吳梅 張巍

1. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院兒科，北京 100026 2. 航空總醫(yī)院兒科，北京 100012

維生素D的產(chǎn)生與日光中紫外線照射關(guān)系密切，人體對維生素D需求量的90%以上來自紫外線照射皮膚合成的內(nèi)源性維生素D。雖然日光照射對人類意義重大，但紫外線過量照射可使皮膚產(chǎn)生紅斑、曬黑、光老化、光敏反應(yīng)、皮膚癌等負健康效應(yīng)。因此，合理的日光照射顯得尤為重要。本實驗通過構(gòu)建不同紫外線暴露條件下的大鼠模型，探討在紫外線總暴露劑量相同情況下，多次小劑量暴露與集中大劑量暴露對生長期大鼠血清25-(OH)D濃度的影響，同時評價不同暴露方式對皮膚產(chǎn)生的副作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及飼料

選用21 d齡的雄性Wistar大鼠(由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供)90只,體重27.8～55.6 g。大鼠飼以缺乏維生素D飼料，其配方主要成分為：玉米粉76%、麥麩20%、碳酸鈣3%、含碘鹽1%、賴氨酸0.5%以及各種B族維生素，經(jīng)檢測維生素D含量小于20 IU/kg，可忽略不計。各組大鼠自由取食，飲用去離子水。

1.2 儀器和試劑

上海希格瑪紫外線光療儀 (UVB)光源，波長310～313 nm，照射強度為10 mw/cm2。上海寶山顧村電光儀器廠生產(chǎn)ZQJ-254型紫外線強度檢測儀檢測不同暴露方式的紫外線照射強度。大鼠血清25-(OH)D 酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒由IDS L td公司提供。

1.3 動物飼養(yǎng)

90只大鼠隨機分為1MED組、1/3MED組、1/5MED組及白熾燈組4組，前3組每組27只，白熾燈組9只。各組均飼以缺乏維生素D飼料，各組大鼠均飼養(yǎng)于不銹鋼籠具，籠高20 cm。動物房24 h無日光射入，紫外線強度經(jīng)檢測為0μW/cm2。實驗期為15 d。

1.4 紫外線照射

照射前用電推子將90只大鼠背部部分皮毛剃去，面積大約為5×3 cm2。除白熾燈組外，其余3組直接置于SigmaSS-01型紫外線光療儀下，用于直接照射的籠具是專門定制的，長7 cm，寬7 cm，高3 cm，中間有遮擋，可以同時盛裝2只大鼠，大鼠距紫外線光療儀<1 cm，接受紫外線輻射強度為10 mw/cm2。前期研究表明大鼠的最小紅斑量為5.5 J/cm2。根據(jù)公式：紫外線輻射劑量(J/cm2)=輻射強度(w/cm2)×輻射時間(s)。1/5MED組大鼠連續(xù)照射15 d，每日照射劑量為1/5MED，照射時間為1 min 50 s；1/3MED組實驗期內(nèi)間斷照射9 d，每天照射劑量為1/3MED，照射時間為3 min3 s；1MED組實驗期內(nèi)間斷照射3 d，每天照射量為1MED，照射時間為9 min10 s；實驗期內(nèi)累計暴露劑量均為3MED。白熾燈組接受白熾燈照射，經(jīng)檢測白熾燈下紫外線輻射強度為0 mw/cm2，實驗期內(nèi)累計暴露劑量為0 J/cm2。

1.5 血清25-(OH)D檢測

實驗結(jié)束時用5%水合氯醛300 mg/kg腹腔麻醉大鼠后，眼球取血1 ml，以3 000 r/min離心10 min后分離血清，儲藏于-20℃至檢測。酶聯(lián)免疫吸附法檢測25-(OH)D濃度。

1.6 皮膚損傷的評價標(biāo)準及方法

參考皮膚刺激反應(yīng)評分將刺激反應(yīng)評分分度[1]。紅斑分度：皮膚未出現(xiàn)紅斑為0分，勉強可見為1分，中度紅斑為2分，嚴重紅斑為3分，紫紅色紅斑并有焦痂形成為4分。水腫分度：無水腫為0分，勉強可見為1分，皮膚隆起輪廓清楚為2分，水腫隆起約1 mm范圍擴大為4分。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)大鼠血清25-(OH)D濃度用均數(shù)±標(biāo)準差表示，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進行組間比較。皮膚損傷評分結(jié)果用均數(shù)M(P25，P75)表示，采用完全隨機化設(shè)計多組獨立樣本的秩和檢驗進行組間比較，P<0.05視為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清25-(OH)D濃度的比較

4組大鼠血清25-(OH)D濃度差異明顯，F(xiàn)=20.695，P<0.001。1/5MED組(151.97±73.52)nmol/L高于1/3MED組(136.21±71.39)nmol/L，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.966)；1/5MED、1/3MED組均顯著高于1MED組(54.50±20.52)nmol/L和避光組(15.63±0.82)nmol/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。1MED組高于避光組(P<0.001)。提示日光暴露增加了血清25-(OH)D濃度，多次小劑量暴露在提高血清25-(OH)D濃度方面優(yōu)于集中大劑量暴露。

