王 睿,胡貽椿,李 敏,吳景歡,楊曉光,毛德倩
(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與健康所/國(guó)家衛(wèi)計(jì)委微量元素營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100050)
轉(zhuǎn)DBN9978基因抗蟲(chóng)抗除草劑玉米對(duì)大鼠的亞慢性毒性研究
王 睿,胡貽椿,李 敏,吳景歡,楊曉光,毛德倩
(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與健康所/國(guó)家衛(wèi)計(jì)委微量元素營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100050)
目的:研究喂飼轉(zhuǎn)DBN9978基因玉米對(duì)大鼠的亞慢性毒性。方法:選用斷乳SD大鼠140只,隨機(jī)分為7組,即3個(gè)轉(zhuǎn)基因組(73.3%、36.65%、18.33%)、3個(gè)親本玉米組(72.7%、35.35%、18.18%)、1個(gè)常規(guī)基礎(chǔ)飼料對(duì)照組。每組20只,雌雄各半。動(dòng)物2只/籠喂養(yǎng),自由進(jìn)食飲水,連續(xù)觀察90d。觀察大鼠體重、進(jìn)食量、血液學(xué)指標(biāo)、血生化指標(biāo),實(shí)驗(yàn)結(jié)束后摘取動(dòng)物臟器進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。結(jié)果:各劑量組動(dòng)物的體重均呈增長(zhǎng)趨勢(shì),轉(zhuǎn)基因組、親本對(duì)照組與飼養(yǎng)對(duì)照組每周體重及體重總增重、每周進(jìn)食量、總食物利用率以及中、末期的血液學(xué)和血生化指標(biāo),各主要臟器系數(shù)及病理組織學(xué)檢查比較,均未發(fā)現(xiàn)有生物學(xué)意義的改變。結(jié)論:現(xiàn)有試驗(yàn)結(jié)果不能證實(shí)該轉(zhuǎn)DBN9978基因玉米對(duì)大鼠有亞慢性毒性作用。
轉(zhuǎn)基因玉米;DBN9978基因;亞慢性毒性
玉米螟和田間雜草是玉米種植中兩個(gè)重要問(wèn)題,因此,抗蟲(chóng)和抗除草劑一直是玉米品種改良的重要內(nèi)容[1]。利用轉(zhuǎn)基因方法可以顯著提高玉米抗蟲(chóng)、抗除草劑的品質(zhì),具有重要的經(jīng)濟(jì)效益,但這種技術(shù)是否會(huì)對(duì)人體帶來(lái)危害,是社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。本次實(shí)驗(yàn)依據(jù)“實(shí)質(zhì)等同性”原則[2],按照中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T1102-2006)《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品食用安全檢測(cè)—大鼠90d喂養(yǎng)試驗(yàn)》[3],對(duì)轉(zhuǎn)DBN9978基因玉米進(jìn)行了大鼠90 d喂養(yǎng)試驗(yàn),了解分析該轉(zhuǎn)基因玉米是否會(huì)對(duì)大鼠產(chǎn)生亞慢性毒性作用,為該轉(zhuǎn)基因玉米的食用飼用性安全提供參考依據(jù)。
1.1 實(shí)驗(yàn)材料與主要儀器
轉(zhuǎn)基因玉米DBN9978,以下簡(jiǎn)稱轉(zhuǎn)基因玉米;轉(zhuǎn)化受體DBN567,以下簡(jiǎn)稱親本玉米;AIN-93G,以下簡(jiǎn)稱對(duì)照玉米(均為黃色籽粒,DBN9978、DBN567,由北京大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司提供,經(jīng)產(chǎn)品檢測(cè)后開(kāi)展本次試驗(yàn))。L535R湘儀低速冷凍離心機(jī)、BS-220型全自動(dòng)生化分析儀、BC-5000VET全自動(dòng)五分類血液分析儀、Leica HI1220烘片機(jī)、Leica RM2016輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、Leica HI1210攤片機(jī)、Leica EG1150H型石蠟包埋機(jī)。血細(xì)胞稀釋液及溶血?jiǎng)?gòu)自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司;血生化檢測(cè)試劑盒,購(gòu)自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司、重慶中元生物技術(shù)有限公司。
1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼養(yǎng)條件
