郭壯，沈馨，董蘊(yùn)，吳競，凌霞，胡事成，趙慧君*

（1.湖北文理學(xué)院化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北襄陽441053；2.襄陽市食品藥品檢驗(yàn)所，湖北襄陽441021；3.襄陽孔明菜有限公司，湖北襄陽441000）

襄陽大頭菜腌制液膜醭細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)研究

郭壯1，沈馨1，董蘊(yùn)1，吳競2，凌霞2，胡事成3，趙慧君1*

（1.湖北文理學(xué)院化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北襄陽441053；2.襄陽市食品藥品檢驗(yàn)所，湖北襄陽441021；3.襄陽孔明菜有限公司，湖北襄陽441000）

使用Miseq高通量測序技術(shù)對3個(gè)襄陽大頭菜腌制液膜醭樣品的細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析。在門水平上，變形菌門（Proteobacteria）和硬壁菌門（Firmicutes）平均含量分別為62.12%和34.13%。在屬水平上，相對含量＞1.0%的細(xì)菌屬分別為鹽單胞菌（Halomonas）、色鹽桿菌屬（Chromohalobacter）、海桿菌屬（Marinobacter）、鹽厭氧菌屬（Halanaerobium）、四聯(lián)球菌（Tetragenococcus）和堿桿菌屬（Alkalibacillus），其相對含量為26.31%、16.49%、8.13%、24.87%、6.13%和1.16%。在操作分類單元水平（OTU）上，發(fā)現(xiàn)14個(gè)平均相對含量＞1.0%的核心OTU，其中OTU4083（隸屬于鹽厭氧菌屬）、OTU4400（隸屬于色鹽桿菌屬）和OTU846（隸屬于鹽單胞菌屬）的累計(jì)平均相對含量為39.50%。由此可見，襄陽大頭菜膜醭中的細(xì)菌微生物主要由隸屬于變形菌門和硬壁菌門的6個(gè)屬構(gòu)成，且膜醭共有大量的核心細(xì)菌菌群。

襄陽大頭菜；膜醭；細(xì)菌；多樣性

作為我國四大腌菜之一的襄陽大頭菜，在長達(dá)18個(gè)月的腌制過程中，因腌制池表面常形成一層白色的膜醭，導(dǎo)致其品質(zhì)會(huì)明顯下降甚至失去經(jīng)濟(jì)價(jià)值，嚴(yán)重?fù)p害了種植戶和企業(yè)的經(jīng)濟(jì)收益，且類似問題在泡菜[1]和葡萄酒[2]等行業(yè)中亦較為普遍。膜醭具體表現(xiàn)為在發(fā)酵基質(zhì)的表面形成一層成片或成碎花狀的白膜，其實(shí)質(zhì)是一種黏附在生物或非生物材料表面由微生物群體和包裹菌體基質(zhì)組成的聚合物[3]。

近年來，國內(nèi)外研究人員圍繞發(fā)酵食品中膜醭微生物群體的物種組成這一科學(xué)問題開展了多項(xiàng)卓有成效的研究。目前普遍認(rèn)為發(fā)酵食品基質(zhì)表面形成的膜醭是由高需氧的酵母引起的[4]。除真菌外，有學(xué)者指出細(xì)菌對膜醭的形成亦有貢獻(xiàn)，其中枯草芽孢桿菌作為模式微生物被大量研究[5]。TRISTEZZA M等[2]研究發(fā)現(xiàn)，分離自葡萄酒中的乳酸菌、醋酸菌在特定的條件下均能形成膜醭。蔣云露等[6]對泡菜膜醭形成過程中膜醭和鹽鹵中的細(xì)菌群落構(gòu)成和動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)膜醭形成的前、中、后期細(xì)菌種類差異較大，前期以革蘭氏陽性為主，后期以革蘭氏陰性為主。何鵬輝等[7]對泡菜膜醭中細(xì)菌進(jìn)行了分離，研究發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）、弗羅因德（氏）枸櫞酸桿菌（Citrobacter freundii）、科氏葡萄球菌科氏亞種（Staphylococcus cohniisubsp.cohnii）、居幼蟲普羅威登斯菌（Providencia vermicola）、克雷伯氏菌（Klebsiellasp.）和陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）等均與膜醭的形成有關(guān)。敖曉琳等[8]亦從泡菜水中分離了導(dǎo)致膜醭形成的微生物，其中3株細(xì)菌被鑒定為枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）、1株被鑒定為高地芽孢桿菌（Bacillus altitudinis）。上述研究的開展為明確是何種微生物導(dǎo)致了襄陽大頭菜腌制過程中膜醭的形成提供了借鑒。但上述研究多數(shù)以純培養(yǎng)技術(shù)為主要研究手段，且在選擇分離培養(yǎng)基時(shí)存在一定的隨意性，因而在研究膜醭中微生物群體的物種組成方面顯示出較大的片面性和局限性。

