張欣 陶周善 徐祝軍 謝加兵

皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，安徽 蕪湖 241001

骨組織盡管擁有較好的自身修復(fù)能力，但是較大的骨缺損很難通過骨組織自身的能力完成修復(fù)，目前這類骨缺損的修復(fù)是臨床的難點及研究的熱點之一[1]。自體移植物在骨缺損修復(fù)中有許多優(yōu)點，盡管是骨缺損修復(fù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是需要額外的手術(shù)時間，供體部位的并發(fā)癥和有限的骨組織限制其優(yōu)勢[2-4]。同時，同種異體的移植可能會增加感染的風(fēng)險。近年來，隨著組織工程的進(jìn)一步發(fā)展，人工材料修復(fù)骨缺損成為一種可供選擇的新思路。在大量不斷出現(xiàn)的各類新的組織工程支架中，聚乳酸-共-乙醇酸(poly lactic-co-glycolic acid，PLGA)是一個美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)的具有良好生物降解性和生物相容性的骨材料[5]，可以通過正常人體代謝途徑降解，對細(xì)胞和組織是安全的[6]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是多能細(xì)胞，它可以被誘導(dǎo)分化成成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等[7]，它與生物支架復(fù)合已被證明可以明顯改善支架的整體骨傳導(dǎo)功能[8-9]。此外，骨和軟骨的生長、發(fā)育和再生依賴于骨膜，其中骨膜的成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，可通過膜內(nèi)成骨的方式促進(jìn)體內(nèi)新骨形成[10]。鑒于此，筆者假設(shè)MSC、骨膜及PLGA有較好的成骨能力，聯(lián)合使用可以充分發(fā)揮種子細(xì)胞、組織支架及骨膜各自的優(yōu)勢，因此，筆者研究MSCs/PLGA /骨膜對激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松兔尺骨骨缺損修復(fù)的能力。

1 材料和方法

1.1 PLGA支架的制備

使用致孔劑浸出法制作多孔PLGA支架(丙交酯乙交酯的摩爾比50∶50，分子量75000)[11]，使用明膠微粒作為致孔劑。將同樣份量的PLGA和明膠加入錐形瓶，混合均勻，在攪拌狀態(tài)下經(jīng)過水蒸汽處理攪拌均勻后，立即置于液氮中冷凍。完全凝固后，轉(zhuǎn)至-20 ℃的真空干燥器中，真空泵抽干、泡糖、干燥，裁成5 mm直徑、厚1 mm、重3 mg的圓形支架，消毒保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 從兔骨髓提取MSC和培養(yǎng)

從兔骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞，它的分離和培養(yǎng)的方法是按照以前文獻(xiàn)報道的[12]。簡言之，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來自抽吸的骨髓，給予梯度離心分離，并接種到含有低葡萄糖DMEM(Gibco)的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基中含有10%的胎牛血清(Gibco)和1%的抗生素(100 U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素)。培養(yǎng)48 h后，除去培養(yǎng)基，更換新鮮培養(yǎng)基。細(xì)胞保持在37 ℃下在含有5%CO2的濕度適宜的培養(yǎng)箱中，每兩天更換一次培養(yǎng)基。當(dāng)生長達(dá)到80%～90%匯合時，貼壁細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四乙酸；Gibco)從培養(yǎng)瓶壁上分離下來，并再按1∶3的比例接種在前述的生長培養(yǎng)基中，以允許其繼續(xù)生長。第3代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用于實驗，同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用于在體內(nèi)植入動物實驗。

1.3 細(xì)胞接種

PLGA支架通過浸漬到70%的乙醇中進(jìn)行滅菌，然后用磷酸鹽緩沖鹽水漂洗幾次。MSC懸浮液的密度為1×107cells/cm3，通過滴加體外培養(yǎng)擴增的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸液50 μL接種到3D雙層支架PLGA上。然后在細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37 ℃下5%的CO2的濕潤空氣中)培養(yǎng)2 h，以便使細(xì)胞附著在支架材料上。復(fù)合支架放置在含有2 mL的新鮮培養(yǎng)基的35 mm的培養(yǎng)皿中，并靜置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜，以備用于動物實驗用。

