草化學成分抗RA的作用機制進行全面探討，構建其“活性成分-靶點-通路”網絡，闡釋其治療RA可能的分子作用機制，為后續(xù)實驗研究提供一定的信息支撐，也為藏藥的研究提供一種新的思路與方法。

1 材料與方法

1.1 數據庫與軟件

UniProt數據庫(http://www.uniprot.org/uniprot/); Cytoscape 3.4.0軟件(http://www.cytoscape.org);Chem-BioOffice2014(美國PerkinElmer公司);PharmMapper數據庫(http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/);生物分子功能注釋系統(tǒng)數據庫(http://bioinfo.capitalbio.com/mas3/，MAS 3.0);DrugBank數據庫(http://www.drugbank.ca/);京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路數據庫(http://www.genome.jp/kegg/)。

1.2 目標化合物的選取

在網絡藥理學研究過程中，以3個標準選取目標化合物:(1)翼首草中含有的化學成分;(2)翼首草中已經定量的化學成分;(3)翼首草中可入血的化學成分。筆者查閱文獻[6，11-12]后，確定對翼首草中10個化合物(齊墩果酸、熊果酸、齊墩果酮酸、馬錢苷、獐牙菜苷、綠原酸、林生續(xù)斷苷Ⅰ、續(xù)斷苷B、大花雙參苷A、吳茱萸苷)進行研究。

1.3 化學成分結構數據的導入和存儲

使用ChemBioOffice 2014軟件繪制10個化學成分的結構，將其存為MDL sdf.格式。將建立的MDL sdf.格式文件導入ChemBio3D ultra軟件，轉換成3D形式，存儲為mol2格式。

1.4 潛在作用靶點反向預測分析

將10個活性成分的3D-mol2格式文件導入Pharm-Mapper數據庫進行潛在靶點的預測分析[13-14]，參數設置如下:Generate Conformers:Yes;Maximum Generated Conformations:100;Select Target Set:Human Protein TargetOnly;Number of Reserved Matched Targets:100。在檢索過程中得到的潛在靶點有命名不規(guī)范或錯誤等問題。因此，需采用UniProt KB搜索功能得到其正確名稱。經上述數據庫檢索和轉化操作，獲得與成分相關的蛋白或基因信息。

1.5 靶點的篩選

將預測得到的靶點信息與DrugBank數據庫中美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批準的抗RA藥物的靶點進行比對分析[15-16]，預測靶點中有明顯抗RA作用的靶點，并統(tǒng)計頻次[即某靶蛋白或靶基因在10個化學成分各100靶點(共計1 000個靶點)中出現的次數]，再對10個活性成分的靶基因和靶點數分別進行歸納，其中靶點數為去掉重復的靶基因后的數量。

1.6 相關通路獲取及分析

將獲取的靶點信息導入MAS 3.0中，得到靶點的相關通路信息后進行富集分析和通路注釋分析[17]。參數設置如下:Species:Homo sapiens(Human);Molecule Type: Protein;Database Symbols:UniProt KB;Functions:Disease，Gene，mRNA，Protein，GO，Pathway;Regulation Threshold:Up 2.0，Down 0.5。需要注意的是，靶點僅使用MAS 3.0、KEGG中的數據。

1.7 翼首草“活性成分-靶點-通路”網絡構建

以選取的10個化學成分、預測出的靶點和通路及通路注釋為節(jié)點(node)，建立相互關系，導入Cytoscape 3.4.0軟件，分析翼首草“活性成分-靶點-通路”的網絡圖[18]。在網絡中，節(jié)點表示活性成分、靶點和通路。若某一靶點為某化合物的潛在作用靶點，則以邊(edge)相連。

2 結果

2.1 翼首草化學成分的潛在靶點信息

將PharmMapper數據庫中獲得的靶點信息與Drug-Bank數據庫中與炎癥相關藥物的靶點進行比對，得到26個可能與翼首草治療RA的潛在作用相同的靶點，其中UniProt號、靶蛋白、靶基因和頻次見表1。

表1 翼首草化學成分的潛在靶點信息Tab 1 Information of potential targets from componentsof P.hookeri

由表1可見，頻次最高的靶點為有絲分裂原激活蛋白激酶14(MAPK14)，其次為視黃酸受體RXR-α (RXRA)，其他如ALB、PDE4D、VDR等頻次也較高，提示MAPK14、RXRA、ALB、PDE4D、VDR等是翼首草活性成分治療RA的主要潛在靶點基因群。

在表1的基礎上，對10個活性成分的靶基因和靶點數分別進行了歸納，結果見表2。

表2 翼首草化學成分的潛在靶基因、靶點數Tab 2 Potential target gene and target numbers from com ponentsof P.hookeri

