顧媛媛，趙潤琴，石 朗，張允菲，馮 程，方 芳，張淑香，王連芝，陳大忠(.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，哈爾濱 50040;.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室，哈爾濱 50040)

雞冠花正丁醇萃取物改善大鼠功能失調(diào)性子宮出血的機(jī)制研究Δ

顧媛媛1＊，趙潤琴2#，石 朗2，張允菲1，馮 程1，方 芳1，張淑香1，王連芝1，陳大忠1(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室，哈爾濱 150040)

目的:研究雞冠花正丁醇萃取物對大鼠功能失調(diào)性子宮出血的改善作用，并探討其作用機(jī)制。方法:將60只受孕SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、宮血寧膠囊組(陽性對照，0.07 g/kg)和雞冠花正丁醇萃取物高、中、低劑量組(4.32、2.16、1.08 g/kg)，每組10只。除空白組外，其余各組大鼠均在妊娠第7天ig米非司酮溶液和米索前列醇溶液造成不完全流產(chǎn)，以復(fù)制功能失調(diào)性子宮出血模型。從妊娠第8天開始，給藥組大鼠ig相應(yīng)藥物，空白組和模型組大鼠ig等體積生理鹽水，每天早、晚各給藥1次，連續(xù)7 d。給藥結(jié)束后，測定大鼠子宮出血量以及血清中血栓素(TXA2)、前列環(huán)素(PGI2)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量。結(jié)果:與空白組比較，模型組大鼠子宮出血量顯著增加(P＜0.01)，血清中TXA2含量顯著減少、PGI2和TNF-α含量顯著增加(P＜0.01)。與模型組比較，各給藥組大鼠的子宮出血量均顯著減少、血清中TXA2含量均顯著增加(P＜0.01);宮血寧膠囊組和雞冠花正丁醇萃取物高劑量組大鼠血清中PGI2、TNF-α含量，以及雞冠花正丁醇萃取物中劑量組大鼠血清中TNF-α含量均顯著減少(P＜0.01)。結(jié)論:雞冠花正丁醇萃取物對藥物流產(chǎn)不全致大鼠功能失調(diào)性子宮出血有明顯的改善作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)TXA2/PGI2動態(tài)平衡、抑制TNF-α的過度分泌有關(guān)。

雞冠花;正丁醇萃取物;功能失調(diào)性子宮出血;止血;大鼠

雞冠花始載于《嘉佑本草》，為莧科青葙屬植物雞冠花(Celosia cristata L.)的干燥花序，其味甘、澀，性涼，歸肝、大腸經(jīng)，功效為收斂止血、止帶、止痢[1]。據(jù)《本草綱目》記載:“雞冠花可治療痔漏下血，齒白下痢，崩中等”，適用于功能失調(diào)性子宮出血、產(chǎn)后出血、吐血、崩漏、血淋、便血等病癥[2]，為婦科常用之良藥。有研究資料表明，雞冠花具有較好的涼血、止血作用，對功能失調(diào)性子宮出血具有較好的療效[3]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，雞冠花具有較好的止血、凝血作用，且確定雞冠花正丁醇萃取物為有效部位，故本研究建立大鼠子宮出血模型，研究雞冠花正丁醇萃取物對大鼠功能失調(diào)性子宮出血的止血作用及作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

UV-1800紫外分光光度儀(日本島津公司);JA2003精密電子天平(上海良平儀器廠);Thermo MK3酶標(biāo)儀(美國塞默飛世爾科技有限公司);Nikon Eclipse TE2000-E倒置顯微鏡[尼康(上海)儀器有限公司];TDL-60B低速臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 藥材、藥品與試劑

雞冠花采摘于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)王振月教授鑒定為莧科青葙屬植物雞冠花(Celosia cristata L.)的干燥花序;宮血寧膠囊(云南白藥集團(tuán)股份有限公司，批號:ZGA1605，規(guī)格:0.13 g/粒);米非司酮片(批號:43160303，規(guī)格:25mg/片)、米索前列醇片(批號:43160303，規(guī)格:0.2mg/片)均購自華潤紫竹藥業(yè)有限公司;血栓素(TXA2，批號:201609)、前列環(huán)素(PGI2，批號:201609)、腫瘤壞死因子α(TNF-α，批號:201609)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒均由天津子涵生物科技有限公司提供;其余試劑均為化學(xué)純。

