張 玲， 王得華， 馬 義， 徐漢虹

(1暨南大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 廣東 廣州510632; 2天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點實驗室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院, 廣東 廣州 510642)

印楝素對min6細胞增殖及胰島素分泌的影響

張 玲1,2， 王得華1， 馬 義1， 徐漢虹2

(1暨南大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 廣東 廣州510632; 2天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點實驗室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院, 廣東 廣州 510642)

【目的】研究印楝素對min6細胞增殖、葡萄糖攝取及胰島素分泌的影響，并探討其作用機制?！痉椒ā坎煌瑵舛扔￠靥幚韒in6細胞48 h，檢測細胞增殖量。在5.5和25.0 mmol·L-1葡萄糖條件下，檢測印楝素處理細胞的葡萄糖攝取水平，胰島素ELISA檢測試劑盒檢測細胞胰島素的分泌?！窘Y(jié)果】與對照組相比，在5.5和25.0 mmol·L-1葡萄糖條件下，印楝素均表現(xiàn)促進細胞增殖活性。印楝素處理下，與25.0 mmol·L-1葡萄糖條件相比，5.5 mmol·L-1葡萄糖表現(xiàn)出更顯著地促進葡萄糖攝取和胰島素分泌的作用?！窘Y(jié)論】印楝素可能通過調(diào)控葡萄糖水平影響胰島素的分泌。

印楝素； min6細胞； 細胞增殖； 胰島素分泌； ELISA檢測

印楝素是從印楝AzadirachtaIndica種子中提取的檸檬素類化合物，屬于四環(huán)三萜類化合物，包括10多個結(jié)構(gòu)類似物[1]。印楝素對生長發(fā)育的調(diào)控表現(xiàn)為抑制昆蟲的生長發(fā)育和干擾昆蟲的內(nèi)分泌導(dǎo)致其變態(tài)發(fā)育異常[2-3]。印楝素對昆蟲的生長發(fā)育的調(diào)控可能涉及多種因素，印楝素能明顯地影響昆蟲體內(nèi)糖、蛋白質(zhì)和脂肪的合成代謝，影響內(nèi)源激素的調(diào)控途徑[4-5]。在昆蟲生長發(fā)育中，胰島素信號通路參與調(diào)控營養(yǎng)代謝物，間接調(diào)控昆蟲的變態(tài)生長發(fā)育[6-7]。在前期研究中，天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點實驗室通過對印楝素作用下的昆蟲幼蟲和離體細胞差異表達基因/蛋白文庫分析，提出了印楝素可能通過營養(yǎng)-胰島素信號(IIS)途徑調(diào)控昆蟲生長發(fā)育[6]。

哺乳動物的胰島素是機體中促進合成和代謝的多肽類激素。胰島β細胞是胰島素合成和分泌的主要場所，調(diào)控機體中糖、脂肪及蛋白質(zhì)代謝等[8-9]。胰島β細胞合成和分泌胰島素受到營養(yǎng)物質(zhì)等多種因素的調(diào)控，葡萄糖是最主要的調(diào)控因子[10]。本研究在胰島β細胞min6 細胞水平，研究印楝素對胰島素信號途徑的影響，通過印楝素對葡萄糖和胰島素的調(diào)控，探討印楝素可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠胰島瘤細胞min6細胞，采用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(分別含5.5和25.0 mmol·L-1葡萄糖)培養(yǎng)，15%(φ)胎牛血清臨用前添加， 加入胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、0.1 mg·mL-1鏈霉素、50 μmol·L-1β-巰基乙醇，調(diào)節(jié)pH 至7.35～7.45，在37 ℃，5%(φ) CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。

印楝素從印楝素種子中提取，其中印楝素A質(zhì)量分?jǐn)?shù)>90%，由天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點實驗室提供。DMEM培養(yǎng)液、0.05%(φ)胰酶-EDTA、胎牛血清均購自Gibco 公司;D-(+) -葡萄糖、2β-巰基乙醇、DMSO，購自Sigma 公司。ELISA胰島素試劑盒購自Linco公司。

