燕 潁， 顧懷宇， 徐漢虹， 張志祥

(1天然農藥與化學生物學教育部重點實驗室/華南農業(yè)大學 農學院，廣東 廣州 510642；2 中山大學 中山醫(yī)學院，廣東 廣州 510080)

印楝素對果蠅厭惡性味覺記憶的誘導及多巴胺能神經(jīng)元的影響

燕 潁1， 顧懷宇2， 徐漢虹1， 張志祥1

(1天然農藥與化學生物學教育部重點實驗室/華南農業(yè)大學 農學院，廣東 廣州 510642；2 中山大學 中山醫(yī)學院，廣東 廣州 510080)

【目的】明確印楝素是否能誘導果蠅產生厭惡性味覺記憶,并探討多巴胺信號在這種記憶形成中的調控作用?！痉椒ā坷糜￠卣T導果蠅產生短期厭惡性味覺記憶，并通過昆蟲口器伸展反應測試誘導結果；采用壓力注射給藥方式及果蠅全腦膜片鉗記錄，研究印楝素對果蠅腦內不同亞群多巴胺能神經(jīng)元興奮性及受體電流的影響。【結果】印楝素A及印楝素干粉均能顯著抑制果蠅口器伸展的概率，口器伸展反應(PER)分別為60.34%和17.24%，(P<0.007)，并且干粉的效果更加明顯；印楝素對不同亞群的多巴胺能神經(jīng)元的興奮性有不同的作用，PPL1、PAM和PPM2亞群興奮性呈現(xiàn)增加趨勢，其中PPL1亞群興奮性改變最為顯著；印楝素對多巴胺D1受體具有激動效應，這種激動效應可被D1受體特異性拮抗劑抑制?！窘Y論】印楝素可以誘導果蠅產生厭惡性味覺記憶，這種記憶受果蠅腦內多巴胺能信號的調控。

