李東陽,陳興國,王 勇，王白石,羅 速

(1.天津市泰達(dá)醫(yī)院,天津300457;2.天津醫(yī)科大學(xué)中新生態(tài)城醫(yī)院,天津300467;3.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,吉林 吉林132001)

血清中miRNA對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的影響及臨床意義

李東陽1,陳興國1,王 勇1，王白石2*,羅 速3

(1.天津市泰達(dá)醫(yī)院,天津300457;2.天津醫(yī)科大學(xué)中新生態(tài)城醫(yī)院,天津300467;3.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,吉林 吉林132001)

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)腫瘤之一，也是在中樞神經(jīng)腫瘤中治療效果最差的一種腫瘤[1]。據(jù)相關(guān)部門統(tǒng)計(jì)，在原發(fā)性惡性腫瘤中，惡性膠質(zhì)瘤所占的比例高達(dá)75%以上，且有較高的發(fā)生率和死亡率，這使膠質(zhì)瘤受到了廣泛關(guān)注[2,3]。研究者對膠質(zhì)瘤的分子生物學(xué)進(jìn)行了大量的研究，他們發(fā)現(xiàn)，一些miRNA與膠質(zhì)瘤的發(fā)生有密切的關(guān)系[4,5]。此后，對miRNA與膠質(zhì)瘤的關(guān)系的研究受到了極大的關(guān)注。

miRNA是長度為19-25nt的小分子RNA，它不編碼蛋白質(zhì)，主要的特征是不具有開放閱讀框，且有組織特異性、高度保守性和時(shí)序性[6,7]。近些年來，隨著對miRNA的研究的不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)血清或者是血漿中的miRNA能被用來作為識別腫瘤的標(biāo)志物，這給后續(xù)對腫瘤的研究提供了方向[8,9]。研究顯示，膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-222被敲除后，可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長[10]，膠質(zhì)瘤細(xì)胞被X射線照射后，miR-222的表達(dá)量增加，miR-222的表達(dá)量與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生存率存在正相關(guān)[11]。目前，關(guān)于miR-222與膠質(zhì)瘤的關(guān)系的研究大多在組織和細(xì)胞中進(jìn)行，關(guān)于miR-222在膠質(zhì)瘤患者血液中的表達(dá)情況的研究很少。本研究對miR-222在膠質(zhì)瘤患者血液中的表達(dá)情況以及對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖凋亡進(jìn)行研究。望為后續(xù)的研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)標(biāo)本及分組 實(shí)驗(yàn)組為我院60例經(jīng)病理學(xué)證實(shí)患膠質(zhì)瘤的病人，并根據(jù)病理切片結(jié)果分為高級膠質(zhì)瘤患者和低級膠質(zhì)瘤患者。對照組為20例經(jīng)CT證實(shí)無任何腫瘤性疾病的正常人。實(shí)驗(yàn)組血液標(biāo)本在手術(shù)前30 min采集外周靜脈血，采集的血液標(biāo)本放于-80攝氏度冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑和儀器 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara，反義miR-222NC和反義miR-222由上海吉瑪合成，MTT試劑盒購自美國MP公司，CO2培養(yǎng)箱購自日本SANYO公司，細(xì)胞儀購自美國MG公司，流式細(xì)胞儀購自美國B-D公司，熒光定量儀購自美國ABI公司。

1.2 RT-qPCR檢測與人膠質(zhì)瘤相關(guān)的miRNA的表達(dá)水平

選取已經(jīng)被證實(shí)與人膠質(zhì)瘤相關(guān)的miR-221，miR-222和miR-21作為研究對象。血液樣本離心后取上清，利用提取RNA試劑盒提取RNA。紫外分光光度計(jì)記錄RNA在260 nm和280 nm的吸光度，260 nm/280 nm的比值大于2.0被認(rèn)為是合格的樣品。將合格的樣品根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明反轉(zhuǎn)錄成cDNA，熒光定量PCR檢測miR-221，miR-222和miR-21的表達(dá)量。