KRBH 緩沖液 (1 L)：NaCl 7.54 g；KCl 0.36 g；MgSO40.15 g；KH2PO40.16g；CaCl20.28 g；NaHCO30.42 g；BSA 1.00 g；HEPES 2.38 g；去離子水 1 L，磁力攪拌器混勻后，調(diào)節(jié) pH 7.4，過濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 細胞增殖測定 用MTT 法檢測印楝素對min6 細胞增殖活性的影響。取對數(shù)生長期的min6 細胞，調(diào)整濃度為 2×105mL-1，接種至96 孔板中，每孔加入DMEM 完全培養(yǎng)液150 μL，培養(yǎng)24 h，細胞貼壁后，棄培養(yǎng)液，PBS緩沖液洗2 次。加入印楝素200 μg·mL-1150 μL，順序加入倍半稀釋濃度，培養(yǎng)48 h 后，每孔加CCK8 20 μL，繼續(xù)孵育4 h; 孵育4 h 后小心吸棄上清液，每孔加入150 μL 的DMSO，振蕩10 min。酶標(biāo)儀測定570 nm的光密度值。

1.2.2 min6細胞葡萄糖攝取量測定 將min6細胞以 2×105個細胞接種于 12 孔培養(yǎng)板中，細胞貼壁后，棄去板中培養(yǎng)基，用 KRBH 緩沖液輕柔地洗2次，再用含 100 μg 印楝素的 KRBH 緩沖液繼續(xù)孵育2 h。然后，加入5.5和25.0 mmol·L-1的葡萄糖孵育20 min，收集上清液，通過檢測上清液中葡萄糖的含量反映細胞對葡萄糖的吸收。

1.2.3 min6細胞內(nèi)胰島素含量的測定 取對數(shù)生長期的細胞，消化后計數(shù)，調(diào)整細胞密度至2× 105L-1，接種于12孔板， 24 h 后棄細胞培養(yǎng)基，用 KRBH 緩沖液輕柔地洗2次，再用 KRBH 預(yù)孵育 2 h，使細胞對葡萄糖致敏。然后，換用新鮮的 KRBH 緩沖液分別加入0、50、100、150、200 μg·mL-1印楝素， 以及5.5 或者25.0 mmol·L-1葡萄糖繼續(xù)孵育 1 h，收集上清液，ELISA胰島素試劑盒測定胰島素的含量。

以上試驗均重復(fù)6次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 17. 0 統(tǒng)計軟件對試驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用方差分析和t檢驗進行差異顯著性分析。應(yīng)用Sigmaplot 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 印楝素對min6細胞增殖的影響

不同濃度印楝素分別作用于高糖培養(yǎng)基(25.0 mmol·L-1葡萄糖)和低糖培養(yǎng)基(5.5 mmol·L-1葡萄糖)培養(yǎng)的min6 細胞，48 h 后檢測細胞存活率。試驗結(jié)果如圖1所示。不同濃度印楝素分別處理 48 h后，采用CCK8檢測min6細胞的存活狀態(tài)。由圖1可知，min6細胞在高糖和低糖培養(yǎng)基條件下均生長良好，印楝素均表現(xiàn)出促進增殖活性，且表現(xiàn)出一定的濃度依賴性。印楝素質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1時，在低糖培養(yǎng)基中，增殖率提高20%，而在高糖培養(yǎng)基中，增殖率提高13%。

2.2 印楝素對min6細胞葡萄糖攝取的影響

min6細胞過夜培養(yǎng)，加入緩沖溶液饑餓 2 h 后，分別在5.5和25.0 mmol·L-1葡萄糖新鮮的KRBH緩沖溶液中，用100 μg·mL-1印楝素處理，繼續(xù)培養(yǎng) 20 min，取上清檢測培養(yǎng)基中葡萄糖的含量。

