范廷廷，董 丹，張 魯，張 立

(吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院 腎病科，吉林 長春130021)

*通訊作者

糖尿病腎病足細(xì)胞損傷早期診斷的研究進(jìn)展

范廷廷，董 丹，張 魯，張 立*

(吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院 腎病科，吉林 長春130021)

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最常見的慢性并發(fā)癥之一，是糖尿病患者死亡的主要原因。臨床上約30%-50%的1型DM患者及5 %-10%的2型DM患者發(fā)展為DN，且有1/3的患者最后發(fā)展為終末期腎病(end-stage renal disease,ESRD)[1]。足細(xì)胞位于腎小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)的外側(cè)，連同GBM和毛細(xì)血管內(nèi)皮一起構(gòu)成了腎小球血液濾過屏障，因此又稱腎小球臟層上皮細(xì)胞，是一種高度分化的細(xì)胞。近年來許多研究[2-4]發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞損傷在DN的發(fā)展中起關(guān)鍵性作用。本文就糖尿病腎病足細(xì)胞損傷早期診斷的研究進(jìn)展作一綜述。

1 足細(xì)胞損傷的早期診斷

足細(xì)胞作為腎小球?yàn)V過屏障的重要組成部分。許多研究[2-4]表明，足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定與DN密切相關(guān)，DM漸進(jìn)性發(fā)展為DN或可能是足細(xì)胞損傷所致，因此對(duì)足細(xì)胞損傷的相關(guān)標(biāo)志蛋白、mRNA及microRNA等的監(jiān)測對(duì)DN的早期診斷意義重大。

2.起伏期（2007-2017）研究內(nèi)容與研究領(lǐng)域開始擴(kuò)展，在六年的時(shí)間里共有101篇關(guān)于民居植物文化的研究文獻(xiàn)發(fā)表，在文獻(xiàn)發(fā)表數(shù)量上呈現(xiàn)出反復(fù)升降但整體上升的趨勢。其中2011-2013年間發(fā)表的文獻(xiàn)量最多，在這三年內(nèi)期刊發(fā)表量達(dá)到了16篇，占期刊文獻(xiàn)總量的37.2%，博碩論文也有28篇，約占博碩論文總數(shù)的35%。

1.1 尿足細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志蛋白

絕緣體是電力電纜的重要保護(hù)層，發(fā)揮明顯的防護(hù)作用，在電纜整體工作和安全穩(wěn)定運(yùn)行的過程中，考慮到絕緣體物質(zhì)的特殊性，要求對(duì)故障反映分析。高溫以及強(qiáng)電壓的作用下，容易存在絕緣體本身的電阻率改變的現(xiàn)象，由于本身存在突發(fā)性，需提前進(jìn)行效能分析，對(duì)介質(zhì)的消耗磨損程度分析。為了避免出現(xiàn)絕緣老化和崩潰等反應(yīng)，要求進(jìn)行電力電纜創(chuàng)新分析，減少故障。

1.3 尿足細(xì)胞標(biāo)志microRNA(miRNA) miRNA是近年發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性、非編碼小RNA，與其靶基因3’非翻譯區(qū)(3’-UTR)的堿基互補(bǔ)配對(duì)，從而在轉(zhuǎn)錄后水平導(dǎo)致mRNA的降解或抑制，發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用。miRNA在生物的發(fā)育分化，細(xì)胞增殖、凋亡，及器官形成及疾病發(fā)生中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。近年來的一些研究表明，miRNA可能參與了DN的發(fā)生發(fā)展，但其具體機(jī)制不詳，需要進(jìn)一步深入研究，如miR-29家族中的miR-29a、 miR-29b[18]、miR-29c[19]具有抗纖維化的作用； miR-29a轉(zhuǎn)基小鼠腎功能得到明顯改善，足細(xì)胞活性增強(qiáng)[20]。另外在Yang H[21]的研究中發(fā)現(xiàn)在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞中miRNA-218表達(dá)上調(diào)，miRNA-218可通過抑制靶基因HO-1加速細(xì)胞凋亡，而HO-1在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞內(nèi)抑制p38-MAPK的磷酸化，進(jìn)而表明miRNA-28可能是DN足細(xì)胞損傷及治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