本實(shí)驗(yàn)以表面長膜醭的大頭菜腌制液為研究對象，采用Miseq高通量測序技術(shù)，以細(xì)菌16S rRNA為測序靶點(diǎn)，結(jié)合生物信息學(xué)手段對膜醭的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了揭示，以期為后續(xù)采取有效措施杜絕大頭菜腌制過程中膜醭的形成提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品（長膜醭的大頭菜腌制液和膜醭）：湖北省襄陽孔明菜有限公司。

脫氧核糖核苷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）Mix、5×TransStartTM、FastPfu Buffer和FastPfu Fly DNA Polymerase：北京全式金生物技術(shù)有限公司；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit：德國QIAGEN公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Miseq高通量測序平臺(tái)：美國Illumina公司；2100芯片生物分析儀：美國Agilent公司；5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司；ND-2000C微量紫外分光光度計(jì)：美國NanoDrop公司；DYY-12電泳儀：北京六一儀器廠；Vetiri梯度基因擴(kuò)增儀：美國AB公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)：美國BIO-RAD公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的采集

從腌制缸中采集長膜醭的大頭菜腌制液和膜醭，使用組織搗碎機(jī)將其攪拌均勻后裝入無菌采樣管中，冷鏈運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室并進(jìn)行脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取。

1.3.2 DNA提取

使用QIAGEN DNeasy mericon Food Kit試劑盒按照說明書步驟對樣品宏基因組DNA進(jìn)行提取，從濃度和純度對DNA質(zhì)量進(jìn)行檢測，符合要求的DNA保存在-20℃條件下備用。

1.3.3 細(xì)菌16S rRNA擴(kuò)增

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增體系為：4 μL 5×PCR緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs Mix，0.8μL5μmol/L正向引物，0.8μL5μmol/L反向引物，0.4μL 5 U/μL DNA聚合酶，10 ng DNA模板，體系用ddH2O補(bǔ)充至20μL。細(xì)菌16SrRNA正向引物為338F（5'-ACTCCTACGG GAGGCAGCA-3'），反向引物為806R（5'-GGACTACHVG GGTWTCTAAT-3'），在正向引物中加入7個(gè)核苷酸標(biāo)簽（barcode）

擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30s，72℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.3.4 樣品平衡及Miseq高通量測序

經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)合格的擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋至100 nmol/L，混合均勻后寄往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，使用Miseq平臺(tái)進(jìn)行高通量測序。

1.3.5 序列的拼接及質(zhì)控

首先根據(jù)成對序列之間的重疊關(guān)系，將雙端序列數(shù)據(jù)拼接成一條序列，繼而根據(jù)barcode將所有序列劃分到各個(gè)樣品并對序列方向進(jìn)行校正，最后切掉序列barcode和引物。在拼接過程中，若重疊區(qū)的堿基數(shù)＜10 bp或最大錯(cuò)配比率＞0.2，barcode堿基錯(cuò)配或引物堿基錯(cuò)配數(shù)＞2 bp，或切掉barcode和引物后堿基數(shù)＜50 bp則將序列予以剔除。

1.3.6 生物信息學(xué)分析

質(zhì)控后的序列使用QIIME（v1.7.0）分析平臺(tái)[9]進(jìn)行物種和多樣性分析，主要的處理流程為：

①使用PyNAST[10]校準(zhǔn)排齊序列，在序列100%相似性下進(jìn)行UCLUST[11]歸并，建立無重復(fù)的16S rRNA全長序列集；

②在序列97%相似度下進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）劃分；

③對OTU代表性序列進(jìn)行同源性比對，整合RDP（ribosomaldatabase project，Release 11.5）[12]和Greengenes（Release 13.8）[13]兩個(gè)數(shù)據(jù)庫的比對結(jié)果，確定每個(gè)OTU最終的分類學(xué)地位；

④使用FastTree軟件[14]繪制基于OTU代表性序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，隨后計(jì)算樣品的α多樣性。

1.3.7 核酸登錄號(hào)

本研究中所有序列數(shù)據(jù)已提交至MG-RAST數(shù)據(jù)庫，ID號(hào)為mgp79756。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列豐富度和多樣性分析

