高夢穎 黃惠娟 謝樹紅

1. 南京軍區(qū)福州總醫(yī)院，福建 福州 350000 2. 廈門大學(xué)附屬東方醫(yī)院，福建 福州 350025

卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之首，其臨床病理種類繁多，惡性程度高，且具有起病隱匿、癌細胞擴散快速、手術(shù)及化療藥物療效不盡人意等特點，嚴重威脅著女性健康及生存質(zhì)量。據(jù)統(tǒng)計，每年全球約有20萬人患上卵巢癌，其中12.5萬人死于此病[1]。根據(jù)最新國際癌癥研究中心公布的“2015年全球癌癥數(shù)據(jù)庫”(GLOBOCAN 2015)[2]資料顯示，卵巢癌引起的死亡率占女性腫瘤的5%，死亡率居婦科惡性腫瘤首位。卵巢癌患者術(shù)后因體內(nèi)雌激素水平急劇下降，骨質(zhì)疏松及骨折等并發(fā)癥的發(fā)病率亦隨之增高。骨質(zhì)疏松癥是以骨量降低和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征，導(dǎo)致骨脆性增加和易于骨折的一種代謝性全身性病。立足于前期實驗結(jié)果，橄欖苦苷可通過提高大鼠的骨密度來防止骨量的流失，達到延緩或防治骨質(zhì)疏松的目的，此結(jié)果亦在防治絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松的臨床研究中得到證實[3-4]。但是橄欖苦苷是否與破骨細胞的增殖凋亡有關(guān)，目前國內(nèi)尚沒有相關(guān)的文獻報道。本研究采用 400 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、0 μg/mL的橄欖苦苷作為藥物刺激因子，觀察不同時間及不同濃度橄欖苦苷對體外誘導(dǎo)的破骨細胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑

小鼠單核細胞RAW264.7細胞株由福建中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細胞中心提供；小鼠重組可溶性核因子KB活因子受體配體(sRANKL，Peprotech公司)、小鼠巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF，Peprotech公司)、橄欖苦苷(購于 Funakoshi，Tokyo，Japan)；抗酒石酸酸性磷酸酶染色試劑盒(南京建成生物公司)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(南京建成生物公司)、Cell Counting Kit-8試劑盒(GENVIEW公司)；高糖 DMEM 培養(yǎng)基(HyClone公司)、10%胎牛血清(FBS)(美國Gibco公司)、磷酸鹽緩沖液(PBS，HyClone公司)；25 cm2培養(yǎng)瓶、15 mL、50 mL離心管(HyClone公司)。

1.2 方法

1.2.1蓋玻片處理：用玻璃刀把蓋玻片割成1 cm×1 cm大小，濃酸浸泡過夜，自來水沖洗10 min，蒸餾水沖洗3 min，然后浸泡于無水乙醇中2 h脫脂，用鑷子取出在超凈臺中晾干，用前高壓滅菌。

1.2.2破骨細胞誘導(dǎo)：將裝有RAW264.7細胞的凍存管從液氮罐中取出，迅速投入37 ℃水浴，800 r/min離心5 min，棄上清，以含有10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基重懸后，接種到24孔板中的預(yù)置無菌玻片上，細胞接種密度2×104個/cm2；12 h待細胞貼壁后，換為含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基(含50 ng/mL sRANKL和30 ng/mL M-CSF)，于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次。誘導(dǎo)6 d后倒置相差顯微鏡觀察細胞的形態(tài)特征。

1.2.3破骨細胞鑒定：抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色：避光配制TRAP孵育液，并于37 ℃水浴箱中加熱10 min。在玻片上培養(yǎng)6 d的破骨細胞經(jīng)PBS清洗后，加固定液于37 ℃恒溫箱中固定25 min，PBS沖洗2次，加入配制好的孵育液內(nèi)，將玻片放入37 ℃恒溫箱中避光孵育1 h，然后用蘇木素復(fù)染3 min，PBS沖洗1次，在倒置相差顯微鏡下觀察及拍片。

1.2.4CCK8法測定細胞增殖：將誘導(dǎo)成功的破骨細胞以1×104個/孔接種于96孔板，用含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h后，第2天吸去培養(yǎng)液后，加入含有不同濃度橄欖苦苷(400 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、0 μg/mL)的高糖DMEM培養(yǎng)液200 μL繼續(xù)分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，用CCK8法測定破骨細胞OD值。