印楝素； 厭惡性味覺記憶； 多巴胺； 神經(jīng)興奮性； 果蠅

印楝素是當今世界公認的最優(yōu)秀的生物農藥之一，屬于檸檬素類物質，也是一種苦味劑，具有拒食、忌避、抑制生長發(fā)育、誘導凋亡和自噬等多種作用機制[1]。印楝素在實際應用中不穩(wěn)定、易降解，但對害蟲具有持續(xù)效果，目前仍無法解釋這種現(xiàn)象。近期有研究提出印楝素具有味覺記憶性的觀點，并通過取食行為觀察和分子生物學檢測發(fā)現(xiàn)，印楝素對斜紋夜蛾Spodopteralitura幼蟲的拒食活性與長時程記憶相關蛋白CREB mRNA的表達量一致，認為兩者可能存在關聯(lián)[2]。果蠅Drosophila是神經(jīng)生物學的重要模式生物之一，因其詳實的遺傳背景和便捷的試驗操作手段，在學習記憶功能研究中具有其他試驗動物模型無法比擬的優(yōu)勢。多巴胺(Dopamine，DA)是生物體廣泛存在的一種神經(jīng)遞質，參與調控昆蟲的多種生理和行為過程，如學習、記憶、認知、抉擇、運動以及型變等[3]。在昆蟲聯(lián)合學習記憶中，多巴胺介導著非條件化(強化)刺激的傳導，尤其是負向強化(電擊、高熱或苦味物質)刺激[4]。果蠅腦內大約有600個多巴胺神經(jīng)元，根據(jù)解剖學位置分為不同的細胞亞群，其中PPL1、PAM、PPL2ab 這3個神經(jīng)元群投射至蘑菇體(果蠅的學習記憶中心)神經(jīng)纖維網(wǎng)[5]。目前已經(jīng)明確PPL1與PAM亞群參與調控果蠅厭惡性學習記憶[6-8]。DA釋放后需要通過結合突觸后膜特異性的多巴胺受體 (Dopamine receptors, DARs) 來發(fā)揮作用。果蠅腦內存在4個G-蛋白偶聯(lián)性DARs,包括2個D1型受體(DopR1、DopR2)、1個D2型受體D2R和1個非經(jīng)典型受體DopEcR[9]。已有研究證實，果蠅對厭惡性進食行為的學習依賴于蘑菇體內部神經(jīng)元中多巴胺D1受體的存在，當D1受體發(fā)生突變時，果蠅幾乎喪失學習能力[10]。驅蚊胺(N，N-Diethyl-m-toluamide，DEET)是常用的趨避劑，有研究報道其效應是由于同時誘導害蟲產生了嗅覺和味覺躲避反應[11]。DEET可以強化刺激誘導果蠅產生短期厭惡性記憶，而這種記憶同時接受特定多巴胺能神經(jīng)元的調控[12]。動物可以根據(jù)先前的經(jīng)歷形成強烈的味覺記憶來躲避有毒食物[13]。昆蟲口器伸展反應(Proboscis extension reflex，PER)是分析昆蟲味覺行為的一種經(jīng)典的行為范式，其抑制程度可以代表化合物效應的強弱，能夠快速地檢測厭惡性味覺記憶的形成[14-15]。本研究以黑腹果蠅D.melanogaster為材料，利用PER測試和果蠅全腦膜片鉗記錄研究印楝素是否能夠誘導果蠅產生味覺厭惡性記憶，并探討這種記憶形成的細胞機制，以期解釋印楝素存留期與持效期不一致的矛盾現(xiàn)象。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥劑 試驗用的化合物：印楝素A(文中簡稱為印楝素)，由華南農業(yè)大學天然農藥與化學生物學教育部重點實驗室提供；印楝素干粉(印楝素A質量分數(shù)為40.59%)，由成都綠金生物科技有限責任公司提供；蔗糖、奎寧、多巴胺、DMSO及電生理溶液配制試劑購自Sigma-Aldrich上海分公司。行為學試驗中印楝素A純品及印楝素干粉用水溶解，電生理試驗中印楝素A純品用DMSO配制成高濃度(10 mmol·L-1)溶液分裝備用。

1.1.2 果蠅品系及飼養(yǎng) 野生型Canton-S，特異標記多巴胺神經(jīng)元的品系TH-Gal4>UAS-mCD8::GFP。飼養(yǎng)果蠅的食物選用標準的玉米粉培養(yǎng)基，飼養(yǎng)溫度24 ℃，相對濕度60%～70%，12 h光:12 h暗循環(huán)光照。行為學試驗選用1～3日齡的雌性和雄性Canton-S，電生理記錄選用TH-Gal4>UAS-mCD8::GFP子一代雌性果蠅。

1.2 方法

1.2.1 厭惡性味覺記憶檢測 收集羽化后5～7 d的果蠅轉移至新鮮的食物中放置24 h，然后再將果蠅轉移至裝有濕潤濾紙的培養(yǎng)管中饑餓48 h。用CO2麻醉后將果蠅背部黏至載玻片上，放入濕盒內恢復2～3 h。試驗時將載玻片固定在解剖顯微鏡下(Olympus, SZ61)進行訓練和測試。訓練前用100 mmol·L-1的蔗糖刺激果蠅口器，出現(xiàn)口器伸展的個體用于訓練。用水喂飽果蠅后，用蔗糖(作為條件化刺激)刺激足部2～3 s，連續(xù)3次，每次間隔10 s，選取3次刺激都能夠伸喙的果蠅用于進一步的測試。每次給予刺激時，在蔗糖刺激足部的同時將奎寧、印楝素等不同的化合物溶液(非條件化刺激)運送至果蠅口器，讓果蠅取食直至縮回口器。訓練結束用水清洗足部和口器，并用水將果蠅喂飽。5 min后用蔗糖刺激足部，觀察口器是否伸展。每種化合物用3批果蠅測試，每批20～30只果蠅。

