徐漢虹， 賴 多， 張志祥

(1天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 果樹研究所/農(nóng)業(yè)部南亞熱帶果樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640)

植物源農(nóng)藥印楝素的研究與應(yīng)用

徐漢虹1， 賴 多2， 張志祥1

(1天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 果樹研究所/農(nóng)業(yè)部南亞熱帶果樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640)

印楝素是目前世界上最優(yōu)秀的植物源農(nóng)藥，田間登記應(yīng)用已30多年，對(duì)全球作物保護(hù)和生態(tài)安全發(fā)揮了重要的作用。本文回顧了印楝素的發(fā)現(xiàn)和印楝在中國(guó)引種情況,總結(jié)了印楝素結(jié)構(gòu)鑒定與全合成的歷程，重點(diǎn)介紹印楝素拒食、抑制昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬的分子作用機(jī)理以及印楝分子生物學(xué)、印楝素生物合成研究的最新進(jìn)展。1983年，趙善歡等成功地將印楝引種中國(guó)，隨后我國(guó)許多學(xué)者開展印楝引種與繁育，種植面積曾超過(guò)6萬(wàn)hm2，為我國(guó)印楝素殺蟲劑的規(guī)模化生產(chǎn)提供了原料保障。1997年印楝素以新化合物結(jié)構(gòu)作為新農(nóng)藥在我國(guó)登記，實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化應(yīng)用，2014年成為農(nóng)業(yè)部推薦使用的低毒低殘留農(nóng)藥主要品種，獲得了顯著的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益。我國(guó)學(xué)者發(fā)現(xiàn)了印楝素誘導(dǎo)細(xì)胞自噬現(xiàn)象，闡明了印楝素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬的分子調(diào)控機(jī)理。隨著強(qiáng)化農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的源頭控制，印楝素的研究和應(yīng)用將會(huì)越來(lái)越深入普及。今后要進(jìn)一步加強(qiáng)基礎(chǔ)研究，明確印楝素的分子靶標(biāo)，為印楝素的科學(xué)使用提供理論基礎(chǔ)。

印楝素； 印楝； 植物源農(nóng)藥； 拒食； 抑制生長(zhǎng)發(fā)育

印楝素(Azadirachtin)是一種檸檬苦素類活性物質(zhì)，屬于四環(huán)三萜類化合物，主要從印楝AzadirachtaindicaA. Juss(圖1)中分離提取，此外在菲楝A.excelsa[1]、泰楝A.siamensis[2]以及印楝內(nèi)生真菌Eupenicilliumparvum[3]中也發(fā)現(xiàn)存在。印楝素是目前世界上公認(rèn)的活性最強(qiáng)的拒食劑，對(duì)大多數(shù)昆蟲和其他節(jié)肢動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育具有良好抑制作用，對(duì)脊椎動(dòng)物安全，被認(rèn)為是最優(yōu)秀的生物農(nóng)藥之一，也是目前商品化開發(fā)最成功的植物源殺蟲劑。由于其優(yōu)越的生物活性、獨(dú)特的作用機(jī)理和復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)，印楝素一直是農(nóng)藥學(xué)乃至整個(gè)植物保護(hù)學(xué)科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外有關(guān)印楝素和印楝的文獻(xiàn)報(bào)道已超過(guò)2 000篇。近年來(lái)，印楝基因組的解析為印楝素生物合成途徑提供了更多遺傳信息，印楝素也成為我國(guó)農(nóng)業(yè)部推薦使用的低毒低殘留農(nóng)藥主要品種，其分子作用機(jī)理研究等方面也取得了較大的進(jìn)展。隨著我國(guó)化學(xué)農(nóng)藥零增長(zhǎng)政策的實(shí)施，印楝素生物農(nóng)藥的應(yīng)用會(huì)越來(lái)越普遍，影響越來(lái)越深遠(yuǎn)。為了更好地促進(jìn)印楝素的健康發(fā)展，本文對(duì)印楝素的發(fā)現(xiàn)及歷史、化學(xué)特性與合成、作用機(jī)理，特別是我國(guó)引種印楝及其開發(fā)應(yīng)用等進(jìn)行了總結(jié)和分析。

圖1 印楝樹及其花和果

Fig.1 The tree, flower and fruit of neem,Azadirachtaindica

1 印楝素與印楝

1.1 印楝素的發(fā)現(xiàn)及歷史

印楝素的名字始于印度一種名為印楝的植物(圖1)，而它的發(fā)現(xiàn)源于蘇丹的一場(chǎng)蝗災(zāi)。1959年，德國(guó)著名昆蟲學(xué)家Schmutterer教授在蘇丹學(xué)習(xí)考察過(guò)程中目睹成千上萬(wàn)蝗蟲入侵后，幾乎所有植物被吃盡，唯獨(dú)印楝樹的葉子完好無(wú)損?；貒?guó)后，他在德國(guó)基爾大學(xué)發(fā)起了從印楝樹中分離對(duì)蝗蟲具有拒食或忌避作用活性成分的倡議，由此引起西方國(guó)家學(xué)者對(duì)印楝的研究熱潮[4-5]，他也被譽(yù)為“現(xiàn)代印楝之父”。然而，印楝素在印楝葉子中含量極低，不易分離得到。直到1968年，印楝素才被Butterworth等[6]從印楝的種子中分離出來(lái)，并命名為Azadirachtin。隨后，印楝素另一種生物活性也被發(fā)現(xiàn)，即對(duì)害蟲具有強(qiáng)烈的抑制生長(zhǎng)作用[7]。印楝素的發(fā)現(xiàn)正好是《寂靜的春天》出版引起全球?qū)r(nóng)藥殘留關(guān)注和美國(guó)禁止使用DDT法令頒布的時(shí)候，因而它的出現(xiàn)極大地引起了人們對(duì)天然農(nóng)藥的關(guān)注[4]。1980年Schmutterer教授在德國(guó)組織召開了第1次國(guó)際印楝大會(huì)，主題為印楝及其生物活性[8]。至今，在德國(guó)、印度、肯尼亞、加拿大、澳大利亞和中國(guó)等國(guó)家先后召開了8次國(guó)際印楝大會(huì)。我國(guó)于2001年在昆明還召開了中國(guó)印楝產(chǎn)業(yè)化發(fā)展國(guó)際研討會(huì)，專門探討印楝素的研究與開發(fā)，由此可見印楝素在天然農(nóng)藥中具有舉足輕重的地位。