1.2.5乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性測定：LDH作為一種酶，參與機體能量代謝的各個環(huán)節(jié)。通過檢測細胞內(nèi)環(huán)境和細胞外環(huán)境中LDH的含量，可以評價細胞膜完整性。將誘導(dǎo)成功的破骨細胞以1×104個/孔接種于96孔板，用含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，第2天吸去培養(yǎng)液后，加入含有不同濃度橄欖苦苷(400 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、0 μg/mL)的高糖DMEM培養(yǎng)液200 μL繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞培養(yǎng)上清液，根據(jù)LDH檢測試劑盒說明書進行LDH活性測定。

2 結(jié)果

2.1 破骨細胞的鑒定

經(jīng)50 ng/mL sRANKL和30 ng/mL M-CSF誘導(dǎo)6 d后，RAW264.7細胞被誘導(dǎo)成為圓形、橢圓形、水煎蛋型等多型態(tài)的多核細胞，倒置相差顯微鏡下可見細胞周圍有偽足。經(jīng)TRAP染色后，高倍鏡下觀察見細胞呈鮮紅色樣，有多個細胞核，細胞核不著色，可見核仁，胞漿內(nèi)富含深紅色酸性磷酸酶顆粒。見圖1。

圖1 TRAP染色結(jié)果，染色陽性且細胞核在3個以上者即為破骨細胞，圖中線條長度為100 μmFig.1 Result of TRAP staining. Cells with positive staining and 3 or more nucleus are osteoclasts. The bar length is 100 μm

2.2 橄欖苦苷對破骨細胞增殖的影響

2.2.124 h不同濃度橄欖苦苷對破骨細胞的影響：與空白對照組(Control，Con)比較，400 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL 橄欖苦苷對破骨細胞的增殖具有抑制作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，50 μg/mL橄欖苦苷對破骨細胞的增殖無明顯抑制作用，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，其中橄欖苦苷濃度為400 μg/mL時對破骨細胞的增殖抑制作用最強(具體數(shù)據(jù)及抑制趨勢圖見圖2)。

2.2.248 h不同濃度橄欖苦苷對破骨細胞的影響：與空白對照組比較，400 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL橄欖苦苷對破骨細胞的增殖均具有抑制作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中橄欖苦苷濃度為200 μg/mL時對破骨細胞的增殖抑制作用最強(具體數(shù)據(jù)及抑制趨勢圖見圖2)。

2.2.372 h不同濃度橄欖苦苷對破骨細胞的影響：與空白對照組比較，400 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL橄欖苦苷對破骨細胞的增殖具有抑制作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，50 μg/mL的橄欖苦苷對破骨細胞的增殖無明顯抑制作用，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，其中橄欖苦苷濃度為400 μg/mL時對破骨細胞的增殖抑制作用最強(具體數(shù)據(jù)及抑制趨勢圖見圖2)。

2.2.4不同時間點及不同濃度對破骨細胞增殖情況的整體影響：與空白對照組比較，在不同時間點中400 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL橄欖苦苷對破骨細胞的增殖均具有抑制作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；50 μg/mL的橄欖苦苷只在藥物作用48 h對破骨細胞的增殖具有抑制作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，藥物作用時間為24 h及72 h時，抑制增殖作用均不明顯，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。當藥物作用時間為24 h及72 h時，橄欖苦苷濃度為400 μg/mL時對破骨細胞的增殖抑制作用最強(P<0.05)；當藥物作用時間為48 h時，橄欖苦苷濃度為200 μg/mL時對破骨細胞的增殖抑制作用最強(P<0.05)；同一濃度中，隨著藥物作用時間的延長，橄欖苦苷對破骨細胞增殖的抑制作用也增強(P<0.05)(具體變化趨勢見圖2)。

圖2 不同濃度橄欖苦苷不同時間對破骨細胞增殖的影響Fig.2 Effect of oleuropein with different solubility and different time on the proliferation of osteoclasts