3個(gè)腌制液膜醭樣品16S rRNA測序情況及各分類地位數(shù)量如表1所示。

由表1可知，通過Miseq高通量測序，本研究采集的3個(gè)樣品共產(chǎn)生了105 382條高質(zhì)量16S rRNA序列，平均每個(gè)樣品產(chǎn)生35 127條。經(jīng)過100%序列鑒定聚類分析后，本研究共得到48 025條代表性序列，根據(jù)序列的97%相似性進(jìn)行操作分類單元?jiǎng)澐趾?，共得? 016個(gè)OTU，每個(gè)樣品平均2 566個(gè)OTU。以測序量為自變量，以發(fā)現(xiàn)物種數(shù)和香農(nóng)多樣性指數(shù)為因變量，使用Origin8.6軟件（OriginLab，MA，USA）進(jìn)行稀疏曲線和香農(nóng)多樣性指數(shù)曲線繪制，其結(jié)果如圖1所示。

表1 樣品16S rRNA測序情況及各分類地位數(shù)量Table 1 16S rRNA sequencing conditions and classifications at different taxonomical levels

圖1 稀疏性曲線（A）和香農(nóng)多樣性指數(shù)（B）Fig.1 Rarefaction curve(A)and Shannon diversity index(B)

由圖1（A）可知，隨著測序深度的增加，發(fā)現(xiàn)物種的數(shù)量繼續(xù)增加且沒有達(dá)到平衡狀態(tài)，說明隨著測序量的增加可能會(huì)有新的種系型被發(fā)現(xiàn)。由圖1（B）可知，隨著測序深度的增加，香農(nóng)多樣性指數(shù)曲線已基本達(dá)到平衡狀態(tài)，說明在此測序水平下，樣品中細(xì)菌的多樣性已能充分展現(xiàn)。由此可見，本研究產(chǎn)出的序列已經(jīng)能全面捕獲樣品中細(xì)菌微生物的多樣性，因而是滿足后續(xù)分子生物學(xué)分析的。

2.2 基于不同分類地位核心菌群相對含量的分析

本研究使用SILVA數(shù)據(jù)庫對OTU代表性序列進(jìn)行了同源性比對，所有的序列鑒定為24個(gè)門，57個(gè)綱，81個(gè)目，153個(gè)科和268個(gè)屬，其中有13.25%的序列不能鑒定到屬水平。3個(gè)大頭菜膜醭樣品中平均相對含量＞1.0%的細(xì)菌門分別為變形菌門（Proteobacteria）、硬壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes），其相對含量分別為62.12%、34.13%和1.12%。如果某一細(xì)菌屬在3個(gè)樣品中的平均相對含量＞1.0%，則將其定義為優(yōu)勢細(xì)菌屬。襄陽大頭菜腌制液膜醭中優(yōu)勢細(xì)菌屬相對含量的比較分析如圖2所示。

圖2 襄陽大頭菜腌制液膜醭中優(yōu)勢細(xì)菌屬相對含量的比較分析Fig.2 Comparative analysis on the relative content of the dominant bacterial genera in biomembrane of Xiangyang mustard root brine

由圖2可知，3個(gè)大頭菜腌制液膜醭樣品中優(yōu)勢細(xì)菌屬分別為隸屬于變形菌門（Proteobacteria）的鹽單胞菌屬（Halomonas）、色鹽桿菌屬（Chromohalobacter）和海桿菌屬（Marinobacter），其相對含量為26.31%、16.49%和8.13%；隸屬于硬壁菌門（Firmicutes）的鹽厭氧菌屬（Halanaerobium）、四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）和堿桿菌屬（Alkalibacillus），其相對含量為24.87%、6.13%和1.16%。由此可見，襄陽大頭菜腌制液膜醭中的細(xì)菌主要由隸屬于變形菌門和硬壁菌門的6個(gè)屬構(gòu)成，其累計(jì)相對含量為83.10%。張奶英等[15]指出鹽單胞菌屬（Halomonas）為葉用芥菜腌制過程中的主要優(yōu)勢菌，且色鹽桿菌屬（Chromohalobacter）在整個(gè)腌制過程中均有檢出；尹禮國等[16]指出海桿菌屬（Marinobacter）為鹽漬青菜發(fā)酵初期的優(yōu)勢菌；有學(xué)者指出鹽單胞菌屬（Halomonas）、色鹽桿菌屬（Chromohalobacter）和海桿菌屬（Marinobacter）為四川泡菜中的優(yōu)勢菌[17]，上述研究結(jié)論與本研究相同。除此之外，鹽厭氧菌屬（Halanaerobium）具有嗜鹽和產(chǎn)氫的特性[18]，常用于含鹽廢水的厭氧處理[19]。四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）隸屬于腸球菌科（Enterococcaceae），是一種中度嗜鹽的乳酸菌，多分布于醬類制品中[20]。作為一種中度嗜鹽嗜堿菌，堿桿菌屬（Alkalibacillus）常分布于高鹽度的土壤中[21]。