印楝素是一系列類似化合物的統(tǒng)稱，包括印楝素A、B、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、O、P、Q等15種(圖2)，其中，印楝素O、P和Q是2005年Kanokmedhakul等[9]從菲楝中分離出來(lái)的。事實(shí)上，這種命名源于過(guò)去對(duì)印楝素結(jié)構(gòu)相似性的誤解。1986年，Klenk等[10]從印楝中鑒定出一種與印楝素具有相同活性的新化合物3-tigloylazadirachtol。限于當(dāng)時(shí)的技術(shù)水平，對(duì)印楝素結(jié)構(gòu)認(rèn)識(shí)仍很模糊，Rembold[11]將3-tigloylazadirachtol誤認(rèn)為印楝素的同分異構(gòu)體，從而引入了印楝素A、B、C、D的名字。然而，除印楝素C未分離鑒定外，嚴(yán)格意義上，印楝素A、B、D并不是同分異構(gòu)體，而是3個(gè)不同類型的化合物[4]。盡管如此，后人依然以此為參照將印楝或其他楝屬植物中分離得到的系列類似化合物分別命名為印楝素E、F、G等，并沿用至今。

圖2 印楝素A～Q的結(jié)構(gòu)Fig.2 The structures of azadirachtins A-Q

1.2 印楝素的化學(xué)特性

在印楝素10多種類似物中，印楝素A的含量最高、拒食活性最強(qiáng)。值得注意的是，通常所說(shuō)的印楝素是指印楝素A，其CAS登錄號(hào)為11141-17-6，分子式C35H44O16，相對(duì)分子質(zhì)量720.71。另一個(gè)重要成分是印楝素B(3-tigloylazadirachtol)，其CAS登錄號(hào)為95507-03-2，分子式C33H42O14，相對(duì)分子質(zhì)量662.69。印楝素B化學(xué)結(jié)構(gòu)與印楝素A相似，含量和拒食活性低于印楝素A，但抑制昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育的活性比印楝素A高。

印楝素A是無(wú)色或略帶黃色的結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，味微苦，熔點(diǎn)174 ℃，旋光度-13.1(c=1.75，丙酮)或-71.4 (c=0.21，CHCl3)，易溶于丙酮、乙醇、甲醇、二甲基亞砜等極性有機(jī)溶劑，微溶于水、氯仿和苯，分子中具有酯基、環(huán)氧基和烯醚基等不穩(wěn)定基團(tuán)，在紫外光、陽(yáng)光和高溫下極易分解。

印楝素屬于四環(huán)三萜類化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)大體可分為十氫化萘和三環(huán)呋喃左右兩部分，共含有16個(gè)手性中心，包括7個(gè)季碳、9個(gè)仲碳和16個(gè)氧原子[12]。這使其化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定變得十分困難，印楝素自分離到結(jié)構(gòu)的確定一共耗費(fèi)了17年時(shí)間。1975年，Zanno等[13]提出了印楝素的第1個(gè)化學(xué)結(jié)構(gòu)，盡管后來(lái)被證明是錯(cuò)誤的[14-15]，但對(duì)印楝素正確的化學(xué)結(jié)構(gòu)解析起到了一定的推動(dòng)作用；至1985年，印楝素的化學(xué)結(jié)構(gòu)才被Bilton等[14]正確地解析出來(lái)，隨后得到了X射線晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)[16]和核磁共振NMR圖譜證實(shí)[17]，成為印楝素化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定史上的轉(zhuǎn)折點(diǎn)。

1.3 印楝的分布及其在中國(guó)的引種

印楝屬于楝科楝屬常綠喬木，原產(chǎn)于印度次大陸印度、緬甸等地，現(xiàn)廣泛分布于中南半島、印度尼西亞、西非以及南美洲等熱帶亞熱帶干旱地區(qū)。早在1 000多年前，當(dāng)?shù)厝司桶l(fā)現(xiàn)印楝在治療麻風(fēng)病、牙齦炎、皮膚病等方面的神奇功能，印楝樹被當(dāng)?shù)赝林用穹鉃椤吧駱洹?。?959年Schmutterer發(fā)現(xiàn)其具有殺蟲活性后，全球興起種植印楝的熱潮。1993年，國(guó)際印楝網(wǎng)絡(luò)(International Neem Network，INN)成立并致力于印楝種源的遺傳改良、適應(yīng)性評(píng)價(jià)和推廣種植。聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織、聯(lián)合國(guó)亞太經(jīng)濟(jì)與社會(huì)理事會(huì)、國(guó)際林業(yè)研究組織聯(lián)盟等組織，推薦印楝為南亞、東南亞和非洲等干熱地區(qū)優(yōu)先發(fā)展的樹種[18]，現(xiàn)已被引種到中國(guó)、美國(guó)、澳大利亞、斐濟(jì)和毛里求斯等50多個(gè)國(guó)家。