齊墩果酸、熊果酸和齊墩果酮酸3個化合物的母核基本一致，均屬于三萜類化合物，齊墩果酸和熊果酸還互為同分異構體。由表2可知，齊墩果酸作用靶點數為14個，熊果酸為10個，齊墩果酮酸為13個。這3個化合物相同的作用靶點有8個，其中齊墩果酸與熊果酸有9個相同的靶點，齊墩果酸與齊墩果酮酸有10個相同的靶點，而熊果酸與齊墩果酮酸有9個相同的靶點。在10個活性成分的作用靶點數中，續(xù)斷苷B靶點數最多，為15個;馬錢苷靶點數最少，為6個;其他活性成分的靶點數也不盡相同?？梢娨硎撞莶煌瘜W成分不僅可作用于相同的靶點，也可作用于不同的靶點，體現了其多成分、多靶點的抗RA作用機制。

2.2 翼首草化學成分潛在靶點的通路注釋

將翼首草化學成分的26個作用靶點通過MAS 3.0及KEGG通路注釋，得到57條作用通路，其中27條與RA相關。(1)直接與關節(jié)炎相關通路6條，包括Toll樣受體信號通路、JAK-STAT信號通路、細胞因子受體相互作用、MAPK信號通路、黏著連接、嘌呤代謝。(2)與內分泌調節(jié)相關通路有18條，包括促性腺激素釋放素信號通路、PPAR信號通路、胰島素傳導通路、脂肪細胞因子信號通路、甲狀腺癌、神經活性配體-受體相互作用、肌動蛋白細胞骨架調節(jié)、T細胞受體信號通路、JAK-STAT信號通路、細胞因子受體相互作用、鈣離子信號通路、黏著連接、ErbB信號通路、細胞色素P450的異物代謝、MAPK信號通路、黏著斑、甘油酯代謝、視黃醇代謝。(3)與疼痛相關通路有6條，包括MAPK信號通路、鈣離子信號通路、JAK-STAT信號通路、VEGF信號通路、Toll樣受體信號通路、嘌呤代謝。(4)與炎癥相關通路有9條，包括Toll樣受體信號通路、細胞因子受體相互作用、JAK-STAT信號通路、MAPK信號通路、甘油酯代謝、VEGF信號通路、花生四烯酸代謝、黏著斑、FcεRI信號通路。(5)與免疫相關通路有15條，包括自身免疫性甲狀腺疾病、移植物抗宿主病、細胞因子受體相互作用、JAK-STAT信號通路、T細胞受體信號通路、鈣離子信號通路、神經活性的配體-受體相互作用、肌動蛋白細胞骨架的調節(jié)、Toll樣受體信號通路、m TOR信號通路、胰島素傳導通路、MAPK信號通路、嘌呤代謝、甘油酯代謝、脂代謝。

2.3 翼首草“活性成分-靶點-通路”網絡構建

采用Cytoscape 3.4.0軟件構建翼首草化學成分-靶點-通路網絡模型見圖1。其中26個靶點中20個比對到代謝通路上(維生素D3受體、血清白蛋白、性激素結合球蛋白、核受體亞家族1組Ⅰ成員2、SEC14-like蛋白2和甲硫氨酸胺基肽酶2除外)。

圖1 翼首草“活性成分-靶點-作用”通路網絡圖Fig 1 “Active com ponents-targets-pathways”network of P.hookeri

從圖1中可發(fā)現，除“2.2”項下提到的那些靶點，目標化合物還涉及到其他30條通路，如非小細胞肺癌、丙酮酸代謝、亞油酸代謝、膀胱癌、子宮內膜癌、前列腺癌、小細胞肺癌、胰腺癌等。因此，翼首草抗RA的作用機制與炎癥反應、免疫調節(jié)及內分泌激素等多種機制均有相關性，因此可從不同角度揭示翼首草抗RA的作用特點。

3 討論

網絡藥理學的概念最早由英國藥理學家Hopkins AL[19]于2007年首次提出，并于2008年進一步發(fā)表文章《網絡藥理學:藥物研發(fā)中的下一個研究模式》[20]，打破了“一個靶標、一種藥物”的傳統(tǒng)理念，而“多靶點、多途徑”的藥物設計也被眾多醫(yī)藥研究者所接受[21]。網絡藥理學本著整體性和動態(tài)性的特點，倡導多途徑、多靶點的給藥原則[20]。因此，在傳統(tǒng)藥物現代化進程中，可借鑒網絡藥理學的研究思路，探索藥物的作用機制，揭示其多成分、多靶點、多途徑的整體效應[22]。

白雨等[23]通過對同一藥物進行研究以比較Pharm-Mapper、HTDocking和SEPID數據庫預測結果的異同，結果發(fā)現PharmMapper數據庫預測方法更適合用于分析藥物的靶點信息。因此，本文采用PharmMapper數據庫的網絡藥理學方法闡釋翼首草“多成分、多靶點、多途徑”的作用機制。