1.4 動物及手術(shù)過程

20只健康的雄性體重2.5～3.0 kg新西蘭白兔隨機分成4組：PLGA組、PLGA/骨膜組、MSCs/PLGA組和MSCs/PLGA/骨膜組，用于制作雙側(cè)尺骨缺損模型。通過靜脈注射3%的戊巴比妥鈉(30 mg/kg)對實驗動物進(jìn)行麻醉，麻醉完成后，常規(guī)消毒鋪巾，在雙側(cè)尺骨遠(yuǎn)端后外側(cè)作3 cm縱行切口。鈍性分離肌肉及其他的軟組織并暴露骨組織。尺骨缺損的長度為1.5 cm，使用高速鋸下用生理鹽水沖洗的截骨方法，從截下的尺骨上完整剝離骨膜。隨后PLGA組、PLGA/骨膜組、MSCs/PLGA組和MSCs/PLGA/骨膜組分別在缺損區(qū)植入PLGA、PLGA/骨膜、MSCs/PLGA及MSCs/PLGA /骨膜。手術(shù)完成后認(rèn)真止血，逐層縫合肌肉皮膚組織。在術(shù)中、術(shù)后第一天，對每只兔子給予40萬U青霉素肌注，以防止感染，同時所有兔子肌肉注射地塞米松，3 mg/kg，每周2次，連續(xù)12 w。在6 w和12 w兩個時間段，各取一半標(biāo)本，手術(shù)組(n=5)并用10%的多聚甲醛固定標(biāo)本。

1.5 大體觀察

觀察動物術(shù)后的活動、食物攝入量和傷口愈合情況。處死動物后，通過對標(biāo)本的觀察，查看骨修復(fù)和骨痂組織的生長狀態(tài)。

1.6 影像學(xué)檢查

對術(shù)后6 w和12 w兩個時間點的兔子前肢標(biāo)本進(jìn)行串行X線透視檢測。X光片的結(jié)果由3位熟悉骨形成，聯(lián)合和重塑評價技術(shù)的實驗人員進(jìn)行單盲評估，使用骨移植評分系統(tǒng)進(jìn)行評估[2]。來確定在術(shù)后6 w和12 w的治療效果，同時使用微觀視角2.2軟件(GE Healthcare)對數(shù)字化的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對新形成的骨量體積和缺損的總體積均進(jìn)行評價。

1.7 組織學(xué)觀察和組織形態(tài)學(xué)分析

影像學(xué)研究結(jié)束后，所有標(biāo)本用10%的中性緩沖福爾馬林溶液固定72 h，EDTA溶液脫鈣，期間用大頭針輕戳標(biāo)本，至針頭可輕松刺入標(biāo)本中提示脫鈣完成，脫鈣時間約4 w，脫鈣完成后經(jīng)過脫水、石蠟包埋，包埋完成后以4 μm厚度連續(xù)切片，所得切片行蘇木素-伊紅染色(HE染色)，觀察各組材料與缺損修復(fù)情況，使用圖像分析軟件Image-Pro Plus進(jìn)行圖像分析，缺損的修復(fù)程度通過計算每個植入物內(nèi)骨組織面積的百分比來表示。

1.8 統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組資料采用One-way ANOVA方差分析進(jìn)行檢驗，如果差異有統(tǒng)計學(xué)意義，若方差齊用LSD檢驗、方差不齊用Dunnett T3檢驗作兩兩比較。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

整個實驗過程中，所有實驗兔子飲食和行為正常，都存活了下來，并且沒有明顯的并發(fā)癥，如切口感染或皮膚壞死等。術(shù)后6 w時，各組缺損區(qū)可見部分骨組織形成，其中以MSCs /PLGA/骨膜組缺損修復(fù)最佳；術(shù)后12 w時，各組缺損進(jìn)一步被修復(fù)，其中PLGA組仍然可見大部分缺損存在，而其他組修復(fù)效果明顯優(yōu)于PLGA組。研究發(fā)現(xiàn)MSCs/PLGA/骨膜組大部分缺損已經(jīng)被修復(fù)，具體修復(fù)情況如圖1所示。

圖1 大體觀察術(shù)后6 w(A～D)和12 w(E～H)的兔尺骨缺損。A、E：PLGA組；B、F：PLGA /MSCs組；C、G：PLGA/骨膜組；D、H：PLGA /MSCs/骨膜組Fig.1 Gross observation of rabbit ulnar defects at 6 w (A—D) and 12 w (E—H) after surgery. A, E: PLGA group; B, F: PLGA/MSCs group; C, G: PLGA/periosteum group; D, H: PLGA/MSCs/periosteum group

