龍玉瑩，葛華，王月，王微

（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，沈陽(yáng)110034；2.附屬中心醫(yī)院循環(huán)科，沈陽(yáng)110075）

鹽酸曲美他嗪調(diào)控自噬對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

龍玉瑩1，葛華2，王月1，王微2

（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，沈陽(yáng)110034；2.附屬中心醫(yī)院循環(huán)科，沈陽(yáng)110075）

目的觀察鹽酸曲美他嗪（TMZ）在大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用，及其與自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白輕鏈3蛋白-Ⅱ（LC3-Ⅱ）和自噬流的另一個(gè)標(biāo)志物p62的關(guān)系，并探討其作用機(jī)制。方法將54只雄性SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組（Sham組）、心肌缺血30 min再灌注組（I/R組）、心肌缺血30 min再灌注藥物干預(yù)組（I/R+TMZ組），每組18只。制備大鼠在體心肌缺血再灌注損傷模型，于即刻、4周、8周后處死大鼠，實(shí)時(shí)定量PCR和Western blotting檢測(cè)心肌組織LC3-Ⅱ和p62的表達(dá)水平，HE染色觀察心肌組織形態(tài)改變。結(jié)果與Sham組相比，I/R組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ和p62的表達(dá)水平增高（P＜0.05）；與I/R組相比，I/ R+TMZ組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ和p62的表達(dá)水平降低（P＜0.05）。在第4周時(shí)心肌細(xì)胞中LC3-Ⅱ和p62的表達(dá)水平增高（P＜0.05）；在第8周時(shí)心肌細(xì)胞中LC3-Ⅱ和p62的表達(dá)水平降低（P＜0.05）。結(jié)論TMZ的干預(yù)可能通過(guò)調(diào)節(jié)自噬流對(duì)大鼠損傷的心肌起保護(hù)作用，并存在一定的時(shí)間效應(yīng)。

鹽酸曲美他嗪；心肌缺血再灌注損傷；自噬；LC3-Ⅱ；P62

臨床上，對(duì)急性心肌梗死患者的治療，主要是溶栓、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療和冠狀動(dòng)脈搭橋。再灌注治療可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡［1-2］，即心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）。近年來(lái)，對(duì)于自噬在MIRI中發(fā)揮的保護(hù)作用已有比較清晰的了解。自噬相關(guān)蛋白-微管相關(guān)蛋白連鏈3蛋白（microtubule-associated protein light chain 3 protein，LC3）是目前所知的唯一在自噬體上表達(dá)的蛋白，被稱為自噬標(biāo)志物［3］，p62與LC3直接結(jié)合［4］，在自噬調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。鹽酸曲美他嗪（Trimetazidine，TMZ）在早期MIRI中有抗細(xì)胞凋亡的作用［5］，對(duì)心肌細(xì)胞具有獨(dú)特的保護(hù)作用，并已在臨床上廣泛應(yīng)用。TMZ對(duì)于MIRI后的心肌有保護(hù)作用，但對(duì)于其在LC3和p62介導(dǎo)的自噬中少有研究報(bào)道。本研究選用大鼠MIRI模型，給予TMZ治療，觀察其能否對(duì)MIRI的心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用，并初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

健康成年雄性SD大鼠54只，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供［SCXK（遼）2015-0001］。TMZ：施維雅（天津）制藥有限公司，準(zhǔn)字H20100077，小動(dòng)物呼吸機(jī)：ALC-V系列動(dòng)物呼吸機(jī)，垂直電泳儀（北京六一高壓雙穩(wěn)電泳儀電源DYY-4C），北京六一DYCZ-24DN迷你雙垂直電泳儀電泳槽蛋白凝膠電泳儀轉(zhuǎn)膜儀，水平搖床（北京市六一儀器廠），轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)BIO-RAD公司，Trans-Blot cell），化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)Western blotting成像分析（Clinx上海勤翔，ChemiScope 3600 Mini）。