既往研究結果表明，RA形成過程中JAK-STAT、MAPK、VEGF信號通路均被激活，其中MAPK信號轉導通路還包括了細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)、p38、JNK 3條重要的與關節(jié)炎癥相關的信號轉導通路[24]。另外，VEGF是參與調控血管發(fā)生和血管發(fā)生的關鍵分子，幾乎參與了RA發(fā)病的全過程。抗RA的藥物通過調節(jié)MAPK和VEGF信號通路來抑制炎癥細胞因子的產生和表達，來減少膠原蛋白的產生、抑制滑膜細胞增殖并減弱其侵襲能力，從而發(fā)揮抗RA的作用。

張明發(fā)等[25]發(fā)現，齊墩果酸和熊果酸可以抑制磷脂酶A2活性，阻滯花生四烯酸的產生，從而減少前列腺素和白三烯的生物合成，發(fā)揮抗炎的作用;徐英輝等[26]研究了綠原酸對佐劑性關節(jié)炎模型大鼠抗炎作用及其機制，發(fā)現綠原酸具有抗佐劑性關節(jié)炎的作用，并通過降低白細胞介素2水平發(fā)揮作用;Zhang L等[27]發(fā)現翼首草提取物具有抗炎鎮(zhèn)痛的作用;Guo C等[28]發(fā)現翼首草提取物通過抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡，具有一定的抗腫瘤作用，還可抑制肝癌細胞生長。綜合這些結果，可部分印證本研究的網絡預測結果。

在對潛在作用靶點的通路注釋中發(fā)現，翼首草中的化學成分都能作用于與免疫調節(jié)相關的通路，如MAPK、JAK-STAT、T細胞受體、鈣離子等信號通路，所以推測翼首草可能會通過調節(jié)機體免疫發(fā)揮輔助治療RA的作用。目前，關于這方面的研究還鮮有報道，仍需后續(xù)試驗的進一步證明。

本文以翼首草中10個化學成分為研究對象，基于網絡藥理學的方法，采用KEGG、MAS 3.0、DrugBank、PharmMapper等數據庫和Cytoscape 3.4.0軟件，探索了翼首草治療RA的靶點和機制;并通過網絡的構建，發(fā)現預測的靶點和通路與文獻報道的內容相吻合，再次證明了網絡藥理學預測的準確性，并初步揭示了翼首草治療RA的調控網絡，為下一步深入研究翼首草的作用機制奠定了基礎，也為藏藥的研究提供了新的思路和方法。

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Study on the Active Com ponents Targets of Tibetan M edicine Pterocephalus hookeri in Anti-rheumatoid Arthritis Based on Network Pharmacology

TANG Ce，WEN Jian，YANG Juan，ZUO Fang，MENG Xianli，ZHANG Yi(College of Ethnic Medicine，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611137，China)

OBJECTIVE:To explore the multi-component，multi-target，multi-channel mechanism of Tibetan medicine Pterocephalus hookeri in the treatment of rheumatoid arthritis(RA).METHODS:The selected target compounds(10 chemical structures of P.hookeri)were imported and stored by related software;target prediction and filtering were conducted by PharmMapper and DrugBank databases.The pathways of targetswere acquired and analyzed by MAS 3.0 database.Finally P.hookeri“active component-targeting-pathway”network was constructed by Cytoscape 3.4.0 software.RESULTS:The target information obtained in the PharmMapper database were compared w ith that of the DrugBank database for inflammation-related drugs，26 potential targets for the treatment of RA were obtained，in which MAPK14，RXRA，ALB，PDE4D，VDR may be themain potential target gene group in the treatment of RA.57 functional pathways were obtained after 26 functional targets were annotated by pathway.In addition to 27 RA-related pathways，30 other pathways such as endocrine regulation and immune were involved.CONCLUSIONS:Base on the study of network pharmacology，P.hookeri plays the role in the treatment of RA by acting on inflammation，immune，endocrine and related targets and pathways.

Tibetanmedicine Pterocephalus hookeri;Network pharmacology;Rheumatoid arthritis;Active components;Target

R285

A

1001-0408(2017)19-2666-05

2016-10-12

2016-12-07)

(編輯:劉 萍)

國家自然科學基金面上項目(No.81274193);四川省教育廳省屬高?？蒲袆?chuàng)新團隊建設計劃項目(No.11TD004)

＊博士研究生。研究方向:中藥藥效物質基礎及質量標準化。電話:028-61800274。E-mail:409014182@qq.com

#通信作者:研究員，博士生導師。研究方向:民族藥藥效物質基礎。電話:028-61800274。E-mail:9006zmy@sina.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.19.21