試驗結(jié)果如圖2所示，在低糖培養(yǎng)條件下，印楝素處理組培養(yǎng)基中葡萄糖濃度與無藥物處理組相比明顯降低，試驗檢測葡萄糖濃度降低11%，表明細胞對葡萄糖的攝取量增加，間接表明印楝素可以促進胰島β細胞對葡萄糖的吸收。而在無糖對照組中，印楝素處理組與未用藥組沒有顯著差異。在高糖培養(yǎng)條件下，印楝素處理組培養(yǎng)基中葡萄糖濃度降低，與未用藥組比較差異不顯著。

圖1 印楝素對min6細胞增殖的影響Fig.1 Effect of azadirachtin on proliferation of min6 cells

* 表示處理與對照差異顯著(P<0.05，DMRT法)。

2.3 印楝素對min6細胞胰島素分泌的影響

min6細胞培養(yǎng)24 h后，用KRBH緩沖溶液孵育使細胞對葡萄糖致敏，檢測不同溶度印楝素處理下胰島素的含量。試驗結(jié)果表明，當(dāng)min6細胞在5.5 mmol·L-1葡萄糖環(huán)境中，印楝素對細胞的胰島素分泌產(chǎn)生影響，如圖3a所示，當(dāng)印楝素的濃度為50、100、150 μg·mL-1時，胰島素的分泌量先隨濃度增加，與無藥對照組相比差異顯著(P<0.05)。然后在印楝素濃度200 μg·mL-1胰島素分泌量增加有所下降，與對照差異不顯著。 當(dāng)印楝素為100 μg·mL-1時，胰島素分泌量增加25%。

當(dāng)min6細胞處于25.0 mmol·L-1葡萄糖環(huán)境中，印楝素同樣表現(xiàn)為促細胞胰島素分泌，如圖3b所示，與低葡萄糖試驗組同樣的4個印楝素處理濃度，胰島素分泌增加較少，同樣隨印楝素處理濃度增加而胰島素分泌量增加。與低葡萄糖濃度刺激相比，在高葡萄糖濃度刺激下，印楝素處理組促胰島素的分泌量相對較低。

分泌的胰島素以每小時計，* 表示處理與對照差異顯著(P<0.05，DMRT法)。

3 討論與結(jié)論

昆蟲min6細胞系是胰島素分泌研究中常用的細胞模型，該模型已經(jīng)具備完善的研究方法和理論基礎(chǔ)，在該細胞模型中研究印楝素處理下對葡萄糖以及胰島素分泌的影響，可為后續(xù)的昆蟲體系的試驗提供理論參考。

在β細胞中，營養(yǎng)因子葡萄糖是刺激胰島素分泌的最主要因素。葡萄糖由葡萄糖轉(zhuǎn)運載體轉(zhuǎn)運進入胰島β細胞，參與生物體血糖的調(diào)節(jié)，因而細胞中影響葡萄糖代謝的影響因子均對胰島素的分泌產(chǎn)生影響。因此，選擇胰島β細胞作為研究印楝素對營養(yǎng)因子及其相關(guān)信號調(diào)控的研究體系。