1.2.2 電生理記錄 果蠅全腦制備方法參照Gu等[16]的報道。在含有木瓜蛋白酶(Papain, 20 U·mL-1；Worthington, Freehold, NJ, USA)及激活劑(L-cystein, 1 mmol·L-1)的解剖液[用V(O2)∶V(CO2)為95∶5的混合氣充分飽和]中將果蠅整個大腦從頭部中摘除，去除腦殼和腦組織表面的結締組織，將腦組織移至含有記錄液的浴槽中，將腦組織背側或腹側面朝上放置并用自制的U形鉑金框架固定，記錄前用連續(xù)流動的含氧記錄液孵育至少10 min。試驗中含氧記錄液灌流貫穿整個記錄過程。在熒光蛋白標記指引下，定位不同亞群的多巴胺神經(jīng)元作為記錄對象。正常記錄外液成分及濃度(單位：mmol·L-1)： NaCl 101、CaCl21、MgCl24、KCl 3、葡萄糖5、NaH2PO41.25、NaHCO320.7，pH 7.2，滲透壓250 Osm。全細胞記錄電極電阻為10～15 MΩ。電極內液成分及濃度(單位：mmol·L-1)：葡萄糖酸鉀102、CaCl20.085、MgCl21.7、NaCl 17、EGTA 0.94、HEPES 8.5，pH 7.2，滲透壓235 Osm。記錄過程中，印楝素通過灌流的方式施加入浴液，觀察10～20 min。多巴胺受體電流通過程控灌流給藥系統(tǒng)以壓力注射的方式觸發(fā)多巴胺電流。采用BX51WI正置固定載物臺顯微鏡(Olympus, Lehigh Valley, PA,USA)、Multiclamp700B放大器和Digital 1440A D-A轉換器(Molecular Devices, Foster City, CA， USA)。

1.2.3 免疫熒光 利用全腦制備方法分離TH-Gal4>UAS-mCD8::GFP品系果蠅的全腦，轉移至入體積分數(shù)為4%的多聚甲醛中，冰上固定1～3 h，室溫下用 PBS清洗3次，再用含體積分數(shù)為10%正常山羊血清和體積分數(shù)為 0.3%Triton X-100的 PBS 溶液(PBST)在室溫下封閉1～3 h，然后用兔抗GFP抗體(Cell signaling technology， 體積比1∶500)4 ℃孵育24 h；PBST室溫清洗30 min后將腦孵育于含有山羊抗兔Alexa Fluor488(分子探針，體積比1∶200)二抗中，4 ℃放置 24～48 h；最后，室溫下清洗后用抗熒光淬滅封片劑進行封片。成像采用蔡司公司LSM780激光共聚焦顯微鏡(Oberkochen, Germany)，在20倍物鏡下進行全腦拍照。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 電生理數(shù)據(jù)分析采用pClamp 10軟件包中的clampfit功能，用于分析印楝素對多巴胺神經(jīng)元自發(fā)電活動、靜息膜電位、膜電導及多巴胺受體電流的影響。所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析采用生物統(tǒng)計軟件SPSS20.0，行為學試驗結果分析采用Fisher精確檢驗，電生理數(shù)據(jù)采用t檢驗或單因素方差分析，數(shù)據(jù)均以平均值±標準誤表示。P<0.007(行為學數(shù)據(jù))或P<0.05(電生理數(shù)據(jù))時認為有統(tǒng)計學差異。