印楝由于含有活性物質(zhì)——印楝素而著名，聯(lián)合國(guó)報(bào)告中稱其為“20世紀(jì)對(duì)當(dāng)?shù)鼐用竦淖畲蠖髻n”，被美國(guó)農(nóng)業(yè)部譽(yù)為“可解決全球問題的樹”[19]。印楝是印楝素生物農(nóng)藥產(chǎn)品加工的唯一原料，大多數(shù)研究都是圍繞如何提高印楝中印楝素含量開展。印楝素含量差異主要取決于印楝的品種，也會(huì)受種植地氣候條件(如溫度、濕度、雨水)影響。根據(jù)生物氣候區(qū)和緯度，印楝種源(原產(chǎn)地品種)被國(guó)際印楝網(wǎng)絡(luò)劃分為25個(gè)[20]，其中印度的種源最多，有8個(gè)(表1)。印楝從第2—3年開始結(jié)果，成熟的楝樹可收獲果實(shí)20～50 kg，收獲期可延續(xù)幾十年。印楝素在不同收獲期果實(shí)中含量差異顯著，隨綠果形成而開始積累，大約10 d后含量達(dá)到了最大值，之后隨著種子中油脂的積累，印楝素含量會(huì)稍微降低[21]。有研究報(bào)道可通過(guò)人工接種叢枝菌根來(lái)提高印楝種子中印楝素的含量[22]。印度學(xué)者則發(fā)現(xiàn)噴施多胺類物質(zhì)(如腐胺、亞精胺和精胺)可提高印楝種子中印楝素的含量[23]。但是，這些技術(shù)措施在實(shí)際生產(chǎn)中均未得到推廣應(yīng)用。

印楝在我國(guó)無(wú)自然分布，1983年趙善歡首次將印楝從國(guó)外引入華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲毒理研究室殺蟲植物標(biāo)本園并試種成功[24]。為了發(fā)展印楝素生物農(nóng)藥的原料基地，1986年趙善歡等[25]又成功地從非洲多哥將印楝樹大面積引種到海南萬(wàn)寧縣和廣東省徐聞縣，并建議在海南島、雷州半島和云南省西雙版納等地推廣種植。印楝在引種地正常開花結(jié)果，果仁中印楝素含量與原產(chǎn)地相當(dāng)。自此以后，我國(guó)開始大規(guī)模引種印楝，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)和中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所等機(jī)構(gòu)相繼開展了大量的印楝引種、選育和馴化工作。原成都綠金生物科技有限公司董事長(zhǎng)吳成奎在印楝種植和產(chǎn)業(yè)化方面作出了重要貢獻(xiàn)，解培惠在攀枝花建立了印楝種質(zhì)資源圃。目前，我國(guó)已成為世界上印楝人工種植面積最大的國(guó)家，高峰時(shí)云南省、四川省、海南省和廣東省雷州半島等地區(qū)種植面積曾超過(guò)6萬(wàn)hm2[26]，創(chuàng)造了我國(guó)植樹史上繼橡膠引種后的又一創(chuàng)舉，為我國(guó)印楝素殺蟲劑的規(guī)?；a(chǎn)提供了原料保障。此外，印楝的大面積推廣種植不僅具有構(gòu)筑長(zhǎng)江上游生態(tài)屏障、改善生態(tài)環(huán)境等生態(tài)效益，也為云南及四川金沙江、元江和怒江的廣大農(nóng)民開辟了一條脫貧致富的新路，對(duì)保護(hù)生態(tài)環(huán)境、防止水土流失、改良土壤、發(fā)展山區(qū)經(jīng)濟(jì)、促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展均具有重大的意義和深遠(yuǎn)的影響。在這過(guò)程中，我國(guó)政府及有關(guān)部門對(duì)印楝種植與開發(fā)極為重視，國(guó)家林業(yè)局、云南省科委及生物資源開發(fā)創(chuàng)新辦公室均立項(xiàng)對(duì)印楝進(jìn)行引種栽培和綜合利用研究，云南省將印楝列為生物資源重點(diǎn)發(fā)展項(xiàng)目之一，四川省將印楝引種列為省府督辦的1號(hào)工程，海南省把印楝種植作為建設(shè)生態(tài)省的重要項(xiàng)目。2001年，時(shí)任國(guó)務(wù)院總理朱镕基在聽取了華南農(nóng)業(yè)大學(xué)筆者有關(guān)印楝項(xiàng)目的匯報(bào)后，對(duì)印楝的生態(tài)保護(hù)作用給予了高度評(píng)價(jià)。2007年，筆者領(lǐng)銜的“印楝生態(tài)林建設(shè)與印楝環(huán)保農(nóng)藥的研究推廣”項(xiàng)目獲得了原國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局授予的“環(huán)境保護(hù)科學(xué)技術(shù)一等獎(jiǎng)”。

表1 國(guó)際印楝網(wǎng)絡(luò)劃分的印楝種源概況[20]Tab.1 Neem seed sources summarized by the International Neem Network

