鄭 婕，閆 琳，潘 玲，趙啟鵬，張萬年，余建強

·論 著·

扎里奴思方對MCAO缺血-再灌注損傷大鼠凝血及纖溶系統(tǒng)功能的影響

鄭 婕1，2，閆 琳1，2，潘 玲3，趙啟鵬1，2，張萬年1，2，余建強1，2

目的 觀察扎里奴思方對MCAO缺血-再灌注損傷大鼠凝血及纖溶系統(tǒng)功能的影響。方法 應(yīng)用改良的線栓法建立大鼠MCAO缺血-再灌注損傷模型。按神經(jīng)功能評分隨機分為空白對照組、假手術(shù)組、模型組，扎里奴思方低、中、高劑量組(劑量分別為0.35、0.70和1.40 g/kg，連續(xù)灌胃給藥，于術(shù)后第7天采用重量法計算梗死區(qū)重量占全腦重量的比重，取血檢測凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)、活化部分凝血酶原時間(APTT)、纖維蛋白原 (Fib)、抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)及纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物(FDP)含量。結(jié)果 扎里奴思方中、高劑量組明顯降低腦梗死比率(P<0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的TT、APTT時間明顯縮短，AT-Ⅲ活性增強，F(xiàn)ib、FDP含量明顯增高(P<0.05)；與模型組比較，扎里奴思方組顯著延長TT、APTT時間，減弱AT-Ⅲ活性，降低Fib、FDP含量(P<0.05)，尤以扎里奴思方中、高劑量組作用顯著。結(jié)論 扎里奴思方可改善腦缺血再灌注損傷之后凝血-纖溶系統(tǒng)功能紊亂，這可能是其減小腦梗死的體積，減輕腦梗死后繼發(fā)性的腦損傷，發(fā)揮治療和保護腦缺血損傷作用的機制之一。

扎里奴思方；腦缺血-再灌注損傷；保護作用；凝血；纖溶

缺血性腦卒中為目前多發(fā)、常見的腦血管疾病，也是當(dāng)今威脅人類健康和生存的三大重要疾病之一。缺血性腦卒中病因繁多，病理過程復(fù)雜，近年來，越來越多的學(xué)者關(guān)注缺血性腦卒中的病因?qū)W機制，特別是凝血、纖溶系統(tǒng)功能與腦梗死的關(guān)系[1]。研究認為隨著病情的發(fā)展，急性腦梗死患者機體出現(xiàn)廣泛的炎性反應(yīng)進而引起血液黏稠并呈現(xiàn)高凝狀態(tài)，啟動纖維蛋白溶解系統(tǒng)，造成凝血-纖溶系統(tǒng)功能紊亂。在這個階段容易形成血栓，纖溶亢進又很容易導(dǎo)致繼發(fā)性出血，進一步加重缺血性腦損傷，導(dǎo)致惡性循環(huán)[2-3]。因此，凝血與纖溶功能指標與急性腦梗死的病情、預(yù)后及并發(fā)癥等具有一定關(guān)聯(lián)性。目前西醫(yī)多采取溶栓、降纖、腦保護等治療，雖取得一定療效，但易受治療時間窗局限，且容易發(fā)生出血及溶栓后再栓塞等影響[4]。扎里奴思方出自《回回藥方·眾風(fēng)門》，具有芳香開竅、化痰祛瘀、補腎益髓等作用，前期研究已發(fā)現(xiàn)其能促進急性腦梗死患者缺損神經(jīng)功能的恢復(fù)，改善腦梗死后遺活動不利及日常生活能力下降[5-7]，同時對腦缺血-再灌注大鼠具有調(diào)控血腦屏障、抗腦缺血損傷、保護神經(jīng)元、改善血液流變性、改善血脂代謝及調(diào)節(jié)自由基代謝等作用[8-10]。然而，扎里奴思方對梗死后腦組織的保護作用是否與其改善凝血-纖溶系統(tǒng)功能紊亂有關(guān)，目前未見報道。本研究擬采用與臨床病人發(fā)病情況相類似的大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷模型，以缺血性中風(fēng)實為血凝脈內(nèi)之瘀血，阻塞腦脈之病機，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)的腦梗死后機體凝血與纖溶系統(tǒng)功能紊亂為切入點，觀察扎里奴思方對MCAO缺血再灌注損傷大鼠血漿PT、TT、APTT、Fib等凝血指標及AT-III、FDP等抗凝血-纖溶指標的影響，探討扎里奴思方對MCAO缺血再灌注損傷大鼠凝血及纖溶系統(tǒng)功能紊亂的改善作用，為扎里奴思方治療急性缺血性腦損傷提供必要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物:SD大鼠100只，SPF級，全雄，290±15 g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)試驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(寧)2011-0001。