1.2 動(dòng)物分組處理和模型制備

將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組），心肌缺血30 min再灌注（I/R組），心肌缺血30 min再灌注+ TMZ組（I/R+TMZ組），每組18只。Sham組不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支；I/R組、I/R+TMZ組結(jié)扎大鼠心臟冠狀動(dòng)脈左前降支30 min后解開(kāi)結(jié)扎線，釋放血流，建立大鼠在體心肌缺血再灌注損傷模型。I/R+ TMZ組每天15：00用20 mg/（kg·d）［5］TMZ溶于1 mL生理鹽水灌胃至取材，Sham組和I/R組每天15：30給予同體積的生理鹽水灌胃至取材。

造模完成后，分別于即時(shí)、4周、8周隨機(jī)抽取6只處死大鼠。取左心室前壁心肌組織，HE染色標(biāo)本置于4%甲醛溶液中保存，實(shí)時(shí)定量PCR標(biāo)本置于Trizol溶液中保存，Western blotting檢測(cè)標(biāo)本放入-80℃冰箱保存。

1.3 HE染色

取左心室前壁的心肌組織，4%甲醛固定，沖洗，逐級(jí)脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，切片，粘片，烤片，蘇木精伊紅染色，透明、封固后在光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)的變化。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)

取左心室前壁心肌組織，加入Trizol試劑勻漿，提取總RNA后，測(cè)定濃度，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)。GAPDH上游引物序列5’-GGCACAGTCAAGGC TGAGAATG-3’，下游引物序列5’-ATGGTGGTGAA GACGCCAGTA-3’，p62上游引物序列5’-GGGCTTT GGTTCGTG-3’，下游引物序列5’-CCTTGACTCTGG CTGTAAT-3’，LC3-Ⅱ上游引物序列5’-CGGCGTCT TTGTGGGT-3’，下游引物序列5’-ATGCCTCTTGAT ACTGCTTGA-3’。進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，應(yīng)用RT-PCR儀中自帶的軟件分析出相應(yīng)的Ct值，再用power（2-ΔΔCt）法計(jì)算出各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的LC3-Ⅱ、p62和GAPDH的mRNA的表達(dá)水平。

1.5 Western blotting

取左心室前壁心肌組織，加入裂解液后，10 000 r/min離心20 min，收集上清，測(cè)定蛋白濃度。進(jìn)行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)膜于PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h。依次用1∶1 000的鼠抗p62、抗LC3-Ⅱ和GAPDH抗體，孵育2 h后TBST洗滌，然后使用1∶5 000山羊抗鼠二抗孵育2 h，TBST洗膜。最后用ECL發(fā)光液進(jìn)行曝光顯影，Bio-Rad照相系統(tǒng)拍照，并用Image J軟件分析蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)量資料的正態(tài)性檢驗(yàn)采用Shapiro-Wilk法。2組間的比較采用t檢驗(yàn)，多組間的比較采用方差分析，用LSD法進(jìn)行兩兩組間的比較。采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色

Sham組心肌細(xì)胞排列整齊，胞膜完整，胞質(zhì)染色均勻；I/R組和I/R+TMZ組即刻取材標(biāo)本大部分心肌纖維腫脹，少量炎癥細(xì)胞局灶浸潤(rùn)；I/R組第4、8周取材標(biāo)本心肌細(xì)胞破壞最為嚴(yán)重，有明顯的梗死灶，胞質(zhì)腫脹，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，心肌細(xì)胞斷裂、壞死；I/R+TMZ組第4周取材標(biāo)本心肌細(xì)胞排列不齊，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)少量膠原纖維增生；I/R+TMZ組第8周取材標(biāo)本細(xì)胞排列較整齊，部分心肌纖維波紋樣改變。見(jiàn)圖1。