21世紀(jì)初期，印度科學(xué)家提出印楝基因組計(jì)劃并于 2011 年宣告完成。該計(jì)劃通過(guò)對(duì)印楝基因組測(cè)序分析，揭示印楝基因組大小為364 Mbp，編碼約2萬(wàn)個(gè)基因，進(jìn)化上與蕓香科植物甜橙Citrussinensis近緣[27-28]，其序列信息可從印楝基因組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA176672)。目前，對(duì)印楝不同組織(根、莖、葉、花和果實(shí))的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序也相繼完成[27, 29-30]，與此同時(shí)我國(guó)科研人員也完成了國(guó)內(nèi)種植的印楝的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序[31]。為全面揭示印楝中活性物質(zhì)檸檬苦素類化合物的生物合成途徑奠定了基礎(chǔ)，也意味著對(duì)印楝的研究進(jìn)入了分子生物學(xué)階段。

2 印楝素的制備與合成

2.1 印楝素的生產(chǎn)制備

印楝的種子、葉片、枝條和樹皮等多個(gè)部位均含有印楝素，其中種子的印楝素含量最高，w通常為0.3%～0.5%，個(gè)別品種最高可達(dá)1%。但是種子收獲具有季節(jié)性，生產(chǎn)供給能力有限，其貯藏條件也對(duì)后續(xù)制備產(chǎn)生影響。國(guó)內(nèi)外學(xué)者嘗試通過(guò)植物組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)印楝素進(jìn)行大規(guī)模穩(wěn)定生產(chǎn)[32-37]，但這些技術(shù)仍需優(yōu)化。目前印楝種子仍是提取制備印楝素的唯一有效途徑。

印楝素的工廠化生產(chǎn)關(guān)鍵在于其原藥提取制備工藝，通常包括以下2步：1)去油：壓榨印楝種仁，得到印楝油，壓榨后的殘?jiān)词怯￠?。將印楝餅粉碎，得到種仁粉，該粉是生產(chǎn)印楝素原藥的主要原料。2)印楝素原藥的制備：以印楝種仁粉為原料制備，常用提取方法主要有溶劑萃取法、超臨界萃取法和微波萃取法。其中,溶劑萃取法使用最多、最成熟；超臨界萃取法由于整個(gè)分離過(guò)程在暗場(chǎng)中進(jìn)行，萃取溫度接近室溫，特別適合對(duì)光熱不穩(wěn)定的印楝素提取。

2.2 印楝素的化學(xué)合成

實(shí)現(xiàn)印楝素化學(xué)合成是解決印楝素產(chǎn)品加工原料不足的重要手段。國(guó)內(nèi)外許多研究人員對(duì)印楝素的全合成和骨架合成進(jìn)行了大量研究。印楝素的化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，是C-開環(huán)檸檬素類化合物，由于C-8和C-14的位阻使得C-8和C-14相連接困難。英國(guó)劍橋大學(xué)Ley教授的研究組于2007年首次完成了印楝素的全合成，整個(gè)過(guò)程包括71步反應(yīng)，其中一個(gè)片斷需48 步反應(yīng)才能得到，最終總收率僅為0.000 15%[5,38]。由于合成路線長(zhǎng)、收率低，Sanderson[39]稱這一合成手段根本不具備實(shí)際生產(chǎn)意義，還不如從印楝種仁中直接提取分離方便。隨后，Ley等[40]開始優(yōu)化印楝素合成路線，并成功將其中一個(gè)片段的合成由 26 步縮短到 17 步。盡管無(wú)法實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)，但是Ley 等的研究工作在復(fù)雜天然產(chǎn)物的全合成探索中仍然具有重要的里程碑意義，不僅為后人化學(xué)合成印楝素提供了思路，而且有助于人們更好地了解印楝素分子的中間代謝物及其衍生物對(duì)昆蟲的生物活性。

在印楝素及其衍生物的構(gòu)效關(guān)系研究方面，Yamasaki等[41]研究表明印楝素A的C-22與C-23位雙鍵氫化加成后，明顯增加了分子穩(wěn)定性，而且印楝素的羥基對(duì)生物活性具有重要貢獻(xiàn)，當(dāng)具有親油基團(tuán)時(shí)活性較高。Simmonds等[42]指出印楝素母體分子碳環(huán)上C-7、C-11、C-22和C-23是決定生物活性的關(guān)鍵位置，基團(tuán)取代能明顯影響其活性。有學(xué)者認(rèn)為印楝素母體分子結(jié)構(gòu)的微小改變可能導(dǎo)致其對(duì)昆蟲行為反應(yīng)的變化。Madyastha等[43]利用生物催化法對(duì)印楝素的官能團(tuán)和主體骨架進(jìn)行修飾，所得化合物對(duì)昆蟲具有較好的拒食活性。印楝素C-12位的—COOCH3不是其活性基團(tuán)，但可明顯提高其生物活性，將—COOCH3降解為—COOH，其生物活性有所降低，但沒有出現(xiàn)質(zhì)的改變，C-12水解的印楝素A對(duì)小菜蛾P(guān)lutellaxylostella、斜紋夜蛾Spodopteralitura和棉鈴蟲Helicoverpaarmigera幼蟲具有較好的生物活性[44-45]。