1.1.2 藥品及試劑:扎里奴思方參考 《回回藥方》考釋所載扎里奴思方，方藥組成：安息香3 g、大茴香12 g、當(dāng)歸12 g、沒藥12 g、番梔子花蕊12 g、牡丹皮12 g、蘆薈12 g、水龍骨12 g、懷牛膝24 g、肉桂12 g、海狗腎12 g、菟絲子12 g、石菖蒲12 g、蓽茇12 g。制劑由寧夏醫(yī)科大學(xué)回藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心藥物制劑研究室提供，方中所用生藥材去除雜質(zhì)，按組方劑量配比，煎煮濾取煎液后至藥液含生藥量分為低(0.35 g/kg)、中(0.70 g/kg)、高劑量組(1.40 g/kg)。

1.1.3 主要試劑和儀器:紅四氮唑(Red tetrazoIiⅢn)，分子式為C19H15N4Cl，上海靈錦精細化工有限公司，批號：2008050l。德國SIEMENS公司PT、APTT、TT、Fib試劑盒、日本一化FDP試劑盒。烘箱、冰箱、分析天平、培養(yǎng)皿、鑷子、手術(shù)刀、止血鉗、眼科鑷、眼科彎鑷、3.8%枸櫞酸鈉離心管、EDTA-K2血常規(guī)試管、日本希森美康CS-5100血凝分析儀、CS-5100全自動血凝分析儀。

1.2 方法

1.2.1 模型制備:采用改良的線栓法制備大鼠大腦中動脈阻塞再灌注模型，術(shù)前禁食24 h，自由飲水。用水合氯醛(0.35 g/kg)麻醉大鼠，仰臥位固定。術(shù)區(qū)常規(guī)消毒，沿頸正中線切口，鈍性分離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈和翼腭動脈，結(jié)扎頸外動脈，在近心端結(jié)扎右側(cè)頸總動脈。用0.26 mm魚線(在18 mm處做好標記)，用眼科鑷輕輕插入到18 mm左右，固定線栓，逐層縫合。術(shù)中、術(shù)后保溫至動物清醒。中動脈阻斷2 h后，適當(dāng)抽出線栓約10 mm，剪去漏出皮膚外的線栓，進行再灌注。假手術(shù)組僅鈍性分離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈和翼腭動脈。

1.2.2 分組和給藥:參考Zea Longa 5級評分法,即無神經(jīng)損傷癥狀，評為0分；不能完全伸展左側(cè)前爪，評為1分；向左側(cè)轉(zhuǎn)圈，評為2分；向左側(cè)傾倒，評為3分；不能自發(fā)行走，意識喪失，評為4分。在動物麻醉清醒后第4 h進行評分，0分和4分者剔除，1至3分者納入。納入實驗的模型大鼠，按神經(jīng)功能評分隨機分為空白組、假手術(shù)組、模型組，扎里奴思方低(0.35 g/kg)、中(0.70 g/kg)、高劑量組(1.40 g/kg)，其中空白組、假手術(shù)組10只，其余各組20只。按10 mL/kg容積每天給藥1次，連續(xù)給藥7 d，空白組、假手術(shù)組和模型組給予等體積的生理鹽水。

1.2.3 凝血四項和血常規(guī)檢測：第7天給藥1 h后，各組大鼠股動脈取血，置入3.8%枸櫞酸鈉的離心管中，動脈血與抗凝劑的比例嚴格控制為9∶1。顛倒混勻5～6次后在2 h內(nèi)以3 000 r/min的速度離心10 min，參照日本希森美康CS-5100血凝分析儀操作規(guī)程進行測定，記錄凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)、活化部分凝血酶原時間(APTT)、纖維蛋白原(Fib)含量。參照CS-5100全自動血凝分析儀規(guī)程進行測定，記錄FDP、AT-Ⅲ。

1.2.4 腦梗死比率的測定：上述取血處死后的大鼠在冰浴下取全腦，腦組織于-20 ℃冷凍約10 min后取出，每2 mm冠狀位切片，用2%紅四氮唑溶液于37 ℃避光染色30 min，缺血區(qū)被染成白色，正常區(qū)域為紅色，采用重量法計算梗死區(qū)重量占全腦重量的比重，即腦梗死比率。腦梗死比率=梗死部分重量(g)/全腦重量(g)×100%。

2 結(jié)果

2.1 腦梗死比率：與假手術(shù)組比較，腦缺血再灌注損傷后，大鼠腦梗死體積明顯增大，腦梗死比率增加；與模型組比較，扎里奴思方高、中劑量組能明顯降低腦梗死比率(P<0.05)。見表1。