2 結果與分析

2.1 印楝素誘導果蠅短期厭惡性味覺記憶形成

采用改進的單只果蠅味覺條件化行為范式(圖1)，通過訓練果蠅對甜味覺條件化蔗糖刺激與厭惡性非條件化刺激進行關聯(lián)，從而誘導果蠅對特定化合物的厭惡反應。在給予果蠅蔗糖與印楝素、印楝素干粉、奎寧配對刺激后，果蠅形成了條件化PER抑制。圖2a顯示，隨訓練次數(shù)增加，印楝素A、印楝素干粉及奎寧抑制果蠅PER的作用逐漸增強；純凈水和蔗糖刺激時，果蠅PER在訓練前、訓練中和測試時無明顯差異。圖2b比較了測試時各化合物組間的記憶指數(shù)，印楝素A純品、印楝素干粉、奎寧與對照(純凈水)均有顯著差異(P<0.007)；印楝素A與印楝素干粉組間也存在明顯差異(P<0.007)；印楝素干粉組與奎寧組差異不顯著。

訓練前先用100 mmol·L-1蔗糖刺激足部3次，以誘導果蠅口器伸展；訓練時給予3串訓練，每串含3次蔗糖刺激，口器伸展后給予1 mmol·L-1印楝素；測試時只給蔗糖刺激足部，檢測口器伸展情況。

圖1 味覺厭惡記憶測試示意圖(修改自文獻[8])
Fig.1 The testing scheme of aversive taste memory of fruit fly (revised from literature[8])

a：印楝素純品及干粉明顯抑制果蠅口器伸展的概率，干粉的抑制效果尤為顯著，提示厭惡性味覺記憶的產生; b：測試時不同化合物組間記憶指數(shù)比較。A─印楝素干粉(2.46 mmol·L-1, 其中印楝素A 為1 mmol·L-1),PA─印楝素A(1 mmol·L-1),Q─奎寧(10 mmol·L-1),S─蔗糖(100 mmol·L-1),W─純凈水;*和***分別表示對比的兩組間差異達顯著和極顯著(*P<0.007，***P<0.000 01，F(xiàn)isher精準檢驗)。

圖2 印楝素誘導的條件化味覺抑制

Fig.2 Azadirathin-induced conditional gustatory suppression

2.2 印楝素對不同亞群多巴胺能神經(jīng)元興奮性的影響

果蠅腦內的多巴胺能神經(jīng)元散布于全腦，根據(jù)其胞體位置分為15個亞群，本試驗電記錄時主要選取蘑菇體附近的6個亞群(PPL1、PPL2、PPM1/2、PPM3、PAL、PAM)進行記錄。圖3顯示利用GAL4/UAS二元表達系統(tǒng)及綠色熒光蛋白標記的果蠅腦內6個亞群多巴胺能神經(jīng)元的腦區(qū)分布。全細胞電流鉗模式下，6個亞群多巴胺神經(jīng)元靜息膜電位基本一致，為(-50±5.4)mV，但各自的自發(fā)電活動特征有明顯的不同；在2 μmol·L-1印楝素作用下6個亞群呈現(xiàn)不同的反應特征，PPL1亞群興奮性增加顯著，膜電位去極化幅度為(7.2±3.3)mV(P<0.05，n=6)，PAM和PPM2亞群興奮性輕度提高，而其余3個亞群興奮性呈降低趨勢(圖4)。電壓鉗斜坡電壓注入下[(-90～80)mV]，6個亞群多巴胺神經(jīng)元膜電流激活閾值也各不相同，PAM、PPM1/2、PPM3、PAL亞群激活閾值較低，而PPL1、PPL2亞群激活閾值較高。加入印楝素(2 μmol·L-1)5 min 后，PPL1電導增加明顯并可觸發(fā)動作電位(閾值約-45 mV)，其他亞群電導變化不顯著(圖5)。

a：TH-GAL4>UAS-mCD8::GFP品系果蠅標記的多巴胺能神經(jīng)元亞群的背側面觀; b：TH-GAL4>UAS-mCD8::GFP品系果蠅標記的多巴胺能神經(jīng)元亞群的腹側面觀。標尺代表100 μm。

圖3 果蠅腦內6個不同亞群多巴胺能神經(jīng)元的解剖位置
Fig.3 The anatomical locations of six different clusters of dopaminergic neurons inDrosophilabrain