北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供的健康SD大鼠(SPF級(jí),許可證號(hào):SCXK(京)2012-0001)。飼養(yǎng)地點(diǎn):匯智泰康生物技術(shù)(北京)有限公司,級(jí)別:屏障環(huán)境,許可證號(hào):SYXK(京)2014-0022。
1.3 飼料配制
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前在北京市營(yíng)養(yǎng)源研究所檢測(cè)中心對(duì)各種玉米的營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行全面檢測(cè),參照美國(guó)營(yíng)養(yǎng)研究所的AIN-93G配方,在保證營(yíng)養(yǎng)平衡的基礎(chǔ)上以蛋白質(zhì)最大摻入為原則計(jì)算轉(zhuǎn)基因玉米能摻入飼料的最大比例。經(jīng)計(jì)算得出親本玉米在飼料中的最大摻入量為72.70%,以此作為高劑量,中、低劑量的玉米摻入量分別設(shè)為35.35%和18.18%。轉(zhuǎn)基因玉米在飼料中的最大摻入量為73.3%,以此作為高劑量,中、低劑量的玉米摻入量分別設(shè)為36.65%和18.33%。以上飼料由北京華阜康生物科技股份有限公司制備。配制好的飼料輻照滅菌后真空包裝保存供實(shí)驗(yàn)使用。
1.4 實(shí)驗(yàn)方法
選用斷乳SD大鼠140只,隨機(jī)分為7組,即DBN9978低、中、高劑量組(以下簡(jiǎn)稱轉(zhuǎn)高、轉(zhuǎn)中、轉(zhuǎn)低),親本玉米DBN567低、中、高劑量組(以下簡(jiǎn)稱親高、親中、親低),AIN-93G(以下簡(jiǎn)稱對(duì)照)。每組20只,雌雄各半。動(dòng)物2只/籠喂養(yǎng),自由飲食,每周稱量1次大鼠體重,每周記錄1次給食量和剩食量,連續(xù)觀察90d。各組于實(shí)驗(yàn)中期和實(shí)驗(yàn)結(jié)束分別采血測(cè)各項(xiàng)血液學(xué)、血生化指標(biāo),實(shí)驗(yàn)結(jié)束后摘取動(dòng)物臟器進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。
1.5 觀察指標(biāo)
1.5.1 大鼠生長(zhǎng)發(fā)育情況 每天觀察大鼠的一般表現(xiàn)、外觀、毒性表現(xiàn)及死亡情況,每周稱量1次大鼠體重,每周記錄1次給食量和剩食量,計(jì)算食物利用率。
1.5.2 血液學(xué)檢查 試驗(yàn)中期和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)進(jìn)行血液學(xué)指標(biāo)測(cè)定。測(cè)定指標(biāo)為白細(xì)胞計(jì)數(shù)WBC及其分類(Neu%、Lym%、Mon%)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)RBC、血紅蛋白HGB、血小板計(jì)數(shù)PLT。試驗(yàn)中期大鼠眼內(nèi)眥取血,試驗(yàn)結(jié)束大鼠戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,腹主動(dòng)脈采血。
1.5.3 臨床生化學(xué)檢查 試驗(yàn)中期和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)進(jìn)行血液生化指標(biāo)測(cè)定,空腹采血。測(cè)定指標(biāo)為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、乳酸脫氫酶(LDH)、尿素氮(UREA)、肌酐(CREA)、血糖(GLU)、血清白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、總蛋白(TP)、總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)。
1.5.4 臟體比 實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死動(dòng)物取肝、腎、腎上腺、脾、胸腺、心臟、睪丸稱重,計(jì)算相應(yīng)的臟體比。
1.5.5 病理組織學(xué) 解剖觀察及組織病理學(xué)檢查。
1.6 統(tǒng)計(jì)方法
轉(zhuǎn)基因玉米DBN9978低、中、高劑量組與相應(yīng)劑量的轉(zhuǎn)化受體DBN567組和AIN-93G對(duì)照組比較,采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),方差齊時(shí)采用Bonferroni檢驗(yàn),方差不齊采用Games-Howell檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 生長(zhǎng)狀況及食物利用率