1.3 動物

SPF級健康SD大鼠120只[♀:90只，體質(zhì)量(250± 10)g;♂:30只，體質(zhì)量(280±20)g]，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價中心提供，合格證號:SCXK(黑) 2013-004。

2 方法

2.1 雞冠花正丁醇萃取物的制備

將雞冠花干燥花序粗粉加8倍量的95%乙醇回流提取3次，每次2 h，提取液減壓濃縮，用水混懸后，再分別用等體積的二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取3次，取正丁醇萃取液減壓回收溶劑，得到正丁醇萃取物干浸膏(每1 g干浸膏相當(dāng)于原藥材30.50 g)，備用。

2.2 造模、分組與給藥

將大鼠按♀∶♂為2∶1～3∶1的比例合籠，次日進(jìn)行陰道涂片檢查，若發(fā)現(xiàn)精子或陰栓表示受孕成功，作為妊娠第1天;若未受孕，待下次繼續(xù)合籠受孕。取受孕成功的♀鼠60只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，每組10只，分別為空白組、模型組、宮血寧膠囊組和雞冠花正丁醇萃取物高、中、低劑量組。除空白組外，其余各組大鼠分別于妊娠第7天ig米非司酮溶液(上午8:00，8.3mg/kg)和米索前列醇溶液(下午18:00，0.1mg/kg)，造成早孕大鼠不完全流產(chǎn)的功能失調(diào)性子宮出血模型[4-5];同時于♀鼠陰道內(nèi)置入消毒棉球，吸收子宮出血物，次日分別于早、晚將棉球取出，放入封口袋中，于4℃冰箱冷藏保存，每天更換2次新棉球，直至妊娠第14天。從妊娠第8天開始，宮血寧膠囊組大鼠ig宮血寧膠囊0.07 g/kg(蒸餾水溶解，按臨床的等效劑量換算而得);雞冠花正丁醇萃取物高、中、低劑量組大鼠分別ig雞冠花正丁醇萃取物4.32、2.16、1.08 g/kg(分別按臨床劑量的4、2、1倍換算而得);空白組和模型組大鼠ig等體積(5m L)的蒸餾水，每天早、晚各給藥1次，連續(xù)7 d。

2.3 大鼠子宮出血量的測定

末次給藥后1 h將大鼠麻醉，下腔靜脈取血20μL，加入5%NaOH溶液4m L[6]，用移液槍混勻，以5%NaOH溶液調(diào)零，采用紫外分光光度儀于546 nm波長處測定靜脈血吸光度(A)值。將每只大鼠子宮出血棉球收集后置于燒杯內(nèi)，根據(jù)出血量的情況酌情加入5%NaOH溶液[7]，浸漬提取24 h后，測定浸漬液的A值，計算子宮出血量:子宮出血量(m L)=靜脈血量×(子宮浸提液A值× V2)/(靜脈血A值×V1)，其中V1為稀釋靜脈血所用的NaOH溶液的體積(4m L)，V2為浸提子宮血所用NaOH溶液的體積。

2.4 大鼠血清中TXA2、PGI2和TNF-α含量的測定

烏拉坦麻醉大鼠后下腔靜脈取血2m L，以離心半徑為10 cm、3 500 r/min離心20min，取上清，按照試劑盒說明書，采用ELISA法測定血清中TXA2、PGI2和TNF-α的含量。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 雞冠花正丁醇萃取物對大鼠子宮出血量的影響

與空白組比較，模型組大鼠子宮出血量顯著增加(P＜0.01);與模型組比較，宮血寧組和雞冠花正丁醇萃取物各劑量組大鼠子宮出血量均顯著減少(P＜0.01)，結(jié)果詳見表1。