表1 扎里奴思方對腦缺血再灌注損傷大鼠腦梗死比率的影響

注:*與模型組比較，P<0.05。

2.2 扎里奴思方對腦缺血再灌注損傷大鼠凝血四項的影響:與假手術(shù)組比較，模型組TT、APTT明顯縮短(P< 0.05)，F(xiàn)ib含量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，扎里奴思方高、中、低劑量組明顯延長TT(P<0.05)，扎里奴思方高、中劑量組顯著延長APTT(P<0.05)，并明顯升高Fib含量(P<0.05)，見表2。

表2 扎里奴思方對腦缺血再灌注損傷大鼠凝血四項的影響

注：▲與假手術(shù)組比較，P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

2.3 扎里奴思方對腦缺血再灌注損傷大鼠AT-Ⅲ和FDP的影響：與假手術(shù)組比較，模型組AT-Ⅲ活性、FDP含量明顯增高(P<0.05)；與模型組比較，扎里奴思方中、高劑量組明顯降低AT-Ⅲ活性(P<0.05)，扎里奴思方低、中、高劑量組顯著降低FDP含量(P<0.05)，見表3。

表3 扎里奴思方對腦缺血-再灌注損傷大鼠AT-Ⅲ和FDP的影響

注：▲與假手術(shù)組比較，P<0.05；△與模型組比較，P<0.05。

3 討論

因善用芳香開竅、辛溫走竄類藥物，回醫(yī)藥在治療腦病方面具有獨特的優(yōu)勢。扎里奴思方出自元代成書的《回回藥方》，該方由芳香開竅(安息香)、活血化痰(沒藥、番梔子花蕊、石菖蒲、當(dāng)歸、蘆薈、水龍骨、牡丹皮)、 補腎益髓(海狗腎、菟絲子、懷牛膝、肉桂、大茴香)等藥物組成，“可開竅，凈其渾身厚濁風(fēng)痰，治療痰盛弱病”[11]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，扎里奴思方治療腦梗死，可以明顯提高患者神經(jīng)功能評分，改善患者運動功能，提高患者生存質(zhì)量[5-6]；可減輕腦梗死患者頸動脈粥樣硬化的程度，減少血流阻力，使血流速度加快，從而改善腦梗死患者頸動脈系統(tǒng)的供血，并且對患者的肝、腎功能沒有明顯的影響[7]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究也證實，扎里奴思方可減少腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織含水量，減小腦梗死面積，增加神經(jīng)元數(shù)量，減輕病理損傷[8-10]。然而，目前對扎里奴思方減輕大鼠腦缺血再灌注損傷的確切機制并不十分明確。

腦缺血再灌注損傷(Cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)是繼發(fā)于缺血性腦血管病溶栓過程中的一種損傷程度更重的病理變化，也是多種機制參與的復(fù)雜的酶促級聯(lián)反應(yīng)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注后，機體炎性細胞過度激活，產(chǎn)生并釋放大量細胞因子，通過各種途徑激活凝血系統(tǒng)，使機體處于高凝狀態(tài)，產(chǎn)生抗凝物質(zhì)和啟動纖維蛋白溶解系統(tǒng)，導(dǎo)致凝血-纖溶系統(tǒng)的功能失衡，微血栓形成增加，微循環(huán)發(fā)生障礙，進而參與和促進繼發(fā)性腦損傷[2-4]。因此，腦缺血-再灌注損傷是急性腦血管病發(fā)生與發(fā)展中重要的病理生理基礎(chǔ),而凝血-纖溶系統(tǒng)功能紊亂則是腦缺血-再灌注損傷引起的諸多病理變化中主要的病理基礎(chǔ)之一，也是導(dǎo)致腦卒中患者高病死率和高致殘率的主要原因之一。