看似不相關(guān)的事例、問題，實(shí)則是本節(jié)課層層遞進(jìn)的學(xué)習(xí)目標(biāo)。在學(xué)習(xí)目標(biāo)的引領(lǐng)下，小組同學(xué)相互支持與配合，積極承擔(dān)個(gè)人責(zé)任。6組學(xué)生課前對(duì)教師提供的材料進(jìn)行觀察，結(jié)合問題展開討論，成員間密切配合，達(dá)成共識(shí)，并完成課堂交流課件，書寫成文稿。

1.1.2 Nephrin 根據(jù)足細(xì)胞相關(guān)蛋白的分布和功能不同，可將其分為裂孔膜蛋白、頂膜區(qū)蛋白、基底膜區(qū)蛋白和細(xì)胞骨架蛋白。裂孔膜蛋白包括Nephrin、Podocin、CD2AP等，其中Nephrin是裂孔膜的重要組成部分[8]，因此Nephrin可能成為足細(xì)胞損傷的標(biāo)志物。前期研究已發(fā)現(xiàn)DM大鼠出現(xiàn)白蛋白尿,是腎臟損傷的早期指標(biāo),隨著尿蛋白的增多,腎臟病理改變加重，且nephrin蛋白表達(dá)降低,提示nephrin蛋白參與DM大鼠蛋白尿的產(chǎn)生與發(fā)展[9]。Markus 等[10]將23只大鼠隨即分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，研究發(fā)現(xiàn)兩組間的腎功能、尿蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)組尿Nephrin排泄量顯著升高。 Chang等[11]研究顯示DN小鼠出現(xiàn)糖尿病、蛋白尿的同時(shí)也伴隨足細(xì)胞凋亡和尿Nephrin排泄增加。16周和20周齡小鼠，尿Nephrin排泄量明顯增加，并且與尿白蛋白排泄率呈正相關(guān)，提示尿Nephrin排泄率增加與足細(xì)胞損傷有關(guān)。Jim等[12]研究顯示，DN患者腎活檢提示Nephrin的表達(dá)顯著下調(diào)，且伴有微量和大量蛋白尿的DN患者尿Nephrin檢出率為100%，而蛋白尿?yàn)殛幮缘娜四騈ephrin檢出率為54%，尿Nephrin水平與尿蛋白量及收縮壓成正相關(guān)，與血清白蛋白及腎小球?yàn)V過率(eGFR)成負(fù)相關(guān)。上述結(jié)論均提示Nephrin可能作為診斷DN的早期預(yù)測指標(biāo)。

1.4 骨橋蛋白(Osteopontin,OPN) OPN是一種表達(dá)在骨、內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球基底膜的鈣結(jié)合蛋白[22]。有研究表明DM患者血漿OPN水平與DN的嚴(yán)重程度顯著相關(guān)[23]，在急性腎臟疾病的動(dòng)物模型尿液檢測OPN排泄水平也明顯升高[24]。Al-Malki AL[25]的研究發(fā)現(xiàn)在DM微量蛋白尿期檢測到尿IgM和OPN水平顯著升高，且尿IgM和OPN水平與足細(xì)數(shù)量成正相關(guān)，表明結(jié)合尿IgM和OPN可更可靠的檢測足細(xì)胞損傷。

1.1.1 Podocalyxin(PC) PC是足細(xì)胞正常表達(dá)的一種跨膜糖蛋白，也是足突頂端質(zhì)膜的重要組成部分，其可能通過①其所帶負(fù)電荷的排斥作用而防止相鄰足細(xì)胞之間足突的黏附；②維持足細(xì)胞的正常形態(tài)和完整性等作用機(jī)制參與維持足細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)及濾過屏障。敲除podocalyxin基因的大鼠在腎臟發(fā)育過程中無法形成足突，進(jìn)而腎功能進(jìn)行性下降，無法形成尿液[2,3]。受損的足細(xì)胞電鏡下表現(xiàn)為空泡化、足突間裂孔隔膜的消失、足突的破壞及消失，以及從腎小球基底膜上分離[4]。當(dāng)足細(xì)胞損傷后，足突表面的PC即可發(fā)生改變。近年來的研究表明，DN患者腎活檢組織電鏡下可見足細(xì)胞分離現(xiàn)象，即使尿蛋白正常的DM患者也可出現(xiàn)，同時(shí)可在尿中檢測到標(biāo)記有PC的足細(xì)胞片段，提示PC可能成為DN的早期標(biāo)志物，但其機(jī)制尚不明確[5]。Ye 等[6]檢測了68例2型DN患者(其中包括正常蛋白尿，微量蛋白尿，大量蛋白尿3組)和28例正常健康者的尿PC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有DN患者尿PC水平均明顯高于正常對(duì)照組，此結(jié)果也表明DN患者在未出現(xiàn)蛋白尿前已經(jīng)出現(xiàn)尿PC的異常，這進(jìn)一步表明尿PC可作為較早期診斷DN的標(biāo)志。Shoji M[7]的研究也表明在微量白蛋白尿的DM患者PC水平較無蛋白尿的DM患者明顯升高，且PC水平與尿蛋白/肌酐比值存在相關(guān)性，DPP4i和a-GI可降低PC水平，表明PC不僅可作為DN早期損傷的標(biāo)志，而且可作為一個(gè)治療靶點(diǎn)。