表1 各組大鼠子宮出血量測定結(jié)果(±s，n=10)Tab 1 Determ ination results of uterine bleeding amountof rats in each grou(p±s，n=10)

表1 各組大鼠子宮出血量測定結(jié)果(±s，n=10)Tab 1 Determ ination results of uterine bleeding amountof rats in each grou(p±s，n=10)

注:與空白組比較，＊＊P＜0.01;與模型組比較，##P＜0.01Note:vs.blank group，＊＊P＜0.01;vs.modelgroup，##P＜0.01

組別空白組模型組宮血寧膠囊組雞冠花正丁醇萃取物高劑量組雞冠花正丁醇萃取物中劑量組雞冠花正丁醇萃取物低劑量組子宮出血量，mL 0.0724±0.0111 0.7807±0.0998＊＊0.4881±0.0716##0.1872±0.0193##0.4856±0.1347##0.5326±0.1167##劑量，g/kg 0.07 4.32 2.16 1.08

3.2 雞冠花正丁醇萃取物對大鼠血清中TXA2、PGI2和TNF-α含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清中TXA2含量顯著減少(P＜0.01)，PGI2、TNF-α含量顯著增加(P＜0.01);與模型組比較，各給藥組大鼠血清中TXA2含量均顯著增加(P＜0.01)，宮血寧膠囊組和雞冠花正丁醇萃取物高劑量組大鼠血清中PGI2含量均顯著減少(P＜0.01)，宮血寧組和雞冠花正丁醇萃取物高、中劑量組大鼠血清中TNF-α含量均顯著減少(P＜0.01)，結(jié)果詳見表2。

表2 各組大鼠血清中TXA2、PGI2、TNF-α含量測定結(jié)果(±s，n=10，ng/L)Tab 2 Determ ination resultsof TXA2，PGI2and TNF-α contents in serum of rats in each group(±s，n=10，ng/L)

表2 各組大鼠血清中TXA2、PGI2、TNF-α含量測定結(jié)果(±s，n=10，ng/L)Tab 2 Determ ination resultsof TXA2，PGI2and TNF-α contents in serum of rats in each group(±s，n=10，ng/L)

注:與空白組比較，＊＊P＜0.01;與模型組比較，##P＜0.01Note:vs.blank group，＊＊P＜0.01;vs.modelgroup，##P＜0.01

組別空白組模型組宮血寧膠囊組雞冠花正丁醇萃取物高劑量組雞冠花正丁醇萃取物中劑量組雞冠花正丁醇萃取物低劑量組TNF-α 94.86±9.88 185.56±17.52＊＊96.99±9.07##114.74±11.47##144.61±13.52##158.27±15.97劑量，g/kg 0.07 4.32 2.16 1.08 TXA2161.81±29.01 89.82±12.43＊＊139.45±25.35##145.61±22.39##123.70±21.32##108.31±18.44##PGI245.03±13.71 81.45±11.24＊＊63.03±14.22##61.44±7.30##75.78±12.70 79.88±11.84

4 討論

功能失調(diào)性子宮出血為婦科急癥之一，在中醫(yī)學(xué)中屬于“崩漏”范疇[8]，多由于脾虛不能統(tǒng)血、沖任失固所致，若時日持久，則耗傷氣血，使病情加重難以治愈。本研究采用ig米非司酮溶液和米索前列醇溶液的方法建立早孕大鼠子宮出血模型，可用于功能失調(diào)性子宮出血治療藥物的篩選和評價。宮血寧膠囊對子宮出血具有較好的治療作用，且對子宮內(nèi)膜有明顯的修復(fù)作用，臨床應(yīng)用廣泛，再結(jié)合文獻(xiàn)[9]報道確定其為本研究的陽性藥物。

