孫冶，肖純凌，海曉歐，李舒音，張迎今，李新鳴

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，沈陽110034；2.遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽110034）

糞腸球菌和釀酒酵母混合益生菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

孫冶1，2，肖純凌2，海曉歐1，李舒音1，張迎今1，李新鳴1，2

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，沈陽110034；2.遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽110034）

目的研究糞腸球菌與釀酒酵母混合培養(yǎng)發(fā)酵條件的優(yōu)化。方法對(duì)糞腸球菌與釀酒酵母混合培養(yǎng)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，分析培養(yǎng)液初始pH、接種量及通氣量對(duì)混合菌生長的影響。結(jié)果混合菌培養(yǎng)液最佳初始pH 7.0，在600 mL中試發(fā)酵罐（裝液量40%）發(fā)酵溫度30℃、通氣量0.2 L/min、糞腸球菌和釀酒酵母接種量分別為2.0%和5.0%，發(fā)酵20 h，發(fā)酵結(jié)束時(shí)糞腸球菌和釀酒酵母總菌數(shù)約為3.8×108CFU/mL和2.4×108CFU/mL。通氣量對(duì)于糞鏈球菌菌量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而對(duì)于釀酒酵母菌量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)論優(yōu)化發(fā)酵條件可獲得較高水平的混合益生菌菌量，優(yōu)化后糞腸球菌和釀酒酵母菌量分別提高了32.2%和31.5%，可為混合益生菌制劑大規(guī)模生產(chǎn)提供參考。

益生菌；糞腸球菌；釀酒酵母；發(fā)酵培養(yǎng)

益生菌制劑是一類能夠調(diào)節(jié)機(jī)體腸道菌群平衡、抑制病原菌生長、促進(jìn)機(jī)體健康的活菌制劑［1］?？股貫E用導(dǎo)致出現(xiàn)腸道正常菌群失調(diào)、機(jī)體免疫力下降、耐藥性、藥物殘留以及二重污染等問題，益生菌制劑作為一種新型、高效、安全的微生物制劑逐漸受到重視［2］。糞腸球菌和釀酒酵母作為益生菌，1984年就被美國食品和藥品管理局確定為可作為微生物添加制劑應(yīng)用于動(dòng)物的益生菌［3］。糞腸球菌和釀酒酵母混合培養(yǎng)，菌株之間發(fā)揮協(xié)同作用，不但可以獲得較高的菌數(shù)量和菌體蛋白，還能夠發(fā)揮比單一益生菌制劑更好的作用［4-5］。目前，對(duì)于單一益生菌制劑的培養(yǎng)發(fā)酵研究報(bào)道較多且多數(shù)的研究處于實(shí)驗(yàn)室水平，對(duì)于2株及以上益生菌復(fù)合制劑的培養(yǎng)發(fā)酵及中試發(fā)酵水平優(yōu)化的報(bào)道較少［6-7］，本研究旨在通過優(yōu)化培養(yǎng)發(fā)酵條件，使兩者混合培養(yǎng)而且菌數(shù)量水平不下降，節(jié)約發(fā)酵能源和發(fā)酵時(shí)間，為大規(guī)模生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑：釀酒酵母CICC 1001、糞腸球菌CICC 20419；胰蛋白胨、酵母浸粉（北京奧博星生物技術(shù)有限公司）；葡萄糖、氯化鈉、氫氧化鈉、瓊脂粉（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，均為分析純）。

1.1.2 儀器與設(shè)備：電子分析天平BS223S（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；HZQ-R恒溫振蕩器（東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；DL-CJ-2F潔凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)儀器制造有限公司）；BLBIO-HYG-F2流加生物反應(yīng)器搖床（上海百侖生物科技有限公司）；DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基：（1）LB培養(yǎng)基，酵母粉5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉10 g、pH7.0～7.2，蒸餾水1 000 mL，1×105Pa滅菌20 min。（2）YPD培養(yǎng)基，蛋白胨28 g、葡萄糖12 g、酵母粉10 g、pH7.0，蒸餾水1 000 mL，1×105Pa滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 釀酒酵母和糞腸球菌一級(jí)種子液制備［8］：（1）糞腸球菌，挑取糞腸球菌單菌落于裝有LB培養(yǎng)基（10 mL）的50 mL三角瓶，30℃170 r/min過夜培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。（2）釀酒酵母菌，挑取釀酒酵母菌單菌落于裝有YPD培養(yǎng)基（10 mL）的50 mL三角瓶，30℃170 r/min過夜培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。