1.2 足細(xì)胞標(biāo)志性mRNA 近年來，隨著更可靠的尿沉渣RNA提取方法及實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)的發(fā)展，尿沉渣中的mRNA表達(dá)的量化已成為一個(gè)研究腎臟疾病的新方法。一些初步的研究表明，測定尿中mRNA表達(dá)水平可能對(duì)監(jiān)測腎臟疾病的發(fā)展有重要價(jià)值[13]。Do 等[14]對(duì)67例DM患者(根據(jù)尿白蛋白/肌酐值分3個(gè)亞組:正常蛋白尿組：<30 mg/g；微量蛋白尿組：30-300 mg/g；大量蛋白尿組：>300 mg/g)及15名健康者的尿液nephrin、podocin及podocalyxinmRNA進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果顯示DM組以上足細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)顯著升高，尿nephrin與尿蛋白水平成正相關(guān)，在log10中每增加一單位nephrin，蛋白尿的風(fēng)險(xiǎn)增加20%，在DM患者3個(gè)亞組中尿中nephrin檢出率分別為53%、71%、90%。Zheng等[15]運(yùn)用PCR技術(shù)對(duì)51例DN患者及13例健康對(duì)照患者尿中podocalyxin、CD2-AP、a-actin4與podocin mRNA進(jìn)行量化分析發(fā)現(xiàn)，DN組以上所有因子mRNA水平顯著高于對(duì)照組，并且mRNA表達(dá)水平與DN的進(jìn)展程度相關(guān)，隨著DN 的進(jìn)展，其mRNA表達(dá)水平升高。該研究還發(fā)現(xiàn)podocalyxin、 CD2-AP、 a-actin4、podocin mRNA表達(dá)水平與血肌酐成正比，podocalyxin mRNA水平與eGFR成負(fù)相關(guān)，這進(jìn)一步表明足細(xì)胞相關(guān)mRNA定量檢測將作為檢測DN的生物標(biāo)志物。Wang等[16]運(yùn)用PCR技術(shù)對(duì)21例腎活檢證實(shí)為DN的患者及9名健康人的尿nephrin、podocin mRNA進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)DN患者其mRNA的表達(dá)較健康對(duì)照組顯著升高，亦提示尿足細(xì)胞相關(guān)分子mRNA的表達(dá)可用于DN的分級(jí)。有研究指出podocin mRNA，可作為足細(xì)胞應(yīng)激的標(biāo)志物，如Lioudaki等[17]運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量方法檢測了71例2型DM患者及39例非DM患者尿液中的podocin mRNA水平，結(jié)果顯示DM患者尿中podocin mRNA的表達(dá)水平比對(duì)照組高，logistic回歸分析顯示， podocin mRNA的表達(dá)與DM具有極大的關(guān)聯(lián)性，DM患者的高糖環(huán)境是尿中podocin mRNA表達(dá)的唯一決定因素，這也說明podocin mRNA有望作為早期診斷DN的一個(gè)重要檢測手段。

鋼琴Ⅱ模仿樂隊(duì)伴奏的效果。演奏者在練習(xí)時(shí)，內(nèi)心要清晰地感受到兩個(gè)八分音符的節(jié)奏律動(dòng)，猶如一個(gè)指揮家般掌握穩(wěn)定的速度，抑制旋律聲部“拖延”或“趕”節(jié)奏。八分休止符準(zhǔn)確，后半拍的跳音要整齊、輕巧，富有動(dòng)力。演奏時(shí)跳音應(yīng)貼鍵“拔”起，手腕不能松懈。