在前列腺素類物質(zhì)中，TXA2是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的血管收縮劑，其由血小板產(chǎn)生，具有強(qiáng)烈的血小板聚集及血管收縮作用;同時其可使血小板膜上的腺苷環(huán)化酶受到抑制，減少環(huán)腺苷酸的生成，促使血小板活化，從而促進(jìn)血栓形成。PGI2則是作用較強(qiáng)的血管舒張劑，主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞中產(chǎn)生，能夠較強(qiáng)地抑制血小板聚集，又能夠使已聚集的血小板溶散，是目前已知的抑制血小板聚集最強(qiáng)的物質(zhì)。TXA2/PGI2是體內(nèi)的一對動態(tài)平衡因子，對維持血小板內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、控制正常的止血機(jī)制及防止血栓形成具有重要意義，若此比例失衡，可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜出血或異常出血[10-11]。本研究結(jié)果顯示，高劑量雞冠花正丁醇萃取物能顯著升高造模大鼠血清中TXA2含量，降低血清中PGI2含量。TNF-α是炎癥反應(yīng)過程中重要的促炎因子，可激活多種炎性信號通路，與多種免疫炎癥性疾病有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，高、中劑量雞冠花正丁醇萃取物均能顯著降低造模大鼠血清中TNF-α含量。

綜上所述，雞冠花正丁醇萃取物對大鼠功能失調(diào)性子宮出血具有明顯改善作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)TXA2/ PGI2動態(tài)平衡和抑制TNF-α的過度分泌有關(guān)。

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Study on the M echanism of Celosia cristata N-butanol Extracts in the Im provement of Dysfunctional Uterine Bleeding of Rats

GU Yuanyuan1，ZHAO Runqin2，SHI Lang2，ZHANG Yunfei1，F(xiàn)ENG Cheng1，F(xiàn)ANG Fang1，ZHANG Shuxiang1，WANG Lianzhi1，CHEN Dazhong1(1.Research Institute of TCM，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China;2.Preparation Room，the First A ffiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China)

OBJECTIVE:To study the improvement effect of Celosia cristata n-butanol extracts on dysfunctional uterine bleeding of rats，and explore itsmechanism.METHODS:60 pregnant SD rats were random ly divided into blank group，model group，Gongxuening capsule group(positive control，0.07 g/kg)and C.cristata n-butanol extracts high-dose，medium-dose，low-dose groups(4.32，2.16，1.08 g/kg)，10 in each group.Except for the blank group，rats in other groups were intragastrically given m ifepristone and m isoprostol on 7th of pregnancy for resulting incomplete abortion to inducemodels of dysfunctional uterine bleeding. Then rats in administration groups were intragastrically given relevantmedicines，rats in blank group and model group were intragastrically given normal saline once every morning and evening，for 7 d.On 8th d of pregnancy，uterine bleeding amount，and thromboxane(TXA2)，prostacyclin(PGI2)and tumor necrosis factorα(TNF-α)contents in serum were determ ined.RESULTS: Compared w ith blank group，uterine bleeding amount in model group was significantly increased(P＜0.01)，TXA2content in serum was significantly reduced，PGI2and TNF-αcontentswere significantly increased(P＜0.01).Compared w ithmodel group，uterine bleeding amounts in adm inistration groups were significantly reduced，TXA2content in serum was significantly increased(P＜0.01);PGI2and TNF-αcontents in serum in Gongxuening capsule group and C.cristata n-butanol extracts high-dose group and TNF-αcontent in serum in C.cristata n-butanol extracts medium-dose group were significantly reduced(P＜0.01).CONCLUSIONS:C.cristata n-butanol extracts show obvious improvement effect on incomplete drug abortion-induced dysfunctional uterine bleeding of rats，and themechanism may be related to the regulation of TXA2/PGI2dynamic balance and inhibition of TNF-αtransient secretion.

Celosia cristata;N-butanol extracts;Dysfunctional uterine bleeding;Hemostasis;Rats

R711;R285

A

1001-0408(2017)19-2617-03

2017-01-07

2017-03-21)

(編輯:林 靜)

黑龍江省中醫(yī)藥科研項目(No.ZHY16-101);黑龍江省自然科學(xué)基金面上項目(No.H201468)

＊助理研究員，博士。研究方向:中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及分子機(jī)制。電話:0451-87267072。E-mail:yuanwas@163.com

#通信作者:副主任藥師，碩士。研究方向:中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。E-mail:1577268711@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.19.07