如果某一個(gè)菌屬在3個(gè)樣品中均存在，則本研究將其定義為核心菌屬。本研究共發(fā)現(xiàn)87個(gè)核心細(xì)菌屬，且上述6個(gè)相對含量＞1.0%的細(xì)菌屬均為核心屬，襄陽大頭菜腌制液膜醭中相對含量＞1.0%的核心細(xì)菌屬相關(guān)性如圖3所示。

圖3 平均相對含量＞1.0%的核心細(xì)菌屬相關(guān)性Fig.3 Correlation among the core bacterial genera with relative abundance of more than 1.0%

由圖3可知，6個(gè)相對含量＞1.0%的細(xì)菌屬之間相關(guān)性均不顯著（P＞0.05）。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)了OTU在3個(gè)樣品中出現(xiàn)的次數(shù)，其結(jié)果如圖4所示。

圖4OTU在襄陽大頭菜腌制液膜醭樣品中出現(xiàn)次數(shù)統(tǒng)計(jì)Fig.4 Occurrence frequency of OTU as a function of their prevalence in biomembrane of Xiangyang mustard root brine

由圖4可知，3個(gè)襄陽大頭菜腌制液膜醭樣品共產(chǎn)生6 016個(gè)細(xì)菌OTU，其中在3個(gè)樣品中僅出現(xiàn)1次和2次的OUT為4794和761個(gè)，占OTU總數(shù)的79.69%和12.65%，所包含序列數(shù)為6280條和5903條，占所有質(zhì)控后合格序列數(shù)的5.96%和5.60%。采用VENNY2.1在線軟件（http：//bioinfogp. cnb.csic.es/tools/venny/index.html），基于OTU水平進(jìn)行Venn圖繪制，其結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，3個(gè)襄陽大頭菜膜醭樣品中共發(fā)現(xiàn)461個(gè)細(xì)菌的核心OTU，僅占OTU總數(shù)的7.66%，但其包含93 199條序列，占所有質(zhì)控后合格序列數(shù)的88.44%。此外，由上述分析可知，4 794個(gè)僅出現(xiàn)1次的OTU，其包含6 280條序列，平均每個(gè)OTU僅有1.31條序列，本研究共產(chǎn)生105 382條高質(zhì)量16S rRNA序列，則每個(gè)僅出現(xiàn)1次的OTU其包含序列數(shù)占總序列數(shù)的0.001 2%，由此可見，雖然有的樣品中含有一些較為獨(dú)特的OTU，但其相對含量較低，因而大頭菜腌制液膜醭樣品共有大量的核心細(xì)菌菌群。本研究發(fā)現(xiàn)的461個(gè)核心OTU中相對含量＞1.0%的OTU在3個(gè)樣品中相對含量如圖6所示。

圖5 基于OTU水平的Venn圖Fig.5 Venn diagram based on OTU level

圖6 相對含量＞1.0%的核心OTU在各襄陽大頭菜腌制液膜醭樣品中相對含量Fig.6 The relative contents of core OTU with relative abundance of more than 1.0%in biomembrane of Xiangyang mustard root brine

由圖6可知，14個(gè)核心OTU中，6個(gè)隸屬于鹽單胞菌屬（Halomonas）、3個(gè)隸屬于鹽單胞菌屬（Halanaerobium）、2個(gè)隸屬于四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）、各有1個(gè)隸屬于海桿菌屬（Marinobacter）和色鹽桿菌屬（Chromohalobacter），1個(gè)OTU僅能鑒定到鹽單胞菌科（Halomonadaceae）。值得一提的是，在3個(gè)樣品中平均含量最高的3個(gè)核心OTU分別為OTU4083（隸屬于鹽單胞菌屬）、OTU4400（隸屬于色鹽桿菌屬）和OTU846（隸屬于鹽單胞菌屬），其平均含量分別為15.61%、14.58%和9.31%。值得一提的是，核心OTU4083、OTU4400和OTU846在樣品MBX1、MBX2和MBX3中的累計(jì)相對含量分別為33.13%、45.60%和39.76%，這也進(jìn)一步證實(shí)了襄陽大頭菜腌制液膜醭樣品共有大量的核心細(xì)菌菌群，3個(gè)核心OTU的相對含量就占到了細(xì)菌類群的1/3左右。本研究進(jìn)一步對平均相對含量＞1.0%的核心OTU之間的相關(guān)性進(jìn)行了分析，其結(jié)果如圖7所示。