1.5 血管內(nèi)皮生長因子A(Vascular endothelial growth factor A,VEGF-A) VEGF-A是一種促血管生長因子，在腎臟中主要是由足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞分泌。研究證實(shí)在DM患者中，特別是在早期DN的發(fā)展的階段，VEGF的表達(dá)上調(diào)。Kim NH[26]研究證明DM與非DM健康對(duì)照組相比，尿中VEGF水平明顯身高，甚至在蛋白尿期也明顯升高，并且尿VEGF水平與DN的嚴(yán)重程度相關(guān)，這表明，尿VEGF可能作為DN早期診斷和預(yù)測疾病進(jìn)展方面的一個(gè)敏感指標(biāo)。

1.6 Wilms’Tumor-1 (WT1) WT1是一種腫瘤抑制基因。研究發(fā)現(xiàn)，其與許多腎小球疾病的發(fā)生有密切聯(lián)系，腎臟成熟后，其表達(dá)僅限于足細(xì)胞，對(duì)足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能有重要作用[27]。Anuradha Kalani等[28]的研究也發(fā)現(xiàn)1型DM患者的尿WT1蛋白水平與尿蛋白/肌酐比值、肌酐/白蛋白比值和血清肌酐水平呈正相關(guān)，與eGFR呈負(fù)相關(guān)。然而還有50%的DM患者在非蛋白尿期仍能檢測到尿WT1蛋白，而非DM受試者幾乎檢測不到WT1水平。這些結(jié)果表明，尿WT1蛋白水平可作為足細(xì)胞標(biāo)志物來早期診斷DN。

2 小結(jié)與展望

腎小球足細(xì)胞作為一種終末分化細(xì)胞，在維護(hù)腎小球?yàn)V過屏障的結(jié)構(gòu)和功能中起著關(guān)鍵性的作用，一旦損傷將難以逆轉(zhuǎn)。DN治療的關(guān)鍵在于早期診斷,通過上述方法對(duì)DN患者足細(xì)胞損傷進(jìn)行早期檢測及監(jiān)測疾病進(jìn)展，目前臨床工作中尚未廣泛應(yīng)用。探求高靈敏度、低成本的檢測足細(xì)胞損傷的方法用于DN的早期診斷及治療至關(guān)重要，足細(xì)胞損傷的診斷方法仍需進(jìn)一步探討。

[1]Barnett A.Prevention of loss of renal function over time in patients with diabetic nephropathy [J].Am J Med 2006,119(5 Suppl 1):40S.

[2]Vitureira N,Andres R,Perez-Martinez E,et al.Podocalyxin is a novel polysialylated neural adhesion protein with multiple roles in neural development and synapse formation [J].PloS one,2010,5(8):e12003.

[3]Nielsen JS,McNagny KM.The role of podocalyxin in health and disease [J].Journal of the American Society of Nephrology:JASN,2009,20(8):1669.

[4]Whiteside RC,Snezana Munk,Jacob Levy.Podocytic cytoskeletal disaggregation and basementmembrane detachment in puromycin aminonucleoside nephrosis [J].American Journal of Pathology,1993,142(5):1641.

[5]Weil EJ,Lemley KV,Mason CC,et al.Podocyte detachment and reduced glomerular capillary endothelial fenestration promote kidney disease in type 2 diabetic nephropathy[J].Kidney international,2012,82(9):1010.

[6]Ye H,Bai X,Gao H,et al.Urinary podocalyxin positive-element occurs in the early stage of diabetic nephropathy and is correlated with a clinical diagnosis of diabetic nephropathy [J].Journal of diabetes and its complications,2014,28(1):96.

[7]Shoji M,Kobayashi K,Takemoto M,et al.Urinary podocalyxin levels were associated with urinary albumin levels among patients with diabetes[J].Biomarkers:biochemical indicators of exposure,response,and susceptibility to chemicals,2016,21(2):164.

[8]Barisoni L,Schnaper HW,Kopp JB.Advances in the biology and genetics of the podocytopathies:implications for diagnosis and therapy[J].Archives of pathology & laboratory medicine,2009,133(2):201.

[9]屈智慧,楊立志,趙 穎，等.糖尿病大鼠蛋白尿與腎臟病理及nephrin表達(dá)的相關(guān)性研究[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2011,15(9):1441.