2.3 印楝素的生物合成

由于印楝素化學(xué)合成的難度大，人們便把目光轉(zhuǎn)向其生物合成。早期的研究主要集中于印楝素生物合成的化學(xué)代謝途徑，近年來(lái)，隨著基因組和轉(zhuǎn)錄組技術(shù)發(fā)展，人們企圖去探明參與印楝素生物合成的關(guān)鍵基因或蛋白。借助放射性同位素示蹤法，Akhila等[46]利用標(biāo)記的乙酸和甲羥戊酸來(lái)研究印楝素及其類似物Nimbin和Salannin。盡管目前對(duì)其確切的合成途徑還不清晰，但已初步描繪了印楝素生物合成的框架。類固醇三萜甘遂醇(Tirucallol)被認(rèn)為是印楝中檸檬苦素三萜類次生代謝物的前體物[20,47]。首先，兩分子法呢烯基焦磷酸(Farnesyl diphosphate，F(xiàn)PP)結(jié)合形成甘遂醇，甘遂醇通過(guò)烯丙基異構(gòu)化反應(yīng)生成丁酰鯨魚醇(Butyrospermol)，丁酰鯨魚醇被氧化重排形成Apotirucallol；接著，Apotirucallol側(cè)鏈末端的4個(gè)碳被去除[47-48]，其余的碳環(huán)化形成呋喃環(huán)，然后進(jìn)一步被氧化形成碳開環(huán)檸檬苦素類似物，如印楝二酮(Azadiradione)、Nimbin、茄堿苷(Salanin)[20,47,49]；最后，茄堿苷分子進(jìn)一步氧化和環(huán)化形成印楝素以及Meliacarpin、Azadirachtol[4,50]，但是目前尚不能夠明確這3個(gè)化合物形成的先后次序。

在分子生物學(xué)方面，印楝素在植物體內(nèi)的生物合成途徑研究正處于起始階段，盡管取得了一些進(jìn)展，但其合成機(jī)制仍不清楚。印楝素是印楝中一種高度氧化的檸檬苦素類化合物，初始合成路徑分為4個(gè)階段：第1階段，合成C5骨架的異戊烯焦磷酸(IPP)和其雙鍵異構(gòu)體二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)；第2階段，在法呢烯基焦磷酸合成酶作用下DMAPP加上2分子的IPP合成具有C15骨架的法呢烯基焦磷酸(FPP)；第3階段，2分子FPP在鯊烯合成酶的作用下生成C30骨架的鯊烯，接著在鯊烯環(huán)氧酶催化下生成 2,3-環(huán)氧化鯊烯；第4階段，2,3-環(huán)氧化鯊烯經(jīng)過(guò)一系列的質(zhì)子化、環(huán)化、重排和去質(zhì)子化作用最終合成檸檬苦素類化合物。這4個(gè)階段的合成反應(yīng)需要多種酶參與完成，所涉及的酶大部分已清楚，但是對(duì)后續(xù)合成途徑中甘遂醇至印楝素所需關(guān)鍵酶的了解很少。最近，Kuravadi等[30]聯(lián)合第2代高通量測(cè)序和超高效液相色譜(UHPLC)技術(shù)對(duì)印楝果實(shí)、葉、花等各種組織的差異表達(dá)基因和印楝素類似物進(jìn)行系統(tǒng)分析，通過(guò)權(quán)重基因關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析(Weighted correlation network analysis，WGCNA)算法獲得了150多個(gè)可能涉及甘遂醇至印楝素合成途徑的候選基因，其中轉(zhuǎn)酮醇酶和脫氫酶等基因在印楝果實(shí)中高表達(dá)。Krishnan等[27]則認(rèn)為倍半萜和三萜類化合物生物合成途徑中8個(gè)基因PS21、lytB/ispH、ispE、GGPS、FDPS、FDFT1、SQLE和(+)-neomenthol dehydrogenase在印楝體內(nèi)代謝合成印楝素中起到重要作用。

3 印楝素的生物活性與作用機(jī)理

3.1 印楝素的生物活性

印楝素的防治譜非常廣，對(duì)鱗翅目Lepidoptera、膜翅目Hymenoptera、鞘翅目Coleoptera等10余目400多種農(nóng)、林、儲(chǔ)糧和衛(wèi)生害蟲有生物活性[51]；對(duì)害蟲的作用方式多種多樣，包括拒食、抑制生長(zhǎng)發(fā)育、忌避、胃毒和絕育等作用，其中以拒食和抑制昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育尤為顯著，這2種作用方式在植物源農(nóng)藥研究中也最具代表性。

印楝素生物活性的研究已有很多報(bào)道， Schmutterer[52]調(diào)查研究了印楝素對(duì)不同目昆蟲的生物活性。華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲毒理研究室從1981年開始對(duì)印楝提取物及印楝素的殺蟲活性進(jìn)行了研究，先后對(duì)菜青蟲Pierisrapae、斜紋夜蛾、小菜蛾、中華稻蝗Oxyachinensis、亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis、東亞飛蝗Locustamigratoria、三化螟Tryporyzaincertulas、褐飛虱Nilaparvatalugens、稻縱卷葉螟Cnaphalocrocismedinalis、稻癭蚊Orseoiaoryzae、玉米象Sitophiluszeamais、米象S.oryzae、荔枝蝽Tessaratomapapillosa、柑桔紅蜘蛛Panonychuscitri、柑桔潛葉蛾P(guān)hyllocnistiscitrella、馬尾松毛蟲Dendrolimuspunctatus、黃脊竹蝗Ceracriskiangsu、青脊竹蝗C.nigricornis、松突圓蚧Hemiberlesiapitysophila、黑卵蜂Tiphodytesrobertae、擬環(huán)紋狼蛛Lycosapseudoamulata、家白蟻Coptotermesformosanus、粘蟲Mythimnaseparata和致倦庫(kù)蚊Culexfatigans幼蟲等20多種昆蟲進(jìn)行了生物活性測(cè)定[53]。大多數(shù)研究都是用印楝不同部位提取物或印楝油來(lái)做試驗(yàn)，印楝素單體的活性效果往往不如那些含有大量活性未知的檸檬苦素類化合物的“印楝粗提物”；印楝粗提物中未知化合物、印楝油與印楝素具有協(xié)同增效作用[54-55]。