1.2.2 釀酒酵母和糞腸球菌二級(jí)種子液的制備：（1）糞腸球菌，將糞腸球菌一級(jí)種子液按接種量1%接種于LB二級(jí)液體培養(yǎng)基，30℃170 r/min過夜培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。（2）釀酒酵母菌，將釀酒酵母一級(jí)種子液按接種量2.5%接種于YPD二級(jí)液體培養(yǎng)基，30℃170 r/min過夜培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。

1.2.3 混合菌培養(yǎng)基初始pH的優(yōu)化：將糞腸球菌和釀酒酵母二級(jí)種子液接種量分別按照1%和2.5%，接種于裝有YPD培養(yǎng)基（100 mL）的500 mL三角瓶中，30℃170 r/min培養(yǎng)24 h，用血球計(jì)數(shù)板分別計(jì)數(shù)糞腸球菌和釀酒酵母菌量。

1.2.4 混合菌在600 mL中試發(fā)酵罐接種量的確定［8-10］：將糞腸球菌和釀酒酵母二級(jí)種子液接種量分別按1%和2.%、2%和5%、4%和10%添加到240 mL的YPD發(fā)酵培養(yǎng)中（裝液量體積為罐體體積的40%），30℃、100 r/min振蕩轉(zhuǎn)速下，通氣量0.15 L/min（通氣比為1∶1.6）培養(yǎng)24 h，每隔4 h，計(jì)數(shù)混合菌菌量和發(fā)酵液pH。

1.2.5 混合菌在600 mL中試發(fā)酵罐通氣量的確定［11］：在最佳接種量條件下，將釀酒酵母和糞腸球菌二級(jí)種子液添加到240 mL的YPD發(fā)酵培養(yǎng)中（裝液量體積為罐體體積的40%），分別在通氣量為0.1、0.2、0.4 L/min，30℃、100 r/min振蕩轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)24 h，每隔4 h，計(jì)數(shù)混合菌菌量和發(fā)酵液pH。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果測(cè)定重復(fù)3次及以上，數(shù)據(jù)采用x±s表示，采用單因素方差分析以及兩兩比較方法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 混合菌培養(yǎng)基初始pH的確定

當(dāng)培養(yǎng)基初始pH≤4.0時(shí)，糞腸球菌不能生長，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH≥9.0時(shí)，釀酒酵母不能生長；當(dāng)培養(yǎng)基在pH值6.0～8.0范圍內(nèi)的混合培養(yǎng)基培養(yǎng)效果較好，當(dāng)混合菌培養(yǎng)基初始pH7.0時(shí)，混合菌培養(yǎng)效果達(dá)到最好。糞腸球菌菌數(shù)和釀酒酵母菌量約為2.875×108CFU/mL和1.825×108CFU/mL。見圖1。

圖1 混合菌在不同初始pH液體培養(yǎng)的菌量

2.2 混合菌在600 mL發(fā)酵罐培養(yǎng)初始接種量的確定

混合菌糞腸球菌和釀酒酵母分別在不同接種量（1%和2.5%、2%和5%、4%和10%）條件下進(jìn)行混合培養(yǎng)：當(dāng)培養(yǎng)結(jié)束時(shí)不同接種量條件下混合菌各自菌量均能達(dá)到相同值；混合菌發(fā)酵液pH隨時(shí)間變化趨勢(shì)也大致相同，均呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì)，發(fā)酵液pH在5.5～7.0之間。但是，隨著混合菌接種量的增加，混合菌培養(yǎng)周期也隨之縮短。當(dāng)糞腸球菌和釀酒酵母接種量為2.0%和5.0%時(shí)，釀酒酵母和糞腸球菌分別進(jìn)入到穩(wěn)定期所需的時(shí)間為20 h和16 h，繼續(xù)增加混合菌接種量菌量和培養(yǎng)周期沒有變化，培養(yǎng)到20 h糞腸球菌和釀酒酵母各菌量約為3.766×108CFU/mL和2.310×108CFU/mL。見圖2。