在本研究中試驗結(jié)果顯示不同濃度的印楝素，在5.5和25.0 mmol·L-1葡萄糖培養(yǎng)基中，均表現(xiàn)出對胰島β細胞不同程度的促增殖作用。在5.5 mmol·L-1葡萄糖培養(yǎng)基中促增殖作用更加顯著。同時，印楝素在低葡萄糖和高葡萄糖環(huán)境下能夠促進細胞對葡萄糖的吸收，在5.5 mmol·L-1低葡萄糖條件細胞攝取更多的葡萄糖。而糖的吸收和代謝是葡萄糖依賴的胰島素分泌的主要影響因素。影響葡萄糖在β細胞代謝中的因素均可影響到胰島素的分泌。試驗結(jié)果顯示，檢測不同濃度印楝素處理的細胞胰島素分泌水平，在5.5 mmol·L-1低糖培養(yǎng)基中，胰島素分泌水平增加，這與相同條件下試驗檢測的葡萄糖攝取水平一致。作為葡萄糖依賴的胰島素分泌，胰島素的分泌主要受葡萄糖的刺激影響，葡萄糖的攝取量增加直接導(dǎo)致胰島素的分泌增加。試驗結(jié)果顯示印楝素在低葡萄糖環(huán)境中促進細胞對葡萄糖的吸收，促進胰島素的分泌，進而推斷印楝素的作用可能是調(diào)控葡萄糖的吸收，間接的產(chǎn)生葡萄糖刺激胰島素分泌的響應(yīng)。而在高葡萄糖環(huán)境中，印楝素促葡萄糖吸收作用減弱，胰島素分泌量沒有顯著的增加。試驗結(jié)果表明，印楝素作用的胰島β細胞中，胰島素的分泌和印楝素作用下葡萄糖的吸收結(jié)果一致。因此可以推斷印楝素可能是通過調(diào)控細胞內(nèi)葡萄糖濃度，進而影響到細胞胰島素的釋放，而不是簡單作用于胰島素及其受體本身。

在之前的文獻報道中，印楝素在多種細胞上均表現(xiàn)出抑制細胞生長作用。在昆蟲細胞中，印楝素表現(xiàn)出明顯的抑制生長和誘導(dǎo)凋亡[11-12]。在哺乳動物細胞中，文獻報道印楝素提取物也表現(xiàn)出抑制細胞增殖，誘導(dǎo)凋亡等[13-14]。在子宮癌Hela細胞系中，印楝素顯著地抑制細胞的增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡[14]。因而，印楝素通常情況下具有抑制細胞的生長作用。本研究結(jié)果表明，min6細胞在葡萄糖存在條件下，印楝素表現(xiàn)出促增殖活性，促進細胞對葡萄糖的攝取以及細胞胰島素的分泌，因而推斷在min6細胞中印楝素調(diào)控胰島素分泌可能與印楝素調(diào)控抑制細胞生長和誘導(dǎo)凋亡的機制不同。在胰島β細胞中，葡萄糖-胰島素信號途徑為主要的調(diào)控通路，而細胞生長是通過PI3K信號通路調(diào)控的，因而印楝素在胰島β細胞中可能是通過調(diào)節(jié)葡萄糖合成和代謝中的靶標(biāo)，達到調(diào)控葡萄糖吸收的目的，間接地調(diào)控細胞內(nèi)胰島素的釋放。

文獻報道番石榴酸在Ins-1胰島β細胞中表現(xiàn)相似的促細胞增殖活性和影響胰島素合成和分泌的作用[15]。番石榴酸結(jié)構(gòu)上屬于羥基萜類化合物，鑒于印楝素與羥基萜類化合物在結(jié)構(gòu)上的相似性，該類化合物在葡萄糖-胰島素調(diào)控中的作用機制研究可以成為印楝素進一步研究的參考。

[1] BUTTERWORTH J H, MORGAN E D. Isolation of a substance that suppresses feeding in locusts[J]. J Chem Soc Chem Commun, 1968(1): 23-24.

[2] 李曉東, 趙善歡. 印楝素對昆蟲的毒理作用機制[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 1995, 17(1): 118-122.

[3] MORGAN E D. Azadirachtin, a scientific gold mine[J]. Bioorg Med Chem, 2009, 17: 4096-4105.

[4] MORDUE A J, BLACKWELL A. Azadirachtin: An update[J]. J Insect Physiol, 1993, 39: 903-924.

[5] 查友貴, 徐漢虹. 印楝及印楝生物農(nóng)藥[J]. 世界農(nóng)藥, 2003, 25(4): 29-30.

[6] LAI D, JIN X, WANG H, et al. Gene expression profile change and growth inhibition inDrosophilalarvae treated with azadirachtin[J]. J Biotechnol, 2014, 185: 51-56.

[7] WANG H, LAI D, YUAN M, et al. Growth inhibition and differences in proteinpro files in azadirachtin-treatedDrosophilamelanogasterlarvae[J]. Electrophoresis, 2014, 35(8): 1122-1129.