實(shí)驗(yàn)期間對(duì)照組中有1只雌性動(dòng)物在第9w意外死亡,大體解剖臟器未見(jiàn)異常,該組其他動(dòng)物以及其余各組動(dòng)物在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間活動(dòng)、生長(zhǎng)正常,被毛濃密有光澤。大鼠體重(表1)。雄性、雌性大鼠轉(zhuǎn)基因各劑量組與相應(yīng)劑量的親本組相比較,體重未見(jiàn)明顯差異。雄性轉(zhuǎn)低組總進(jìn)食量高于親低組,其余各劑量組雌、雄動(dòng)物的總增重、總進(jìn)食量以及總食物利用率未見(jiàn)顯著差異(表2)。與對(duì)照組相比,雄性大鼠轉(zhuǎn)基因三個(gè)劑量組和親中組的總增重高于對(duì)照組。雄性大鼠轉(zhuǎn)基因3個(gè)劑量組和親本對(duì)照3個(gè)劑量組總進(jìn)食量均高于對(duì)照組;雌性大鼠轉(zhuǎn)基因3個(gè)劑量組和親中組總進(jìn)食量均高于對(duì)照組,雌、雄大鼠總食物利用率在各玉米摻飼劑量組和對(duì)照組之間未見(jiàn)顯著差異(表2)。
表1 受試物90d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠體重的影響
注:a與對(duì)照組比較,P<0.05.
2.2 血液學(xué)指標(biāo)
實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?,親高組1只雌性動(dòng)物樣本出現(xiàn)凝血,對(duì)照組中1只雌性動(dòng)物在第9周意外死亡,檢測(cè)結(jié)果未納入數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。由表3~4可見(jiàn),試驗(yàn)中期與試驗(yàn)?zāi)┢谟袀€(gè)別指標(biāo)出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但均在該品系動(dòng)物正常值范圍內(nèi)[9-10]。其余各組各指標(biāo)與對(duì)照組相比,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),轉(zhuǎn)基因其余各組各項(xiàng)指標(biāo)與其相應(yīng)劑量的親本對(duì)照組比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
2.3 血生化指標(biāo)
由表5~6可見(jiàn),試驗(yàn)中期與試驗(yàn)?zāi)┢谵D(zhuǎn)基因組和親本組有個(gè)別指標(biāo)與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但無(wú)劑量-反應(yīng)關(guān)系且變化均在該品系動(dòng)物正常值范圍內(nèi)[7-8,10]。
表2 受試物90d喂養(yǎng)試驗(yàn)對(duì)大鼠總增重、總進(jìn)食量和總食物利用率的影響±SD)
注:a與對(duì)照組比較,P<0.05;b與相應(yīng)劑量的親本對(duì)照組比較,P<0.05。
表3 受試物90d喂養(yǎng)試驗(yàn)對(duì)大鼠中期血液學(xué)的影響±SD)
注:a與對(duì)照組比較,P<0.05;b與相應(yīng)劑量的親本對(duì)照組比較,P<0.05。
表4 受試物90d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠末期血液學(xué)的影響±SD)
注:a表示與對(duì)照組比較,P<0.05;b表示與相應(yīng)劑量的親本對(duì)照組比較,P<0.05。
表5 受試物90d喂養(yǎng)試驗(yàn)對(duì)大鼠中期血生化指標(biāo)的影響±SD)
注:a與對(duì)照組比較,P<0.05;b與相應(yīng)劑量的親本對(duì)照組比較,P<0.05。
表6 受試物90d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠末期血生化指標(biāo)的影響±SD)
(續(xù))
注:a與對(duì)照組比較,P<0.05;b與相應(yīng)劑量的親本對(duì)照組比較,P<0.05。
2.4 大鼠臟體比
試驗(yàn)?zāi)┢趯?duì)個(gè)劑量組的臟器重量稱重,并計(jì)算臟體比。雄性大鼠親高、親中、親低、轉(zhuǎn)高及轉(zhuǎn)中組動(dòng)物的腎臟臟體比顯著降低(P<0.05);雌性大鼠親低、轉(zhuǎn)中及轉(zhuǎn)低組動(dòng)物的肝臟臟體比顯著降低(P<0.05),轉(zhuǎn)高及轉(zhuǎn)低組動(dòng)物的腎臟臟體比顯著降低(P<0.05)。其余各組大鼠臟體比與對(duì)照組相比,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。轉(zhuǎn)基因各劑量組臟體比與相應(yīng)親本組相比,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表7)。
表7 受試物90d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠臟體比的影響