2.3 混合菌在600 mL發(fā)酵罐培養(yǎng)通氣量的確定

圖2 混合菌在不同接種量條件下菌量變化Fig.2 Changes in counts of the m ixed bacteria for different inoculum sizes

隨著通氣量的增加，糞腸球菌菌量比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），不同的通氣量對(duì)于糞腸球菌菌量沒有明顯改變；然而，釀酒酵母菌量比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），通氣量增加釀酒酵母菌量也明顯增加。通氣量為0.1 L/min時(shí)，分別與通氣量為0.2 L/min和0.4 L/min時(shí)的釀酒酵母菌量比較，其菌量差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；但通氣量0.2 L/min和0.4 L/min時(shí)，釀酒酵母菌量比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.204），通氣量繼續(xù)增加，釀酒酵母的菌量沒有明顯改變。通氣量增加會(huì)使發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量氣泡，導(dǎo)致管路堵塞，影響發(fā)酵效果，所以選擇通氣量0.2 L/min適宜。見表1。

3 討論

隨著對(duì)益生菌研究的廣泛開展，有證據(jù)［12-13］表明益生菌菌群在調(diào)制腸道代謝活動(dòng)，影響腸道炎癥、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、調(diào)節(jié)癌癥發(fā)生危險(xiǎn)因素、認(rèn)知退化、血管炎癥及動(dòng)脈粥樣硬化上均有顯著的作用。HASSAN等［14］研究發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌可以引起乳腺癌細(xì)胞MCF-7發(fā)生形態(tài)學(xué)特征的凋亡（細(xì)胞死亡、細(xì)胞收縮和觀察膜起泡），糞腸球菌有效誘導(dǎo)約34.60%的乳腺癌細(xì)胞MCF-7發(fā)生細(xì)胞凋亡且不影響正常細(xì)胞。研究［15］發(fā)現(xiàn)，酵母及其代謝產(chǎn)物（葉酸和β-葡聚糖）具有改善腸道菌群屏障、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)應(yīng)答、防毒及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等功能，從而提高機(jī)體抗腫瘤作用。復(fù)合益生菌制劑與單一益生菌制劑相比，對(duì)于機(jī)體調(diào)節(jié)腸道代謝活動(dòng)、免疫系統(tǒng)及癌癥發(fā)生危險(xiǎn)因素具有更大作用。

表1 不同通氣量與混合菌菌量比較（×108CFU/m L）Tab.1 M ixed bacterial counts for different ventilation rates（×108CFU/m L）