目前，臨床上檢測凝血功能的指標主要包括血漿凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血酶原時間(APTT)、凝血酶時間(TT)及纖維蛋白原(Fib)。在多項臨床實驗研究中均發(fā)現(xiàn)，腦卒中患者常表現(xiàn)為內(nèi)源性和(或)外源性凝血途徑的異常，腦卒中的危險隨著 Fib 水平的升高而增加，表明血漿Fib水平升高是缺血性腦卒中的獨立危險因素[12-13]。本實驗中，模型組大鼠的APTT和TT均明顯縮短，F(xiàn)ib含量明顯增多，說明MCAO缺血-再灌注損傷大鼠的凝血功能出現(xiàn)異常，血液呈高凝狀態(tài)。扎里奴思方能顯著延長TT和APTT，降低 Fib 的含量，表明扎里奴思方能抑制內(nèi)源性凝血因子的活性，具有抑制血液呈高凝狀態(tài)的作用。AT-Ⅲ是血漿中抑制凝血的關(guān)鍵物質(zhì)，其中凝血酶的滅活 70%～80%由其實現(xiàn);同時它也可抑制其他活化凝血因子、纖溶酶、胰蛋白酶和激肽釋放酶的活性，在體內(nèi)起著重要的抗凝調(diào)節(jié)作用。FDP反映血循環(huán)中Fib在纖溶酶作用下生成的 X、Y、D、E碎片含量，它反映纖維蛋白溶解系統(tǒng)激活，可作為血管內(nèi)凝血、纖維蛋白溶解和血栓形成的標志物。因此，AT-Ⅲ、FDP的測定能在一定程度上反映腦梗死后患者抗凝血-纖溶系統(tǒng)的狀況[3,14]。在本實驗中，發(fā)現(xiàn)腦缺血-再灌注損傷之后,模型組大鼠的AT-Ⅲ活性增強、FDP含量增高，說明腦缺血再灌注之后同時存在抗凝血-纖溶系統(tǒng)功能的亢進，其原因可能是缺血-再灌注后對機體高凝狀態(tài)的一種繼發(fā)性反應(yīng)，其結(jié)果是造成凝血-纖溶系統(tǒng)功能平衡的紊亂。扎里奴思方能顯著抑制AT-Ⅲ活性，降低FDP水平，從而抑制繼發(fā)性抗凝血及纖溶系統(tǒng)功能的亢進，以此緩解腦缺血-再灌注損傷之后引起的凝血-抗凝血-纖溶系統(tǒng)的過度激活。

本研究采用了大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷模型，從腦梗死后機體凝血和纖溶系統(tǒng)功能紊亂的機理出發(fā)，觀察了扎里奴思方對MCAO缺血-再灌注損傷大鼠凝血-纖溶系統(tǒng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)扎里奴思方能夠顯著延長MCAO缺血-再灌注損傷大鼠的TT和APTT，降低 Fib 的含量，同時抑制AT-Ⅲ活性，降低FDP水平，糾正腦缺血-再灌注損傷之后凝血-抗凝血-纖溶系統(tǒng)功能紊亂，從而減少腦梗死的體積，這可能是其減輕腦梗死后繼發(fā)性腦損傷，發(fā)揮治療和保護腦缺血損傷作用的機制之一。

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Effect of Zhali Nusi Fang on the coagulation and fibrinolytic system after focal cerebral ischemia-reperfusion in rats

ZHENG Jie1,2,YAN Lin1,2,PAN Ling3,ZHAO Qipeng1,2,ZHANG Wannian1,2,YU Jianqiang1,2.

1.College of Pharmacy,Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China;2.Ningxia Hui Medicine Modern Engineering Research Center and Collaborative Innovation Center,Yinchuan 750004,China;3.General Hospital of Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China

YU Jianqiang,Email:0951zhengjie@163.com

Objective To investigate the effects of Zhali Nusi Fang (ZNF) on the coagulation and fibrinolytic system after focal cerebral ischemia-reperfusion (I/R) in rats.Methods The animal model was induced into focal cerebral ischemia reperfusion by middle cerebral artery occlusion with thread-obstruction method.The SD rats were randomly divided into six groups according to neurological function score:the normal group,the sham-operated group,model group,high-,middle- and low-dose ZNF groups (the dosage was respectively 0.35、0.70 and 1.40 g/kg in three groups).After administered orally with Corresponding drugs for 7 days,the brain and the blood sample were selected.Besides determining the infarct volume,the levels of the coagulation and fibrinolytic system parameters including PT,APTT,TT,Fib,AT-Ⅲ and FDP were analyzed.Results The infarct volume of the ischemia reperfusion brain was significantly decreased in high- and middle-dose ZNR groups.Compared with the sham-operated group,The levels of Fib,FDP were increased (P<0.05) and the activity of AT-Ⅲ was enhanced as well as the levels of APTT and TT significantly shortened in the model group (P<0.05);compared with the model group,ZNF significantly decreased the content of Fib,FDP (P<0.05) and the activity of AT-Ⅲ,accompanied by? the prolongation of APTT and TT (P<0.05).Conclusion ZNF could normalize the balance between coagulation and fibrinolytic system after focal cerebral ischemia-reperfusion,which may be relevant to its neuroprotective effect in treating ischemic cerebrovascular disease.

ZhaliNusiFang(ZNF);Cerebralischemia-reperfusioninjury;Protection;Coagulation;Fibrinolyticsystem

10.13621/j.1001-5949.2017.07.0584

國家科技支撐項目(2013BAI11B07) ;寧夏科技攻關(guān)計劃項目(2012)

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，寧夏 銀川 750004 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)回藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心，寧夏 銀川 750004 3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，寧夏 銀川 750004

鄭婕(1976-)，女，講師，從事寧夏道地藥材活性成分藥效學(xué)評價工作。

余建強，Email：yujq910315@126.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170713.0845.008.html

R735

A

2017-01-14 [責(zé)任編輯]李 潔