2.2 影像學(xué)分析

術(shù)后6 w，PLGA組在靠近橈骨的缺損部位只有少量的骨組織形成(圖2A)，而PLGA/MSCs組和PLGA/骨膜組，在缺損兩端及橈側(cè)周圍可見骨組織形成(圖2B、2C)，PLGA/MSCs/骨膜組骨缺損周圍有大量的骨和骨樣組織形成(圖2D)。術(shù)后12 w時，PLGA組的缺損充滿了骨組織(圖2E)，而PLGA/MSCs組和PLGA/骨膜組(圖2F、2G)中有一半以上的缺損部位由骨組織填充；PLGA/MSCs/骨膜組(圖2H)中缺損幾乎全部由骨組織填充，并達(dá)到骨性愈合和骨重建。放射線評分結(jié)果分別見圖2I、2J。PLGA/MSCs/骨膜組在術(shù)后6 w和12 w評分均最高(P<0.05)。PLGA/MSCs組和PLGA/骨膜組的得分顯著高于PLGA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。PLGA /MSCs組和PLGA/骨膜組的X線評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但是均高于PLGA組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 在術(shù)后6 w(A～D)和12 w(E～H)的放射學(xué)分析和各組的Lane-Sand hu X射線評分(I：6 w，J：12 w)。A、E：PLGA組；B、F：PLGA/MSCs組；C、G：PLGA/骨膜組；D、H：PLGA /MSCs/骨膜組。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。#：與其他組相比，P<0.05；*：與 PLGA組相比，P<0.05Fig.2 Radiological analysis of postoperative 6 w (A to D) and 12 w (E to H) and Lane-Sand hu X ray score (I: 6w; J: 12w) in each group. A, E: PLGA group; B, F: PLGA/MSCs group; C, G: PLGA/periosteum group; D, H: PLGA/MSCs/ periosteum group. The results are expressed with mean±stand ard deviation. #P<0.05, compare to other groups; *P<0.05, compared to PLGA group

2.3 組織學(xué)分析

術(shù)后6 w時，PLGA組可以觀測到少量新骨形成，大部分的缺損都由纖維組織和殘留的支架填充(圖3A)，PLGA/MSCs組可見部分分散的編織骨形成(圖3B)，PLGA/骨膜組在近橈骨側(cè)可以看到豐富的編織骨形成，并出現(xiàn)骨髓腔(圖3C)，PLGA/MSCs/骨膜組的整個缺損中可以見到編織骨的量進(jìn)一步增加，且更致密，骨髓腔形成(圖3D)。術(shù)后12 w時，所有原尺骨兩端均由新再生的骨連接，原PLGA支架大部分已經(jīng)降低。PLGA組外部區(qū)域可見部分新生骨形成(圖3E)。PLGA/MSCs組和PLGA/骨膜組骨缺損的中心區(qū)可以觀測到皮質(zhì)骨形成，然而周圍仍是疏松的編織骨(圖3F、3G)填充；PLGA/MSCs/骨膜組缺損的兩端可以觀察到皮質(zhì)骨，而骨髓腔填充有豐富的編織骨(圖3H)。

圖3 術(shù)后6 w、12 w時骨缺損部位再生的修復(fù)骨組織的組織學(xué)檢測(b：骨組織；s：殘余支架材料；m：骨髓；箭頭：軟骨細(xì)胞，HE×20)Fig.3 Histological examination of the repaired bone tissue after bone defect regeneration at 6w and 12 w (B: bone tissue; S: residual scaffold material; M: bone marrow; yellow arrow: cartilage cell, HE×20)

2.4 組織形態(tài)計量學(xué)分析

圖4 在6 w和12 w后新形成的骨量用新生骨面積與原始骨缺損面積的百分比表示(柱狀圖表示平均值±SD)。#：與其他組相比，P<0.05；*：與PLGA組相比，P<0.05Fig.4 After 6 w and 12 w, the newly formed bone mass is expressed by the percentage of the new bone area and the area of the original bone defect area (histogram, mean±SD). #P<0.05, compare to other groups; *P<0.05, compared to PLGA group

術(shù)后6 w，在PLGA組中新骨形成的部分為(6.6±1.5)%，PLGA/MSCs組中為(9.4±1.1)%，PLGA/骨膜組中為(11.6±3.3)%，均顯著低于PLGA/MSCs/骨膜組(23.5±2.7)%(圖4A)(P<0.05)。術(shù)后12 w，PLGA/MSCs/骨膜組的新骨形成面積增加至(74.3±9.7)%，顯著高于PLGA組(24.7±3.1)%、PLGA/MSCs組(45.3±5.1)%和PLGA/骨膜組(51.1±4.6)%(圖4B)(P<0.05)。研究發(fā)現(xiàn)在PLGA/MSCs組和PLGA/骨膜組之間新形成骨量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而兩組均明顯優(yōu)于PLGA組(P<0.05)。