目前，雖然益生菌研究越來越多，但是真正應(yīng)用到臨床實(shí)踐中的益生菌制劑屈指可數(shù)，最主要問題是如何實(shí)現(xiàn)從實(shí)驗(yàn)室水平研究擴(kuò)大到中型以及大型發(fā)酵生產(chǎn)中。微生物從搖瓶培養(yǎng)擴(kuò)大到發(fā)酵罐培養(yǎng)，其培養(yǎng)效果受到嚴(yán)重影響，歸結(jié)原因主要是：（1）初始接種量的影響，微生物從搖瓶培養(yǎng)過度到發(fā)酵罐培養(yǎng)，通常要成倍數(shù)擴(kuò)大微生物的初始接種量，以便能夠提供較高的微生物初始菌密度來減少“延滯期”所用的時(shí)間，促進(jìn)微生物菌體快速進(jìn)入到對(duì)數(shù)生長時(shí)期，縮短發(fā)酵周期；（2）培養(yǎng)體系中溶氧和氧傳遞系數(shù)的影響，微生物菌體在發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中，由于發(fā)酵罐內(nèi)置攪拌漿和通氣裝置，較搖瓶培養(yǎng)時(shí)微生物菌體能夠獲得較高溶氧量和氧傳遞系數(shù)，這對(duì)于微生物生長代謝起到了非常顯著的影響，所以根據(jù)微生物代謝類型以及好氧類型來控制攪拌和通氣量［16］。本研究通過600 mL小型發(fā)酵罐優(yōu)化糞腸球菌和釀酒酵母發(fā)酵培養(yǎng)條件，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH 7.0，糞腸球菌和釀酒酵母接種量為2.0%和5.0%，裝液體積分?jǐn)?shù)40%，通氣量0.2 L/min，培養(yǎng)20 h時(shí)，終產(chǎn)物混合菌糞腸球菌和釀酒酵母菌量分別為3.8×108CFU/mL和2.4×108CFU/mL，并且最終獲得的混合菌菌量和以往研究報(bào)道中單獨(dú)培養(yǎng)獲得的菌量相當(dāng)［17-18］。本研究方法不但可以解決糞腸球菌作為兼性厭氧菌難以培養(yǎng)的困難，同時(shí)與釀酒酵母混合培養(yǎng)可以節(jié)約培養(yǎng)成本、節(jié)省培養(yǎng)周期及增強(qiáng)單株益生菌對(duì)人體有益的健康效應(yīng)，為糞腸球菌和釀酒酵母復(fù)合型益生菌制劑大規(guī)模的生產(chǎn)和臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)，未來對(duì)于糞腸球菌和釀酒酵母混合培養(yǎng)工廠化生產(chǎn)和有效活性物質(zhì)的分析還需進(jìn)一步研究和探索。

綜上所述，本研究探討中試培養(yǎng)條件對(duì)糞腸球菌和釀酒酵母菌量的影響，確定了有利于混合菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基初始pH、接種量及通氣量。發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下釀酒酵母在培養(yǎng)過程中耗氧導(dǎo)致培養(yǎng)基中氧濃度下降有利于兼性厭氧菌糞腸球菌的生長，同時(shí)釀酒酵母菌量不受糞腸球菌混合培養(yǎng)的影響，適當(dāng)增加通氣量還可以顯著提高釀酒酵母的菌量。

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（編輯武玉欣）

Optim ization of Fermentation Conditions for Enterococcus faecalis and Saccharomyces cerevisiae M ixed Probiotic Formulation

SUN Ye1，2，XIAO Chunling2，HAI Xiaoou1，LI Shuyin1，ZHANG Yingjin1，LI Xinming1，2

（1.Department of Pathogenic Biology，Institute of Basic Medicine，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；2.Liaoning Province Key Lab of Environment Pollution and Microecology，Shenyang 110034，China）

Objective To optimize the fermentation conditions for Enterococcus faecalis（E.faecalis）and Saccharomyces cerevisiae（S.cerevisiae）mixed culture.Methods The optimum fermentation conditions for E.faecalis and S.cerevisiae mixed culture were identified by investigating the influence of initial pH，inoculum size，and ventilation rate of the culture broth on mixed microbial growth.Results The optimal initial pH of mixed microbial culture was 7.0 and the inoculation amounts of E.faecalis and S.cerevisiae were 4%and 10%respectively，when fermented in 600-mL pilot fermentor（liquid volume 40%）at 30℃，with ventilation rate of 0.2 L/min，for 20 h.At the end of the fermentation，the E.faecalis and S.cerevisiae counts were approximately 3.8×108CFU/mL and 2.4×108CFU/mL，respectively.Ventilation for the amount difference of E.faecalis was no significant（P＞0.05），and for the amount difference of S.cerevisiae was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion The E.faecalis and S.cerevisiae counts increased by 32.2%and 31.5%respectively，when the optimized conditions of fermentation culture were used.In this study，high mixed microbial counts were obtained，thus providing a reference for the preparation of large-scale production of mixed microbes.

probiotic；Enterococcus faecalis；Saccharomyces cerevisiae；fermentation probiotic

Q93

B

0258-4646（2017）07-0645-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.07.016

沈陽市科技局科技項(xiàng)目（F15-199-1-29）；沈陽市科技局2014年市公益類科技項(xiàng)目

孫冶（1987-），男，助理實(shí)驗(yàn)員，碩士.

李新鳴，E-mail：2290354181@qq.com

2017-01-13

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：