3.2 印楝素的作用機(jī)理

3.2.1 拒食作用 一般認(rèn)為，印楝素直接或間接地通過(guò)破壞昆蟲口器上的化學(xué)感受器，刺激其特異性抑制型感覺細(xì)胞，或者阻斷對(duì)取食刺激物(如蔗糖)起反應(yīng)的感受器受體細(xì)胞的信號(hào)輸入，從而抑制昆蟲的取食行為。Simmonds等[56]對(duì)草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda和煙芽夜蛾Heliothisvirescens等鱗翅目昆蟲的神經(jīng)生理學(xué)研究表明，印楝素可以刺激化學(xué)感受器上的抑制型神經(jīng)元細(xì)胞，同時(shí)也會(huì)抑制對(duì)蔗糖敏感的神經(jīng)細(xì)胞。Luo等[57]發(fā)現(xiàn)印楝素對(duì)菜青蟲中間的栓錐感覺器的抑制型感受細(xì)胞雖然有很強(qiáng)的刺激作用，但對(duì)兩側(cè)栓錐感覺器的蔗糖、氨基酸和芥子糖苷感受細(xì)胞沒有作用。Mordue等[58]對(duì)多食性和寡食性昆蟲研究顯示，印楝素及其大部分類似物對(duì)化學(xué)感受器的抑制型神經(jīng)元細(xì)胞都有刺激作用，而多食性和寡食性昆蟲對(duì)印楝素敏感性有較大的差異，但不能確定這種差異是否與化學(xué)感受器上神經(jīng)元受體的特異性和密度有關(guān)。

Qiao等[59]利用電生理膜片鉗技術(shù)在果蠅離體腦組織水平上研究了印楝素的拒食作用機(jī)理，發(fā)現(xiàn)印楝素通過(guò)抑制果蠅食道下神經(jīng)節(jié)(Suboesophageal ganglion，SOG)區(qū)中間神經(jīng)元的鈣離子通道，降低膽堿能興奮性突觸后電流(mEPSCs)的頻率，進(jìn)而抑制SOG區(qū)膽堿能神經(jīng)信號(hào)的傳導(dǎo)。昆蟲大多數(shù)味覺神經(jīng)元投射于SOG，SOG是初級(jí)味覺信息的處理中心，與取食行為密切相關(guān)。推測(cè)印楝素通過(guò)抑制昆蟲SOG興奮性膽堿能突觸傳遞和鈣離子通道，干擾昆蟲神經(jīng)中樞系統(tǒng)信息傳導(dǎo)和處理，從而起到對(duì)昆蟲的拒食作用。

3.2.2 抑制生長(zhǎng)發(fā)育 抑制昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育是印楝素最顯著特點(diǎn)之一。印楝素處理會(huì)導(dǎo)致昆蟲體內(nèi)蛻皮激素的滴度發(fā)生變化，如峰期延遲、下降或滯留時(shí)間延長(zhǎng)，使其表現(xiàn)出不能正常蛻皮、蛻皮受阻死亡、蛻皮后形成幼蟲-蛹中間體、畸形蛹、羽化延遲或永久幼蟲等典型癥狀。為此，Ruscoe等[7]認(rèn)為印楝素的結(jié)構(gòu)與20-羥基蛻皮酮(即蛻皮激素)相似，可能直接與蛻皮激素競(jìng)爭(zhēng)其受體從而抑制生長(zhǎng)發(fā)育。實(shí)際上，這種觀點(diǎn)是錯(cuò)誤的，那是在印楝素化學(xué)結(jié)構(gòu)尚未解析前對(duì)兩者的誤解。Koolman等[60]采用放射免疫法研究發(fā)現(xiàn)，印楝素并沒有競(jìng)爭(zhēng)蛻皮激素、也沒有與蛻皮激素受體結(jié)合的活性，表明印楝素不能直接與蛻皮激素受體結(jié)合。此外，應(yīng)用放射免疫技術(shù)對(duì)離體培養(yǎng)前胸腺(添加印楝素及促前胸腺激素PTTH)的研究表明，印楝素對(duì)前胸腺合成蛻皮激素沒有直接作用[61-62]。說(shuō)明蛻皮激素滴度的下降很可能是印楝素作用靶器官后的間接結(jié)果。趙善歡等[63]發(fā)現(xiàn)印楝素可導(dǎo)致亞洲玉米螟大腦萎縮，咽側(cè)體和心側(cè)體表現(xiàn)為稍腫大并較透明，前胸腺表現(xiàn)出病理變化癥狀。而放射性同位素標(biāo)記印楝素的研究顯示：印楝素對(duì)飛蝗若蟲腦神經(jīng)分泌蛋白的合成或釋放具有抑制作用，但是印楝素不能突破血腦屏障，只能分布其周緣[64-65]。也有研究認(rèn)為，印楝素并不直接干擾昆蟲腦神經(jīng)分泌蛋白的合成，只是間接影響其合成量[66]。

近年來(lái)，印楝素抑制昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育的機(jī)理研究在分子水平上取得了一些重要進(jìn)展。Lai等[67]構(gòu)建了印楝素作用下昆蟲的差異基因表達(dá)譜，提出印楝素通過(guò)昆蟲幼蟲營(yíng)養(yǎng)-胰島素信號(hào)途徑調(diào)控蛻皮激素、抑制幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育。在此基礎(chǔ)上，研究發(fā)現(xiàn)果蠅成蟲盤是印楝素的重要靶器官，印楝素通過(guò)誘導(dǎo)幼蟲成蟲盤發(fā)生細(xì)胞凋亡，上調(diào)胰島素樣肽dilp8表達(dá)，進(jìn)而降低PTTH的分泌；在果蠅PTTH神經(jīng)元、全腦或全身ptth過(guò)表達(dá)可明顯減緩或消除印楝素對(duì)果蠅幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育的抑制[68]。