注:a與對(duì)照組比較,P<0.05
2.5 大體病理及組織學(xué)檢查
各組大鼠外觀、皮膚未見(jiàn)異常,胸、腹腔膜未見(jiàn)出血點(diǎn)、積液,主要臟器正常,未見(jiàn)明顯病理病變。對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米、親本玉米以及AIN93G對(duì)照組SD大鼠腦、心、肺、腎、肝、腎上腺、脾、胃腸(十二指腸、空腸和回腸)、胸腺、甲狀腺、睪丸、附睪、前列腺、卵巢及子宮進(jìn)行了病理組織學(xué)檢查,未見(jiàn)與受試物有關(guān)的特異性毒性病理改變。
1986年首批轉(zhuǎn)基因植物被批準(zhǔn)進(jìn)入田間試驗(yàn),至今國(guó)際上已有30個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)數(shù)千例轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)入田間試驗(yàn),涉及的植物種類有40多種,全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積達(dá)4 420萬(wàn)hm2。1994年轉(zhuǎn)基因番茄在美國(guó)批準(zhǔn)上市,2015年1月13日,歐洲議會(huì)全體會(huì)議通過(guò)一項(xiàng)法令,允許歐盟成員國(guó)根據(jù)各自情況選擇批準(zhǔn)、禁止或限制在本國(guó)種植轉(zhuǎn)基因作物[4]。在轉(zhuǎn)基因作物給人們帶來(lái)驚喜和美好憧憬的同時(shí),其食用安全性也引起世人關(guān)注,其焦點(diǎn)問(wèn)題主要是轉(zhuǎn)基因作物是否會(huì)危害人類和動(dòng)物的健康及破壞生態(tài)環(huán)境。
目前,世界各國(guó)普遍把大鼠90d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)作為評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因全食品毒性的主要內(nèi)容,用以觀察動(dòng)物生長(zhǎng)過(guò)程中的亞慢性毒性表現(xiàn)。1993年,OECD提出了“實(shí)質(zhì)等同性”的概念[5],目前67個(gè)國(guó)家把這一原則作為評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因食品安全性的最有效的途徑和最基本原則[6].本實(shí)驗(yàn)正是依照此原則,參照美國(guó)營(yíng)養(yǎng)研究所的AIN-93G配方,在保證營(yíng)養(yǎng)平衡的基礎(chǔ)上以蛋白質(zhì)最大摻入為原則計(jì)算轉(zhuǎn)基因玉米能摻入飼料的最大比例,設(shè)置了兩個(gè)對(duì)照組,親本玉米組和AIN93 對(duì)照組,前者用來(lái)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入的外源基因可能帶來(lái)的影響,后者用來(lái)排除玉米自身成分對(duì)實(shí)驗(yàn)可能造成的影響。
本研究以摻入比例為18.83%、36.65%、73.3%的轉(zhuǎn)基因玉米DBN9978及其親本玉米摻入飼料給予大鼠90d,結(jié)果發(fā)現(xiàn),雄性、雌性大鼠轉(zhuǎn)基因玉米各劑量組與相應(yīng)劑量的親本對(duì)照玉米組相比較,體重、體重增長(zhǎng)、周攝食量、對(duì)周食物利用度雖有個(gè)別統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著性差異,但在歷史對(duì)照數(shù)據(jù)范圍內(nèi),且總體重增加、總進(jìn)食量和總食物利用率未見(jiàn)顯著差異;此外轉(zhuǎn)基因玉米各劑量組與其相應(yīng)劑量的親本對(duì)照相比較,臟器重量和臟體比均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)中期和末期各項(xiàng)血液學(xué)指標(biāo)和血生化指標(biāo)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因玉米各劑量組與相應(yīng)劑量的親本對(duì)照玉米組相比較,有個(gè)別指標(biāo)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但大部分有差異的指標(biāo)沒(méi)有同時(shí)與兩個(gè)對(duì)照組都存在差異或沒(méi)有同時(shí)在雌雄大鼠中存在差異,且基本上都在文獻(xiàn)報(bào)道的正常范圍之內(nèi)[7-10],且未出現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。實(shí)驗(yàn)?zāi)┢趯?duì)7組SD大鼠腦、心、肺、腎、肝、腎上腺、脾、胃腸(十二指腸、空腸和回腸)、胸腺、甲狀腺、睪丸、附睪、前列腺、卵巢及子宮進(jìn)行了病理組織學(xué)檢查,未見(jiàn)與受試物有關(guān)的特異性毒性病理改變。此外,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中會(huì)受轉(zhuǎn)基因食品特性外的一些不確定因素的影響[11],因此認(rèn)為,這些差異有可能與大鼠個(gè)體差異有關(guān),而以不應(yīng)認(rèn)為指標(biāo)升高是因飼喂轉(zhuǎn)基因飼料造成的。