2.2 各組自噬相關(guān)基因LC3-Ⅱ和p62mRNA水平的比較

Sham組即刻、第4周和第8周，LC3-Ⅱ和p62 mRNA表達(dá)水平無(wú)差異（P＞0.05）；I/R組第4周LC3-Ⅱ和p62mRNA高于即刻，第8周低于第4周（均P＜0.05）；I/R+TMZ組第4周的LC3-Ⅱ和p62 mRNA高于即刻，第8周低于第4周（均P＜0.05），見(jiàn)表1。

I/R組各時(shí)相的LC3-Ⅱ和p62mRNA較Sham組表達(dá)增加（P＜0.05），具有時(shí)間效應(yīng)；I/R+TMZ組各時(shí)相的LC3-Ⅱ和p62 mRNA表達(dá)水平較I/R組下調(diào)（P＜0.05），亦呈時(shí)間效應(yīng)，且與Sham組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

圖1 各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)染色HE×100Fig.1 Morphologica l staining o f m yocardia l tissue in each group of rats HE staining×100

表1 實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ和p62在大鼠心肌中的表達(dá)Tab.1 Exp ression of autophagy associated proteins LC3-Ⅱand p62 in rat m yocardium by rea l-tim e PCR

2.3 各組LC3-Ⅱ和p62蛋白水平比較

圖2 各組心肌LC3-Ⅱ和p62蛋白電泳Fig.2 Electrophoresis of LC3-Ⅱand p62 proteins in each group

各組自噬相關(guān)蛋白質(zhì)LC3-Ⅱ和p62電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。組內(nèi)和組間比較的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果與其mRNA相似，見(jiàn)表2。I/R組LC3-Ⅱ和p62蛋白表達(dá)水平（P＜ 0.05）增加，且具有時(shí)間效應(yīng)；與I/R組比較，I/R+ TMZ組LC3-Ⅱ和p62蛋白表達(dá)水平（P＜0.05）下調(diào)，且呈時(shí)間依賴性；與Sham組比較，I/R+TMZ組LC3-Ⅱ和p62蛋白表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討論

大鼠MIRI模型是目前關(guān)于心肌MIRI實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用最多的模型［6］。TMZ已被證明可以導(dǎo)致骨骼肌肌管［7］自噬，抑制壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌纖維化［8］，減少吸煙誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［9］。本研究HE染色結(jié)果顯示，I/R+TMZ組心肌細(xì)胞排列明顯優(yōu)于缺血再灌注組；實(shí)時(shí)定量PCR和Western blotting結(jié)果也提示了I/R+TMZ組的自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)水平均明顯低于I/R組，表明TMZ可能通過(guò)抑制心肌細(xì)胞自噬而降低心肌缺血再灌注而帶來(lái)的損傷。

過(guò)去的研究認(rèn)為，心肌細(xì)胞丟失的主要機(jī)制是心肌細(xì)胞的凋亡和壞死，近些年來(lái)發(fā)現(xiàn)，另一種新型的細(xì)胞死亡的方式—自噬，也參與了這個(gè)過(guò)程。自噬是一個(gè)雙膜囊泡（自噬體）結(jié)構(gòu)，通過(guò)與溶酶體膜結(jié)合，被溶酶體中含有的酶水解［10］，清除功能障礙的細(xì)胞成分［11］稱為自噬溶酶體。大量的自噬體會(huì)導(dǎo)致與自噬體結(jié)合的溶酶體數(shù)量不足，進(jìn)而自噬體不能被完全降解，導(dǎo)致自噬流被破壞不能完整的進(jìn)行下去，同樣對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷［12］。有研究［13］表明，活體豬在體心肌冬眠模型中缺血區(qū)域梗死的心肌組織內(nèi)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)全部增多。目前認(rèn)為，“自噬流”影響并決定了自噬的水平，反映了從自噬體的合成、將底物運(yùn)輸至溶酶體以及降解過(guò)程，因此能更可靠地反映自噬活性［6］。LC3-Ⅱ是形成自噬體的重要因素，LC3從LC3-Ⅰ到LC3-Ⅱ結(jié)合在自噬體膜上，直至在溶酶體中降解［11］。所以，自噬的活性和LC3-Ⅱ的表達(dá)水平相關(guān)。泛素結(jié)合蛋白p62募集泛素化蛋白通過(guò)LC3結(jié)合到自噬體，并通過(guò)自噬降解。所以p62的表達(dá)水平和自噬水平呈負(fù)相關(guān)［14］。