也有學(xué)者認(rèn)為印楝素對(duì)昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育的抑制活性是由其拒食作用引起的間接效應(yīng)。Mordue等[69]則認(rèn)為印楝素拒食效應(yīng)與抑制昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育兩者間是相互獨(dú)立的作用方式。賴多[68]利用昆蟲取食行為和發(fā)育檢測(cè)模型測(cè)定了印楝素對(duì)果蠅幼蟲取食和發(fā)育的影響，結(jié)果表明印楝素拒食與抑制昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育是2個(gè)相互獨(dú)立的作用方式，印楝素抑制昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育不是由拒食作用引起的。

3.2.3 誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和凋亡 印楝素引起昆蟲個(gè)體發(fā)生復(fù)雜的生理效應(yīng)，很大程度上影響了其機(jī)理的研究。從20世紀(jì)90年代開始，印楝素的作用機(jī)理研究逐漸從蟲體轉(zhuǎn)到細(xì)胞水平。自1993年Rembold等[70]報(bào)道印楝素可影響草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞Sf9的增殖和蛋白合成后，β-微管蛋白[71-72]、肌動(dòng)蛋白[73]和熱激蛋白Hsp60[74]先后被認(rèn)為是印楝素的可能靶標(biāo)。但仍然難以解釋印楝素引起昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育抑制的復(fù)雜生理效應(yīng)，例如，無(wú)法合理解析印楝素造成蛻皮激素滴度降低現(xiàn)象。

2008年以來(lái)，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在國(guó)內(nèi)率先從細(xì)胞水平探討印楝素的作用機(jī)理，從細(xì)胞形態(tài)學(xué)上分別證明了印楝素能夠抑制粉紋夜蛾Hi-5、斜紋夜蛾SL-1、草地貪夜蛾Sf9和粉紋夜蛾BTI-Tn-5B1-4 等多種昆蟲細(xì)胞增殖，影響細(xì)胞骨架正常功能，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[75-78]。進(jìn)一步研究表明，印楝素可促使Sf9細(xì)胞中線粒體膜電位下降、p53蛋白上調(diào)以及溶酶體通透性增加，從而誘發(fā)凋亡[79-81]。Huang等[82]研究發(fā)現(xiàn)印楝素致使細(xì)胞死亡的另一條途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬，并通過(guò)抑制信號(hào)通路PI3K-AKT-Tor的磷酸化水平而誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生，同時(shí)通過(guò)線粒體途徑激活Caspase-3引發(fā)凋亡，且印楝素誘導(dǎo)的自噬信號(hào)先于凋亡發(fā)生，并通過(guò)激活tAtg5分子開關(guān)促發(fā)自噬向凋亡轉(zhuǎn)化(圖3)[83-84]。

圖3 印楝素誘導(dǎo)昆蟲細(xì)胞自噬和凋亡的分子機(jī)理模型[83]Fig.3 A proposed mechanism underlying model of molecular -induced autophagy and apoptosis in insect cells

4 印楝素的應(yīng)用和展望

4.1 印楝素產(chǎn)品在中國(guó)的登記和應(yīng)用

自第1個(gè)商品化印楝素產(chǎn)品于1985年在美國(guó)獲批登記，印楝素生物農(nóng)藥在全球得到了廣泛應(yīng)用。目前，印楝素產(chǎn)品在中國(guó)、印度、斯里蘭卡、美國(guó)、德國(guó)、意大利、瑞士、澳大利亞、新西蘭、墨西哥、智利、加拿大等20多個(gè)國(guó)家獲得登記。

中國(guó)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)開發(fā)出了商品化的0.3%印楝素乳油制劑，1997年以新結(jié)構(gòu)化合物在國(guó)內(nèi)首先獲得臨時(shí)登記[85]。該制劑1999年獲得“國(guó)家重點(diǎn)新產(chǎn)品”證書；2004年，印楝素植物性殺蟲劑制劑獲得首屆“廣東省發(fā)明專利金獎(jiǎng)”。與華南農(nóng)業(yè)大學(xué)建立校企合作的成都綠金生物科技有限責(zé)任公司是我國(guó)最早取得印楝素產(chǎn)品正式登記的生產(chǎn)企業(yè)，其產(chǎn)品主要包括10%印楝素母藥和0.3%印楝素乳油。到2017年2月，我國(guó)共有印楝素生產(chǎn)企業(yè)13家，批準(zhǔn)登記產(chǎn)品17個(gè)，其中包括2個(gè)原藥、11個(gè)乳油制劑產(chǎn)品(含2個(gè)混劑)[86]。目前，印楝素殺蟲劑已成為我國(guó)三大植物性農(nóng)藥品種之一，2014年成為我國(guó)農(nóng)業(yè)部推薦使用的低毒低殘留農(nóng)藥主要品種，主要用于防治十字花科蔬菜上的小菜蛾、菜青蟲和斜紋夜蛾，茶樹的茶毛蟲Euproctispseudoconspersa和茶小綠葉蟬Empoascapirisuga，以及柑橘樹的潛葉蛾、高粱的玉米螟、煙草的煙青蟲、草原的蝗蟲等害蟲；在沙糖橘、荔枝、水稻、蔬菜等植物上都得到了成功的推廣應(yīng)用，在新疆草原的蝗蟲、貴州仁懷高粱的蚜蟲、四川雅安茶葉的葉蟬等害蟲防治上取得了明顯的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。