綜上所述,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果未發(fā)現(xiàn)具有對(duì)大鼠有生物學(xué)意義的亞慢性毒性作用。本研究還將開(kāi)展急性毒性實(shí)驗(yàn)、多代繁殖實(shí)驗(yàn)、營(yíng)養(yǎng)功效等方面的研究,更好地評(píng)價(jià)該轉(zhuǎn)基因玉米的食用安全性?!?/p>
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(責(zé)任編輯 李婷婷)
Subchronic Toxicity Test of Genetic Modified Corn with DBN9978 Gene in Rats
WANG Rui,HU Yi-chun,LI Min,WU Jing-huan,YANG Xiao-guang,MAO De-qian
(National Institute for Nutrition andHealth,Chinese Center for Disease Control and Prevention/Key Laboratory of Trace Element Nutrition,National Health and Family Planning Commission,Beijing 100050,China)
ObjectiveThe subchronic toxicity of feed withDBN9978 genetic modified corn was tested in rats.Method A total of 140 SD rats were randomly divided into 7 groups with 20 rats each group including three transgenic corn groups with different doses (73.3%,36.65%,18.33%),three containing non-transgenic corn (72.7%,35.35%,18.18%),1 routine Basal diet control group. Animals 2/cage feeding,free to eat drinking water,continuous observation of 90 days. Observation of body weight,food intake,the blood routine test,blood biochemistry test (at the 45 th day and the 90 th day of the experiment),organ weight and organ pathological examination (at the end of the 90 th day)were conducted. Result The weight of the animals in each dose group showed an increasing trend. The weight and weight gain,weekly food intake,total food utilization rate and blood and blood biochemical indexes of the transgenic corn groups,containing non-transgenic corn group and the feeding control group,The main organ coefficient and histopathological examination were found no significant changes in biological significance.Conclusion There were no enough evidences to confirm GM corn withDBN9978 genes has subchronic toxic effects on rat.
genetically modified corn;DBN9978 gene;subchronic toxicity
國(guó)家科技重大專項(xiàng)——轉(zhuǎn)基因生物新品種培育“抗蟲(chóng)抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米食品安全評(píng)價(jià)研究”。
王 睿(1984— ),女,碩士,助理研究員。研究方向:營(yíng)養(yǎng)素需要量。
毛德倩(1974— ),男,碩士,副研究員,研究方向:營(yíng)養(yǎng)學(xué)。