圖4 印楝素對6個亞群多巴胺能神經(jīng)元靜息膜電位與自發(fā)電活動的影響

Fig.4 Effects of azadirachtin on resting membrane potential and spontaneous activities of six clusters of dopaminergic neurons

圖5 印楝素對6個亞群多巴胺能神經(jīng)元膜電導的影響Fig.5 Effects of azadirachtin on membrane conductances of six clusters of dopaminergic neurons

2.3 印楝素對多巴胺受體的影響

鑒于D1型受體在厭惡性記憶的形成與遺忘過程中的重要作用[17]，試驗進一步檢測印楝素對多巴胺受體功能的影響。通過壓力注射給藥方法，在蘑菇體內的神經(jīng)元上我們記錄到多巴胺受體電流(圖6a)，提前孵育2 μmol·L-1印楝素增強了電流幅值，當印楝素與D1受體特異性拮抗劑SCH23390同時使用則明顯降低了印楝素的增強效應(圖6b)。

a：多巴胺受體電流曲線記錄示例，提前孵育2 μmol·L-1印楝素增加了電流幅值，提前孵育印楝素與D1受體特異性拮抗劑SCH23390抑制了印楝素的增強效應。b：不同條件下觸發(fā)的受體電流總結圖，*P<0.05(One-way ANOVA)。DA:500 μmol·L-1多巴胺；AZA+DA:印楝素預孵育，2 μmol·L-1印楝素+500 μmol·L-1多巴胺；AZA+SCH23390+DA：印楝素與SCH23390提前共同預孵育，2 μmol·L-1印楝素+10 μmol·L-1SCH23390+500 μmol·L-1多巴胺。

圖6 印楝素對多巴胺受體電流的影響
Fig.6 Effect of azadirachtin on dopamine receptor current

3 討論與結論

本研究根據(jù)印楝素半衰期與持效期不一致的現(xiàn)象，從昆蟲記憶的角度檢測了印楝素與味覺記憶的關系，發(fā)現(xiàn)印楝素可誘導果蠅產生短期厭惡性味覺記憶，且這種記憶的形成與印楝素對腦內多巴胺能神經(jīng)元及其受體的作用有關。

與哺乳類動物類似，昆蟲也可以根據(jù)先前的經(jīng)歷形成味覺記憶，以利于將來的食物選擇[13]。苦味覺刺激可以作為誘導劑，與甜味覺配對可誘導PER抑制，且先前的經(jīng)歷可調控PER[15, 18]。與昆蟲嗅覺記憶研究相比，有關味覺記憶的研究較少。近年的研究顯示昆蟲不僅可以形成味覺關聯(lián)性記憶，還與嗅記憶類似，要求蘑菇體與多巴胺能神經(jīng)元參與這種記憶的形成與調控。本研究中，與公認的苦味劑奎寧效應類似，印楝素A純品和印楝素干粉也可以誘導果蠅形成短期厭惡性記憶，而且印楝干粉對PER的抑制程度高于奎寧。印楝干粉的效果好于印楝素A純品提示印楝素干粉中的其他成分起到了協(xié)同增效的作用。果蠅嗅覺學習記憶按時程可分為短期(持續(xù)數(shù)分鐘至1 h)、中期(持續(xù)數(shù)小時)和長期記憶(持續(xù)24 h至1周)[19]。目前味覺記憶的研究只關注了訓練后30 min(短期)的記憶[15, 20]。印楝素能否誘導更長期的厭惡性味覺記憶形成有待進一步檢測。