圖7 平均相對含量＞1.0%的核心OTU相關(guān)性Fig.7 Correlation among the core OTU with relative abundance more than 1.0%

由圖7可知，OTU846（隸屬于鹽單胞菌屬）與OTU5759（隸屬于鹽單胞菌屬）和OTU4273（隸屬于鹽單胞菌屬）均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)分別為0.997和0.998，而與OTU642（Halomonas）呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)為-0.999；OTU5759（隸屬于鹽單胞菌屬）與OTU4273（隸屬于鹽單胞菌屬）、OTU694（隸屬于四聯(lián)球菌屬）與OTU1349（隸屬于四聯(lián)球菌屬）、OTU5914（隸屬于鹽單胞菌屬）與OTU1455（隸屬于鹽單胞菌屬）均呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)分別為1.000、0.999和1.000。

3 結(jié)論

本研究采用宏基因組學(xué)策略，使用Miseq高通量測序技術(shù)，以細(xì)菌16S rRNA為測序靶點(diǎn)，對表面長膜醭的襄陽大頭菜腌制液中細(xì)菌微生物的多樣性進(jìn)行了揭示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，襄陽大頭菜膜醭中的細(xì)菌微生物主要由隸屬于變形菌門和硬壁菌門的鹽單胞菌屬、色鹽桿菌屬、海桿菌屬、鹽厭氧菌屬、四聯(lián)球菌屬和堿桿菌屬的6個(gè)細(xì)菌屬組成，且大頭菜腌制液膜醭共有大量的核心細(xì)菌菌群。通過本研究的開展，可為因形成膜醭而導(dǎo)致襄陽大頭菜產(chǎn)品品質(zhì)下降這一產(chǎn)業(yè)化問題的解決提供理論依據(jù)，同時(shí)亦可為泡菜和葡萄酒等發(fā)酵食品發(fā)酵過程中膜醭形成的研究提供參考。

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Diversity of bacterial microflora of biomembrane in Xiangyang mustard root brine

GUO Zhuang1,SHEN Xin1,DONG Yun1,WU Jing2,LING Xia2,HU Shicheng3,ZHAO Huijun1*
(1.Northwest Hubei Research Institute of Traditional Fermented Food,College of Chemical Engineering and Food Science,Hubei University of Arts and Science,Xiangyang 441053,China;2.Xiangyang Institute of Food and Drug Supervision,Xiangyang 441053,China; 3.Xiangyang Kongming Mustard Root Co.,Ltd.,Xiangyang 441000,China)

Three biomembrane samples of Xiangyang mustard root brine were collected and the bacterial microbiota community structure was studied by Miseq high throughput sequencing technology.Results showed that at phyla level,Proteobacteria and Firmicutes were the most dominant,with the relative abundance of 62.12%and 34.13%,respectively.At Genus level,the genus with relative content more than 1.0%wereHalomonas,Chromohalobacter,Marinobacter,Halanaerobium,Tetragenococcus,andAlkalibacillus,with the relative abundance of 26.31%,16.49%,8.13%,24.87%, 6.13%,and 1.16%,respectively.At the operational taxonomic unit(OTU)level,results showed that 14 OTUs were with the relative abundance of more than 1.0%,and the cumulative average relative contents of OTU4083(member ofHalanaerobium),OTU4400(member ofChromohalobacter),and OTU846(member ofHalomonas)was39.50%.The results indicated that the bacterial microbiota of biomembrane in Xiangyang mustard root brine was mainlyconsisted by6 genera,includingProteobacteria and Firmicutes,and biomembrane samplesshared a large number ofcore bacterialmicrobiome. Key words：Xiangyang mustard root;biomembrane;bacterium;diversity

TS264.2

0254-5071（2017）07-0143-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.031

2017-04-03

湖北省食品藥品監(jiān)督管理局科研項(xiàng)目（201601025）；襄陽市科技計(jì)劃研究與開發(fā)項(xiàng)目（2016）；湖北文理學(xué)院食品新型工業(yè)化學(xué)科群建設(shè)項(xiàng)目（2017）

郭壯（1984-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。

*通訊作者：趙慧君（1979-），女，講師，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。