[10]Markus LA,Axel K,Karoline VW,et al.Early Urinary and Plasma Biomarkers for Experimental Diabetic Nephropathy[J].Clinical Laboratory,2013,58(7-8):659.

[11]Chang J-H,Paik S-Y,MAO L,et al.Diabetic Kidney Disease in FVB/NJ Akita Mice:Temporal Pattern of Kidney Injury and Urinary Nephrin Excretion[J].Clinical Laboratory,2012,7(4):e33942.

[12]Jim B,Ghanta M,Qipo A,et al.Dysregulated nephrin in diabetic nephropathy of type 2 diabetes:a cross sectional study[J].PloS one,2012,7(5):e36041.

[13]Wang G,Lai FM,Lai KB,et al.Urinary mRNA expression of ACE and ACE2 in human type 2 diabetic nephropathy[J].Diabetologia,2008,51(6):1062.

[14]DO Nascimento,Luis HC,Fernando G,et al.Messenger RNA levels of podocyte-associated proteins in subjects with different degrees of glucose tolerance with or without nephropathy[J].BMC nephrology,2013,14:214.

[15]Zheng M,Lv LL,Ni j,et al.Urinary Podocyte-Associated mRNA profile in Various Stages of Diabetic Nephropathy[J].PLoS One,2011,6(5):e20431.

[16]Wang G,Lai FM,Lai KB,et al.Messenger RNA expression of podocyte-associated molecules in the urinary sediment of patients with diabetic nephropathy [J].Nephron Clinical practice,2007,106(4):c169.

[17]Lioudaki E,Stylianou KG,Petrakis I,et al.Increased Urinary Excretion of Podocyte Markers in Normoalbuminuric Patients with Diabetes[J].Nephron,2015,131(1):34.

[18]Chen HY,Zhong X,Huang XR,et al.MicroRNA-29b inhibits diabetic nephropathy in db/db mice[J].Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy,2014,22(4):842.

[19]Long J,Wang Y,Wang W,et al.MicroRNA-29c is a signature microRNA under high glucose conditions that targets Sprouty homolog 1,and its in vivo knockdown prevents progression of diabetic nephropathy[J].The Journal of biological chemistry,2011,286(13):1837.

[20]Lin CL,Lee PH,Hsu YC,et al.MicroRNA-29a promotion of nephrin acetylation ameliorates hyperglycemia-induced podocyte dysfunction[J].Journal of the American Society of Nephrology:JASN,2014,25(8):1698.

[21]Yang H,Wang Q,Li S.MicroRNA-218 promotes high glucose-induced apoptosis in podocytes by targeting heme oxygenase-1[J].Biochemical and biophysical research communications,2016,471(4):582.

[22]Zhou C,Wu J,Torres L,et al.Blockade of osteopontin inhibits glomerular fibrosis in a model of anti-glomerular basement membrane glomerulonephritis[J].American journal of nephrology,2010,32(4):324.

[23]Yan X,Sano M,Lu L,et al.Plasma concentrations of osteopontin,but not thrombin-cleaved osteopontin,are associated with the presence and severity of nephropathy and coronary artery disease in patients with type 2 diabetes mellitus[J].Cardiovasc Diabetol,2010,9:70.

[24]Raghu V.Durvasula,Stuart J.Shankland.Activation of a local renin angiotensin system in podocytes by glucose[J].Am J Physiol Renal Physiol,2008,294(4):F830.

[25]Al-Malki AL.Assessment of urinary osteopontin in association with podocyte for early predication of nephropathy in diabetic patients [J].Disease markers,2014,ID:493736.

[26]Kim NH,Oh JH,Seo JA,et al.Vascular endothelial growth factor (VEGF) and soluble VEGF receptor FLT-1 in diabetic nephropathy [J].Kidney international,2005,67(1):167.

[27]Mrowka AL,Schedl A.Wilms,Tumor Suppressor Gene WT1:From Structure toRenal Pathophysiologic Features[J].Am Soc Nephrol,2001,11(16):S106.

[28]Kalani A,Mohan A,Godbole MM,et al.Tiwari S.Wilm's tumor-1 protein levels in urinary exosomes from diabetic patients with or without proteinuria [J].PLoS One,2013,8(3):e60177

1007-4287(2017)07-1285-03

范廷廷，吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院腎病科2015級(jí)研究生。

2016-07-27)