2.3 橄欖苦苷對破骨細胞膜完整性及活性的影響

與空白對照組比較，在加入400 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、0 μg/mL橄欖苦苷作用于破骨細胞48 h后，其釋放到細胞外環(huán)境中的LDH酶活性分別為空白組149.35%、50 μg/mL 153.38%、100 μg/mL 155.84%、200 μg/mL 192.14%、400 μg/mL 254.27%(P<0.05)，表明橄欖苦苷對破骨細胞的細胞膜有顯著的破壞作用(具體變化見圖3)。筆者考慮，橄欖苦苷可能通過破壞細胞的完整性，達到抑制破骨細胞增殖的效果，具體機制有待進一步研究。

圖3 不同濃度橄欖苦苷對破骨細胞細胞膜完整性的影響(不同濃度橄欖苦苷組與空白組比較，P<0.05)Fig.3 Effect of oleuropein with different solubility on membrane integrity of osteoclasts (compared with the blank group, P<0.05)

3 討論

橄欖苦苷(oleuropein)是一種無毒的裂環(huán)烯醚萜苷類化合物。新研究發(fā)現(xiàn)，橄欖苦苷能有效防治骨質(zhì)疏松癥，是藥食同源類中藥橄欖油的主要提取成分之一。卵巢癌患者術(shù)后因體內(nèi)雌激素水平急劇下降，對破骨細胞的產(chǎn)生、分化和激活的抑制作用減弱，導(dǎo)致破骨細胞大量增殖分化，其功能的活躍及凋亡的減少，使骨吸收速度超過骨形成速度。同時因雌激素的缺乏，其所介導(dǎo)的骨保護素表達減弱，骨量增加減少，抑制骨吸收及骨丟失的效用減弱[5]，造成骨質(zhì)有機物和無機物成比例地減少，使得骨質(zhì)疏松及骨折等并發(fā)癥的發(fā)病率顯著增高。此外，造成卵巢癌術(shù)后骨質(zhì)疏松的另一重要病因是炎癥因子[6]，如IL-1、IL-3、IL-6、IL-7、IL-11、IL-15的作用，同樣可引起骨吸收和重建的平衡失調(diào)。因卵巢癌是一種激素依賴型腫瘤，故術(shù)后的卵巢癌患者常規(guī)應(yīng)用植物雌激素或激素替代療法來防治骨質(zhì)疏松癥的安全性具有很大的爭議。研究表明，橄欖苦苷可以通過調(diào)節(jié)OPG/RANKL/RANK信號通路[7-9]、降低腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和IL-6的分泌[3,10]、調(diào)控 MAPKP38-COX-2信號通路[11-13]3種途徑來防治婦科惡性腫瘤術(shù)后骨質(zhì)疏松。

本研究觀察發(fā)現(xiàn)，濃度為50 μg/mL的橄欖苦苷在破骨細胞增殖過程中無明顯抑制作用，而濃度為100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL的橄欖苦苷對破骨細胞的增殖均具有明顯抑制效果，且抑制效果與橄欖苦苷的濃度呈劑量依賴性，說明橄欖苦苷要在一定濃度下才能發(fā)揮抑制破骨細胞增殖的效用，具體起始濃度、是否存在最大濃度，還有待進一步探究。在橄欖苦苷保持同一濃度的前提下，抑制增殖的效用與作用時間呈正相關(guān)，說明用藥時間越長，防治骨質(zhì)疏松的效果越好，為臨床卵巢癌患者術(shù)后延緩骨質(zhì)疏松用藥時間提供一定依據(jù)。

LDH是一種存在于細胞內(nèi)的酶。橄欖苦苷作用于破骨細胞48 h后，細胞膜的損傷導(dǎo)致細胞自身打開了缺口，儲存于細胞內(nèi)的LDH外流，使得細胞外的LDH活性顯著增強。因細胞膜完整性遭到破壞，使破骨細胞啟動細胞凋亡機制。根據(jù)研究結(jié)果，細胞外LDH活性的增強與作用于破骨細胞的橄欖苦苷濃度呈劑量依賴性，說明細胞外LDH活性的增強和細胞凋亡率是由于橄欖苦苷對破骨細胞細胞膜的毒性作用，具體機制還有待進一步研究。

綜上所述，橄欖苦苷能夠抑制破骨細胞增殖，從而降低破骨細胞的骨吸收活性，起到延緩或防治骨質(zhì)疏松的效果。