2.2 各組大鼠照射部位皮膚改變

1/5MED組、1/3MED組、1MED組大鼠在照射劑量達到1MED后背部皮膚均出現(xiàn)紅斑，而對照組在實驗期間未出現(xiàn)紅斑(圖1)。皮膚損傷的評分結(jié)果見表1，提示在紫外線暴露所致的紅斑副作用中，多次小劑量暴露產(chǎn)生的副作用小于集中大劑量暴露。

圖1 不同方式紫外線暴露后大鼠皮膚損傷特點。A：1/5MED組，B：1/3MED組，C：1MED組，D：對照組Fig.1 The skin damage characteristics in rats under different ways of UV exposure. A: The 1/5MED group; B: The 1/3MED group; C: The 1MED group; D: The control MED group

表1 不同紫外線暴露方式對大鼠皮膚損傷評分結(jié)果Table 1 The score of skin damage in rats under different ways of UV exposure

注：表格內(nèi)數(shù)據(jù)為M(P25，P75)，4組間比較，P<0.001。

3 討論

3.1 適宜的紫外線暴露頻率與強度有利于獲得較高水平的外源性維生素D

盡管存在廉價有效的預(yù)防手段，維生素D缺乏仍然是許多國家的公共健康問題[2]。大量的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，維生素D不足和缺乏普遍存在，其發(fā)生率大約30%～50%[3]。通過日照,太陽的紫外線(波長290～315 nm)可穿透皮膚，將7-脫氫膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素D3[4]。而過度日照并不會造成維生素D中毒，因為多余的維生素D3可轉(zhuǎn)化為其他數(shù)種光產(chǎn)物而不會過量[5]。但過量照射可產(chǎn)生紅斑、曬黑、光老化、皮膚癌等負健康效應(yīng)[6]。因此，合理的日光照射顯得尤為重要。關(guān)于日光照射的研究較多[7]，但多次小劑量暴露和集中大劑量暴露的報道鮮見。本研究通過建立生長期大鼠不同方式的紫外線暴露模型，探討相同紫外線總暴露劑量下多次小劑量與集中大劑量暴露對生長期大鼠血清25-(OH)D和皮膚的影響，為如何進行日光照射提供一定的參考資料。

血清25-(OH)D含量常作為維生素D營養(yǎng)狀況的指標(biāo)[8]。本研究采用的維生素D 缺乏飼料，除維生素D 含量外，其余成分均符合大鼠生長發(fā)育所需。排除了外源性維生素D的產(chǎn)生途徑，實驗期內(nèi)大鼠體內(nèi)的維生素D全部來自于紫外線照射皮膚所產(chǎn)生，因此血清中25-(OH)D的水平隨著UVB輻射量及暴露方式而改變。本研究顯示1/5MED組血清25-(OH)D濃度最高，其依次為1/3MED組、1MED組和對照組。1/5MED組和1/3MED組的血清25-(OH)D濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其余各組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，提示日光暴露能夠提高血清25-(OH)D的濃度，多次小劑量暴露在提高血清25-(OH)D濃度方面優(yōu)于集中大劑量暴露。

3.2 在獲得外源性維生素D時要考慮到光毒性帶來的皮膚損害

在特定條件下，人體皮膚接受紫外線照射后出現(xiàn)的肉眼可辨的最弱紅斑需要一定的照射劑量，即皮膚紅斑閾值，通常稱為最小紅斑劑量。紫外線紅斑的形成和皮膚受到的照射劑量有關(guān)。依據(jù)照射劑量的大小，臨床上表現(xiàn)為輕重不等的斑疹，顏色可為淡紅色、鮮紅色或深紅色，可有程度不一的水腫，重者出現(xiàn)水皰。紅斑數(shù)日內(nèi)逐漸消退，可出現(xiàn)脫屑及繼發(fā)性色素沉著。從組織學(xué)的角度來看，紫外線紅斑的本質(zhì)是一種急性光毒性炎癥反應(yīng)[9]，其中真皮內(nèi)血管反應(yīng)是產(chǎn)生紅斑的基礎(chǔ)。本研究顯示1/5MED組在照射5次后背部皮膚開始出現(xiàn)輕度紅斑，輕度無水腫；1/3MED組在照射3次后開始出現(xiàn)中度紅斑，輕度水腫；1MED組大鼠在照射1次后開始出現(xiàn)重度紅斑，中度水腫；而對照組在實驗期間未出現(xiàn)紅斑、水腫。由此可見在紫外線暴露所致的紅斑副作用中，多次小劑量暴露產(chǎn)生的副作用小于集中大劑量暴露。

綜上所述，本研究中1/5MED組和1/3MED組的血清25-(OH)D濃度均有明顯升高的現(xiàn)象，但考慮到1/3MED組的皮膚反應(yīng)較1/5MED組嚴重，提示為避免皮膚受傷且能獲得足夠的血清25-(OH)D含量，應(yīng)采取多次小劑量暴露。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)正常人在接受紫外線照射的量達到1MED時，維生素D停止合成[10]。盡管早期紫外線帶來的傷害是可逆的，在進行日光浴時人們也應(yīng)盡量避免一次達到1MED。當(dāng)然本研究只選用了大鼠作為研究對象，未考慮到人類接受陽光照射時的多重影響因素，如何充分合理獲得陽光照射以提高體內(nèi)維生素D水平，同時避免過多的日光照射所帶來的皮膚傷害仍有待進一步研究[11]。

致謝：感謝馬建榮、武瑋、劉強對本實驗的幫助！