1.3 細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

從-80℃冰箱中取出人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251，37℃融化后，將細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2、95%空氣飽和濕度條件下培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的U251細(xì)胞接種于6孔板中，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106個(gè)/ml，置于 5% CO2含量、37℃飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞達(dá)到60%的融合后， 分別將反義miRNA-222NC組和反義miRNA-222組分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，培養(yǎng)6h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行細(xì)胞收集，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 RT-qPCR檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞miR-222的表達(dá)水平

依照RNA提取試劑盒說明書分別提取轉(zhuǎn)染的反義miRNA-222NC轉(zhuǎn)染組和反義miRNA-222轉(zhuǎn)染組的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251的總RNA，紫外分光光度計(jì)測定RNA純度，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用RT-qPCR檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞miR-222的表達(dá)水平。以U6為內(nèi)參基因，每樣樣本設(shè)定4個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.5 miR-222對細(xì)胞增殖的影響

取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中過夜培養(yǎng)，對照組采用常規(guī)培養(yǎng)，反義miR-222NC組和反義miR-222組轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，37℃飽和濕度、5% CO2條件下作用12、24、36、48、72 h后，加入MTT溶液10 μl(5 mg/ml)，37℃條件下培養(yǎng)4 h，加入DMSO溶液100 μl震蕩，待沉淀完全溶解后置于酶標(biāo)儀測定OD值。

1.6 miR-222對細(xì)胞凋亡的影響

基因轉(zhuǎn)染48 h后，用PBS調(diào)整待測細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/ml，取1 ml細(xì)胞懸液至離心管中，4℃，1 000 rpm，離心10 min，棄上清，加入1 ml冰預(yù)冷的PBS 重懸細(xì)胞，再次離心棄上清，PBS重復(fù)洗滌一次，加入Binding Buffer 200 μl重懸細(xì)胞，分別加入5 μl Annexin-V和PI，充分混勻后避光環(huán)境中室溫靜置20 min，加緩沖液300 μl，用流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 膠質(zhì)瘤患者和正常人血液中miR-221，miR-222和miR-21的表達(dá)結(jié)果

如表1所示，高級膠質(zhì)瘤患者血清中miR-221，miR-222和miR-21的相對表達(dá)量顯著高于正常組(P<0.05)，低級膠質(zhì)瘤患者血液中只有miR-21與正常組差異顯著，不同級別的膠質(zhì)瘤中miR-221，miR-222和miR-21的比較發(fā)現(xiàn)，高級膠質(zhì)瘤患者血清中miR-221，miR-222和miR-21的相對表達(dá)量顯著高于低級膠質(zhì)瘤患者(P<0.05)。這提示這3種miRNA可作為判斷腫瘤級別標(biāo)注物。由于miR-222在膠質(zhì)瘤患者血液中的相對表達(dá)量高于miR-221和miR-21，因此，選用miR-222作為后續(xù)的研究。

表1 膠質(zhì)瘤患者和正常人血液中miR-221，miR-222和miR-21的相對表達(dá)量比較

正常人血清比較*P<0.05，與低級別的膠質(zhì)瘤比較#P<0.05

2.2 轉(zhuǎn)染后miR-222的表達(dá)

如表2所示，空白對照組、反義miRNA-222NC轉(zhuǎn)染組和反義miRNA-222轉(zhuǎn)染組的表達(dá)量分別為523.68±4.29、509.64±6.43和12.62±2.12。反義miRNA-222轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的表達(dá)量顯著低于空白對照組(P<0.01)，反義miRNA-222NC轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的表達(dá)量與空白對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 轉(zhuǎn)染對miR-222各組細(xì)胞表達(dá)的影響