表2 Western blotting法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ和p62在大鼠心肌中的表達(dá)Tab.2 Exp ression of autophagy associated proteins LC3-Ⅱand p62 in rat m yocardium by Western b lotting

本研究結(jié)果表明，大鼠MIRI后，LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平上調(diào)，說(shuō)明心肌細(xì)胞內(nèi)的自噬體被激活；而p62蛋白表達(dá)水平上調(diào)，說(shuō)明心肌細(xì)胞自噬流不完整，由此推測(cè)，MIRI破壞了細(xì)胞內(nèi)的自噬流，使自噬體大量積聚，導(dǎo)致細(xì)胞自噬性死亡。同時(shí)還表明，心肌細(xì)胞在不用藥物的情況下，機(jī)體自身可以部分降低MIRI后LC3-Ⅱ和p62的表達(dá)水平，而應(yīng)用TMZ后可以明顯降低LC3-Ⅱ和p62的表達(dá)，所以猜測(cè)TMZ的治療加速修復(fù)了損傷后自噬流的破壞，最終加速了自噬的降解。同時(shí)也表明，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，修復(fù)自噬流的效果越明顯，即第4周取材與即刻取材相比，LC3-Ⅱ和p62的表達(dá)水平增高，說(shuō)明效果不明顯，而第8周取材與第4周取材相比，LC3-Ⅱ和p62的表達(dá)水平降低，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，修復(fù)自噬流的效果越明顯。綜上所述，TMZ處理可以減輕大鼠MIRI損傷，其機(jī)制可能與修復(fù)了自噬流有關(guān)。

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（編輯于溪）

Protective Effect of Trimetazidine against Autophagy-induced M yocardial Ischem ia-reperfusion Injury in Rats

LONG Yuying1，GE Hua2，WANG Yue1，WANG Wei2

（1.Department of Pathology and Pathophysiology，Basic Medical College，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；2.Department of Circulation Section，The Affiliated Central Hospital，Basic Medical College，Shenyang 110075，China）

Objective To observe the protective effects of trimetazidine against myocardial ischemia-reperfusion（I/R）injury in rats and relationship with the autophagy-related protein，microtubule-associated protein light chain 3 protein-Ⅱ（LC3-Ⅱ）and another autoclaved marker sequestosome 1（p62）as well as to investigate the mechanism of action.Methods Fifty-four male SD rats were randomly divided into three groups with 18 rats in each group:sham group，myocardial I/R group，and TMZ plus myocardial I/R group.The rats in each group were sacrificed at model completion，and 4 and 8 weeks later.RT-PCR and Western blotting were performed to determine the levels of LC3-Ⅱand p62.The morphological changes in the myocardium were observed by HE staining.Results Compared with the sham group，the I/R group demonstrated increased expression of LC3-Ⅱand p62（P＜0.05）.Compared with that in the I/R group，the expression of LC3-Ⅱand p62 in the I/R+TMZ group decreased（P＜0.05）.The expression of LC3-Ⅱand p62 increased at week 4（P＜0.05）.At week 8，the expression levels of LC3-Ⅱand p62 decreased in cardiomyocytes（P＜0.05）.Conclusion Intervention with trimetazidine may protect the myocardium of rats against ischemia-reperfusion injury by regulating autophagy and the effect is maintained for a certain period.

trimetazidine；myocardial ischemia-reperfusion injury；autophagy；LC3-Ⅱ；P62

R541.4；R972.4

A

0258-4646（2017）07-0656-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.07.019

龍玉瑩（1988-），女，碩士研究生.

葛華，E-mail：gehua2009@163.com

2016-11-03

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