[8] RITZEL R A. Therapeutic approaches based on beta-cell mass preservation and/or regeneration[J]. Front Biosci, 2009, 14: 1835-1850.

[9] WEIR G C, BONNER-WEIR S. Isletβcell mass in diabetes and how it relates to function, birth, and death[J]. Ann NY Acad Sci, 2013, 1281(1): 92-105.

[10]GEMBAL M, GILON P, HENQUIN J C. Evidence that glucose can control insulin release independently from its action on ATP-sensitive K+channels in mouseβcells[J]. J Clin Invest, 1992, 89(4): 1288-1295.

[11]程杏安, 黃勁飛, 胡美英, 等. 印楝素A誘導(dǎo)Sf9細胞凋亡的顯微和超微形態(tài)變化[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2010, 31(4): 52-58.

[12]HUANG J F, SHUI K J, LI H Y, et al. Antiproliferative effect of azadirachtin A onSpodopteralituraSl-1 cell line through cell cycle arrest and apoptosis induced by up-regulation of p53[J]. Pestic Biochem Physiol, 2011, 99(1): 16-24.

[13]MAHAPATRA S, KARNES R J, HOLMES M W, et al. Donkena, novel molecular targets ofAzadirachtaindicaassociated with inhibition of tumor growth in prostate cancer[J]. The AAPS J, 2011, 13: 365-377.

[14]GUNADHARINI D N, ELUMALAI P, ARUNKUMAR R, et al. Induction of apoptosis and inhibition of PI3K/Akt pathway in PC-3 and LNCaP prostate cancer cells by ethanolic neem leaf extract[J]. J Ethnopharmacol, 2011, 134(3): 644-650.

[15]王婧茹, 趙晶晶, 葉春玲, 等. 番石榴葉總?cè)茖? 型糖尿病大鼠的降血糖和血脂作用[J]. 中國病理生理雜志, 2012, 28(6): 1109-1113.

【責(zé)任編輯 霍 歡】

Effects of azadirachtin on proliferation and insulin secretion of min6 cells

ZHANG Ling1,2, WANG Dehua1, MA Yi1, XU Hanhong2

(1 College of Life Science and Technology, Jinan University,Guangzhou 510632，China; 2 Key Laboratory of Natural Pesticide and Chemical Biology, Ministry of Education/ College of Agriculture，South China Agricultural University, Guangzhou 510642，China)

【Objective】 To investigate the effects of azadirachtin on cell proliferation，glucose uptake and insulin secretion in min6 cells and their possible mechanisms． 【Method】 The min6 cells were culturedinvitroand treated with various concentrations of azadirachtin for 48 h．Cell proliferation was measured. In the presence of 5.5 and 25.0 mmol·L-1glucose，glucose uptake was measured and insulin secretion in min6 cells were detected by the insulin ELISA kit. 【Result】 Azadirachtin promoted the proliferation of min6 cells in the presence of 5.5 and 25.0 mmol·L-1glucose compared to the control group. Compared with the 25.0 mmol·L-1glucose condition，azadirachtin in the presence of 5.5 mmol·L-1glucose more significantly promoted glucose uptake and insulin secretion in min6 cells. 【Conclusion】Azadirachtin could affect insulin secretion by regulating glucose concentration.

azadirachtin; min6 cells; cell proliferation; insulin secretion; ELISA test

2017- 03- 03 優(yōu)先出版時間：2017- 06-21

張 玲(1970—)，女，助理研究員，博士，E-mail：tzl@jnu.edu.cn；通信作者：徐漢虹(1961—)，男，教授，博士，E-mail： hhxu@scau.edu.cn

廣東省自然科學(xué)基金(2015A030313333)

S511； S502

A

1001- 411X(2017)04- 0025- 05

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170621.1923.008.html

張 玲， 王得華， 馬 義， 等.印楝素對min6細胞增殖及胰島素分泌的影響[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2017,38(4):25- 29.