果蠅腦內支配蘑菇體不同區(qū)域的多巴胺能神經(jīng)元具有不同的功能特點。已經(jīng)證實參與調控厭惡性記憶的有PPL1亞群的MB-MP1、MB-MV1 亞類及PAM亞群的MB-M3亞類[6-8]。本研究中不同亞群多巴胺能神經(jīng)元對印楝素的不同反應特征提示，印楝素可以作為強化刺激，進而選擇性地激活調控厭惡記憶的多巴胺能神經(jīng)元亞群。電擊及DEET誘導的厭惡記憶研究表明，不同的厭惡性記憶共用介導負向強化刺激的多巴胺能神經(jīng)元。印楝素特異性地提高PPL1亞群神經(jīng)元的興奮性進一步支持了這一規(guī)律。今后將進一步開展研究，以明確印楝素激活的PPL1亞群中的具體亞類。

多巴胺釋放后需要結合突觸后膜的多巴胺受體才能發(fā)揮其功能。蘑菇體是昆蟲的學習記憶中樞，也是多巴胺能神經(jīng)元最重要的突觸后靶點之一，其內在神經(jīng)元中表達的2個D1R(DopR1和DopR2)已被證實參與調控厭惡性記憶的形成與遺忘[17]。印楝素可以興奮PPL1亞群神經(jīng)元、增加多巴胺釋放，極有可能直接作用于多巴胺受體。本研究的結果顯示，印楝素確實增加了蘑菇體內在神經(jīng)元上的多巴胺受體電流；此外，D1受體特異性拮抗劑降低印楝素的增強效應，提示D1受體可能是印楝素的作用靶標。果蠅腦內不同類型的多巴胺受體有著不同的功能，近期研究發(fā)現(xiàn)突觸前和突觸后膜的D2R皆參與了調控學習記憶[21]。印楝素是否也能夠影響D2R將是一個有趣的方向。

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【責任編輯 周志紅】

Induction of aversive taste memory by azadirachtin and its effects on dopaminergic neurons of Drosophila

YAN Ying1, GU Huaiyu2, XU Hanhong1, ZHANG Zhixiang1

(1 Key Laboratory of Natural Pesticide and Chemical Biology, Ministry of Education/College of Agriculture， South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 2 Zhongshan School of Medicine, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, China)

【Objective】 To investigate the inductive effects of azadirachtin on taste memory inDrosophilamelanogaster(fruit fly) and the regulation of dopamine signaling in such memory formation. 【Method】Aversive taste memory induced by azadirachtin was tested by proboscis extension reflex (PER). Effects of azadirachtin on membrane excitability and receptor currents of dopaminergic neurons inD.melanogasterbrain were studied using pressure injection combined with whole-cell patch clamp recording. 【Result】Both azadirachtin A and the azadirachtin dry powder could significantly inhibit the probability of PER，which were 60.34% and 17.24% respectively(P<0.007). The effect of dry powder was more obvious. Different clusters of dopaminergic neurons responded variously to azadirachtin. PPL1, PAM and PPM2 subgroups showed increasing trends in excitability, in which the changes of PPL1 cluster neurons were most pronounced. Azadirachtin showed agonistic effect on D1 receptor, and such effect could be inhibited by D1 receptor specific antagonists.【Conclusion】Azadirachtin can induce aversive taste memory inDrosophila, and such memory is regulated by dopaminergic signals in the brain.

azadirachtin; aversive taste memory; dopamine; neuronal excitability;Drosophila

2016- 02- 21 優(yōu)先出版時間：2017- 06-21

燕 潁(1982─)，女，博士，E-mail:yyingyan200@126.com；通信作者：徐漢虹(1961─)，男，教授，博士，E-mail: hhxu@scau.edu.cn; 張志祥(1974—)，男，教授，博士，E-mail:zdsys@scau.edu.cn

中國博士后基金(2015M572330)；國家自然科學基金(31471793)

S482.1

A

1001- 411X(2017)04- 0012- 07

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.s.20170621.1907.002.html

燕 潁， 顧懷宇， 徐漢虹, 等.印楝素對果蠅厭惡性味覺記憶的誘導及多巴胺能神經(jīng)元的影響[J].華南農業(yè)大學學報，2017,38(4):12- 18.