與空白對照組相比，**P<0.01

2.3 miRNA-222對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響

各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染12、24、36、48、72 h后，經(jīng)MTT法檢測細(xì)胞增殖情況。結(jié)果如表3所示，隨著時(shí)間的變化，反義miRNA-222轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖速度明顯低于空白對照組和反義miRNA-222NC轉(zhuǎn)染組(P<0.01)。提示下調(diào)miRNA-222的表達(dá)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的增殖。

表3 miRNA-222對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響

與空白對照組相比，*P<0.01，與反義miRNA-222NC轉(zhuǎn)染組相比，#P<0.01

2.4 miRNA-222對膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響

轉(zhuǎn)染后經(jīng)PI/ Annexin-V雙染色用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。如圖1，空白對照組、反義miRNA-222NC轉(zhuǎn)染組和反義miRNA-222轉(zhuǎn)染組的凋亡率分別為3.21%、3.32%和24.36%，反義miRNA-222轉(zhuǎn)染組的凋亡率高于另外兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞凋亡率的變化

3 討論

膠質(zhì)瘤是一種原發(fā)性惡性腫瘤，能對人的中樞系統(tǒng)造成嚴(yán)重的損傷[12]。迄今為止，對膠質(zhì)瘤的治療主要采用的方法是手術(shù)治療輔以放療，這雖然也取得了明顯的效果，但高級膠質(zhì)瘤患者的生存時(shí)間卻很短[13]。一些研究表明，膠質(zhì)瘤的生長速度取決于細(xì)胞生長和抗凋亡能力[14]，血液中的miRNA可作為判斷腫瘤級別的標(biāo)志物[15]。因此，我們從這兩點(diǎn)出發(fā)，對于膠質(zhì)瘤相關(guān)的miRNA的表達(dá)以及增殖凋亡進(jìn)行了研究。

miRNA在腫瘤、癌癥等許多疾病以及正常人的血清和血漿中都能通過定量檢測到，而且疾病的病情和類型不同，在外周血液循環(huán)中所檢測到的miRNA的種類和表達(dá)量也不同[16,17]。我們對已經(jīng)證實(shí)與膠質(zhì)瘤相關(guān)的miR-222、miR-221和miR-21在膠質(zhì)瘤病人血清中的表達(dá)進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，低級膠質(zhì)瘤患者和高級膠質(zhì)瘤患者的miR-222、miR-221和miR-21在血清中表達(dá)量要高于正常人，且這3種 miRNA在高級膠質(zhì)瘤患者的血液中表達(dá)量顯著高于低級膠質(zhì)瘤患者，這說明這3個(gè)miRNA可作為檢測膠質(zhì)瘤級別的標(biāo)志物，也說明這3個(gè)miRNA加速著惡性膠質(zhì)瘤的進(jìn)展。由于miR-222在高、低膠質(zhì)瘤患者血液中的表達(dá)量高于miR-221和miR-21，因此選擇miR-222作為后續(xù)的研究。

一些研究顯示，miRNA與膠質(zhì)瘤的生存、生長和凋亡有很大的關(guān)系[18,19]。研究表明，與正常組相比，miR-195在膠質(zhì)瘤患者細(xì)胞中的水平明顯下降，當(dāng)上調(diào)miR-195的水平時(shí)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖受到抑制[20,21]。這說明對miRNA調(diào)控的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究，更有利于去發(fā)現(xiàn)miRNA在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮的作用。研究顯示，miR-222對多種腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡有關(guān)，研究者將反義miR-222轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞內(nèi)，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡[22,23]。鑒于此，本研究使用同樣的方法將反義miR-222轉(zhuǎn)染到膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，檢測對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后反義miR-222轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖情況顯著低于反義miR-222 NC轉(zhuǎn)染組和空白對照組，其凋亡率也顯著高于另外兩組，這提示miR-222 與膠質(zhì)瘤的發(fā)生有很大的關(guān)系。

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國家863課題(編號2011AA02A11)

1007-4287(2017)07-1113-04

2017-02-15)

*通訊作者