3 討論

本研究通過制作尺骨缺損，植入PLGA、PLGA/MSCs、PLGA/骨膜及PLGA /MSCs/骨膜，實驗結(jié)果通過大體、X線及HE評估，表明通過在缺損部位植入多孔PLGA 結(jié)合MSCs聯(lián)合包裹自體骨膜的方法，可以快速修復(fù)兔的尺骨節(jié)段性骨缺損。同時發(fā)現(xiàn)骨膜聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的再生效果優(yōu)于單純的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

MSCs是多能細(xì)胞，其分化成骨源性的成骨細(xì)胞的能力是眾所周知的。已有報告顯示MSCs有很強的誘導(dǎo)血管生成作用，它們通過旁分泌作用來吸引宿主來源的血管內(nèi)皮細(xì)胞聚集，同時誘導(dǎo)新血管的形成增強了成骨細(xì)胞的浸潤，進(jìn)而推動其隨后的礦化和骨形成[13-14]。因此，PLGA/MSCs組比PLGA組新生更多的骨體積和更好的骨質(zhì)量，這與先前的研究一致[14]。有趣的是，在PLGA/MSCs中骨缺損的中心由骨組織填充，而外部區(qū)域由纖維組織包裹。這種結(jié)果的原因可能是，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞主要附著在植入物的內(nèi)側(cè)，而移植物的外側(cè)主要缺乏骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和其他成骨誘導(dǎo)物，如骨膜。

骨膜由含有間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨層、含有成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的纖維血管中間層、和含膠原的外層組成，這些層可以促進(jìn)成骨和血管化。此外，這些層中包含一個膠原基質(zhì)層，這對骨移植的成功是至關(guān)重要的。以往的研究表明，帶血管蒂的骨膜瓣在合成支架材料上能夠誘導(dǎo)骨生長[15-16]。骨膜皮瓣也已表明，能夠促進(jìn)人類同種異體移植物和自體骨之間骨不連的修復(fù)[17]。此外，骨膜可用于刺激和提高在腱-骨界面的愈合[18]，也用于軟骨再生[19]。因此，在本研究中，PLGA/骨膜組的新生骨組織的量明顯大于PLGA組。另外，其外部的缺損區(qū)域由骨組織再生填充。MSCs可能是通過軟骨內(nèi)和膜內(nèi)成骨形成為廣大的愈合，并直接誘導(dǎo)血管生成，使移植物血管化[20]。因此，骨膜促進(jìn)新骨形成和再生的作用是通過提供間充質(zhì)干細(xì)胞的來源，和通過促進(jìn)血管的生長和再生。

在本研究中，MSCs和骨膜的組合顯著增加了骨形成和產(chǎn)生了較大體積的骨組織。在PLGA/MSCs/骨膜組大部分達(dá)到了骨性愈合和骨重建。在先前的研究中，結(jié)合脂肪干細(xì)胞、rhBMP-2和骨膜，連同結(jié)構(gòu)性硬骨移植物，產(chǎn)生了大量的有良好血供的新骨[21]。這樣的研究結(jié)果表明，為種植MSCs的合成材料準(zhǔn)備骨膜移植物的重要性。接種的細(xì)胞可以在體內(nèi)植入的早期階段存活，由于這樣的事實，膜狀的構(gòu)造將通過體液擴散的方式提供營養(yǎng)物質(zhì)以維持細(xì)胞的活力[22]。如果可用，骨膜將用作移植物或保存在植入部位，以提高移植物的血管化和成骨。PLGA組修復(fù)效果較差主要是由于缺乏成骨和移植物血管化較少。但是，獲取自體骨膜會造成供區(qū)并發(fā)癥，骨膜替代物為合成材料和同種異體移植物較差的血管化提供了可供選擇的解決途徑。同種異體移植物和合成材料可以作為骨膜替代物，從而有益于改善其血管化[23]。已有研究結(jié)果證明MSCs薄片都表達(dá)血管源性和成骨細(xì)胞的基因，增強了骨愈合[24]。

總之，本研究表明，植入復(fù)合有MSCs的PLGA和骨膜對節(jié)段性骨缺損的骨再生修復(fù)有協(xié)同效應(yīng)，并強調(diào)骨膜在此過程中發(fā)揮的關(guān)鍵作用。制作的骨膜替代物對骨組織工程的成功是非常重要的。使用骨膜包被PLGA/MSCs的復(fù)合材料可以明顯促進(jìn)兔尺骨骨缺損的修復(fù)，在骨組織工程中具有廣闊的應(yīng)用前景。