4.2 展望

印楝素作為全球公認(rèn)的最優(yōu)秀的生物農(nóng)藥，在中國(guó)推廣應(yīng)用已20年，為從源頭上保障我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全作出了重要貢獻(xiàn)，是中國(guó)農(nóng)藥發(fā)展歷史上里程碑式的農(nóng)藥品種，影響深遠(yuǎn)。它使植物保護(hù)工作的目的回歸到保護(hù)作物，而不是殺死害蟲。印楝素作為天然的典型昆蟲拒食劑，引領(lǐng)了“和諧植?！薄ⅰ吧鷳B(tài)植?！钡闹参锉Ｗo(hù)可持續(xù)發(fā)展方向。新農(nóng)藥不再?gòu)?qiáng)調(diào)快速殺死害蟲，而是要求害蟲不再取食或減少取食為害，昆蟲拒食劑、忌避劑、生長(zhǎng)發(fā)育抑制劑成為新農(nóng)藥發(fā)展的新亮點(diǎn)，廣大農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者通過(guò)印楝素的使用認(rèn)識(shí)到非殺生型、緩效型農(nóng)藥的經(jīng)濟(jì)效益更加明顯，使用更加安全、環(huán)境壓力小，這為替代高毒農(nóng)藥提供了堅(jiān)實(shí)的理論支撐和物質(zhì)保障。

印楝素對(duì)高等動(dòng)物安全，對(duì)大鼠急性經(jīng)口LD50值低至5 000 mg·kg-1，屬于相對(duì)無(wú)毒級(jí)。印楝素的成功推廣應(yīng)用改變了人們“農(nóng)藥即是毒藥”的觀念，引領(lǐng)農(nóng)藥向更加安全的方向發(fā)展。目前，我國(guó)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)主體還是分散生產(chǎn)，從業(yè)者眾、文化素質(zhì)相對(duì)較低，其生產(chǎn)觀念的改變是一個(gè)長(zhǎng)期的過(guò)程。今后，需要政府加大政策和資金支持力度，扶植一批印楝素生產(chǎn)的龍頭企業(yè)，鞏固和發(fā)展“印楝種植-印楝素提取-生物農(nóng)藥配制-安全農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)”的綠色產(chǎn)業(yè)鏈；加強(qiáng)基礎(chǔ)研究，進(jìn)一步明確印楝素的分子靶標(biāo)，為印楝素的科學(xué)使用提供理論基礎(chǔ)。

2015年農(nóng)業(yè)部實(shí)施農(nóng)藥使用量零增長(zhǎng)行動(dòng)計(jì)劃，史上最嚴(yán)的《食品安全法》正式實(shí)施，2017年2月新修訂的《農(nóng)藥管理?xiàng)l例》獲得國(guó)務(wù)院審核通過(guò)，對(duì)農(nóng)藥提出了更高的要求。大力推廣應(yīng)用“生物農(nóng)藥、高效低毒低殘留農(nóng)藥，替代高毒高殘留農(nóng)藥”必將進(jìn)一步提速，印楝素生物農(nóng)藥也將迎來(lái)發(fā)展的新契機(jī)。

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【責(zé)任編輯 周志紅】

Research and application of botanical pesticide azadirachtin

XU Hanhong1, LAI Duo2, ZHANG Zhixiang1

(1 Key Laboratory of Natural Pesticide and Chemical Biology, Ministry of Education/College of Agriculture，South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China； 2 Institute of Fruit Tree Research, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of South Subtropical Fruit Biology and Genetic Resource Utilization, Ministry of Agriculture, Guangzhou 510640, China)

Azadirachtin is primarily known as an effective botanical insecticide, it has been widely used in field practice for more than 30 years, and plays an important role in the global crop protection and ecological security. In this review, we traced the discovered history of azadirachtin and the situation of neem introduction, and summarized the molecular mechanism inducing autophagic apoptosis, the latest progresses of molecular mechanism and biosynthesis of azadirachtin, as well as molecular biology. The neem tree,AzadirachtaindicaA. Juss, was first introduced by Shin-Foon Chiu’s group into China in 1983, and then Chinese scholars made great efforts to introduce and breed neem tree, planted more than sixty thousand hectares of neem trees, which provided material guarantee for the large-scale production of azadirachtin pesticide in China. The commercial application of azadirachtin was authorized by China’s Ministry of Agriculture(CMA) as a new insecticide in 1997. Azadirachtin had become the main low toxicity and low residue pesticide recommended by CMA in 2014, and resulted in good social and ecological benefits. Chinese scholars discovered that azadirachtin could induce autophagy in insect cell, and illuminated the molecular regulation mechanism of apoptosis and autophagy induced by azadirachtin. As strengthening the source control of quality and safety for agricultural product, the research and application of azadirachtin will be more and more widespread. The basic research should be intensified for future work to find out the molecular target of azadirachtin, which will provide a theoretical basis for scientifical application of azadirachtin.

azadirachtin; neem; botanical pesticide; antifeedant; growth and development inhibition

2017- 02- 22 優(yōu)先出版時(shí)間：2017- 06-21

徐漢虹(1961—)，男，教授，博士，E-mail：hhxu@scau.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金(31471793，31601699)；廣東省應(yīng)用型科技研發(fā)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2015B020230012)

S482.1

A

1001- 411X(2017)04- 0001- 11

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170621.1923.004.html

徐漢虹， 賴 多， 張志祥.植物源農(nóng)藥印楝素的研究與應(yīng)用[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017,38(4):1- 11.