孫旭 吳洋 李興東 劉云云 馬曉昱 姚惠鳳 陳瑤

結(jié)腸樂灌腸液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

孫旭 吳洋 李興東 劉云云 馬曉昱 姚惠鳳 陳瑤

目的 建立結(jié)腸樂灌腸液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 采用TLC法對結(jié)腸樂灌腸液處方中的藥材成分黃芩、黃連進(jìn)行定性鑒別，并用高效液相色譜法(HPLC)對結(jié)腸樂灌腸液中的有效成分鹽酸小檗堿的含量進(jìn)行測定。結(jié)果 結(jié)腸樂灌腸液中黃芩、黃連的供試品薄層色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點；鹽酸小檗堿含量在10.84～173.40 μg/mL，范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r＝0.999 8)，平均回收率97.71%(n＝6，RSD＝0.55%)。結(jié)論 該方法簡便快捷，結(jié)果準(zhǔn)確，可作為該制劑的質(zhì)量控制方法。

結(jié)腸樂灌腸液；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；TLC；高效液相色譜法；鹽酸小檗堿

結(jié)腸樂灌腸液是解放軍第150醫(yī)院根據(jù)多年臨床應(yīng)用研制的純中藥制劑，具有清熱燥濕，瀉火解毒，收斂止血，止痛，滌蕩滯熱，抗炎的功效。用于治療潰瘍性結(jié)腸炎、慢性結(jié)腸炎，特別對遠(yuǎn)端性結(jié)腸炎效果最佳。原有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有TLC鑒別。為更好的控制結(jié)腸樂灌腸液的質(zhì)量，確保藥品安全有效可控，建立了結(jié)腸樂灌腸液的定性定量方法。我們采用TLC法對處方中黃芩、黃連等進(jìn)行了定性鑒別，采用HPLC法建立了主要指標(biāo)成分鹽酸小檗堿的含量測定方法，可為該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評價提供較為充分的科研依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 薄層層析硅膠G254(青島海洋化工集團(tuán))；ZF-6型三用紫外分析儀；METTLER AE240電子天平；Agilent 1100高效液相色譜儀；AS-B超聲波清洗儀；HG-B電熱恒溫干燥箱。

1.2 試藥 乙腈為色譜純；對照品鹽酸小檗堿(批號110713-201212，中國食品藥品檢定所，純度：86.7%)，對照藥材黃芩(批號120955-201309，中國食品藥品鑒定所)、黃連(批號120913-201310，中國食品藥品鑒定所)；結(jié)腸樂灌腸液(批號140225，140508，140731)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芩的TLC鑒別[1-3]取本品30 mL，蒸干，殘渣加乙酸乙酯-甲醇(3∶1)的混合溶液30 mL，加熱回流30min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL，超聲處理30min使溶解，取上清液作為供試品溶液。另取黃芩對照藥材0.5 g，加乙酸乙酯-甲醇(3∶1)的混合溶液30 mL，同法處理，殘渣加甲醇3 mL使溶解，作為對照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2015版四部通則0502)，精密吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點于同一高效硅膠GF254薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10∶3∶1∶2)為展開劑，預(yù)飽和30min，展開、取出、晾干，置紫外燈(254 nm)下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑 點(圖1)。

2.2 黃連的TLC鑒別[1-4]取本品10 mL，蒸干，殘渣加甲醇10 mL，超聲處理30min，過濾，濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液。另取黃連對照藥材0.5 g，加甲醇10 mL，同法處理作為對照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2015版四部通則0502)試驗，精密取上述溶液各5～10 μL，分別點于同一高效硅膠GF254薄層板上，以甲苯-醋酸乙酯-甲醇-異丙醇-水(6∶3∶1.5∶1.5∶0.3)為展開劑 (同時在展開箱中放入一小燒杯與展開劑等體積的濃氨試液飽和15min)，展開，取出，晾干，置紫外燈(254 nm)下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的顏色斑點(圖2)。

2.3 鹽酸小檗堿的含量測定

2.3.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗[2]以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-0.1%磷酸溶液(45∶55)(每100 mL溶液加十二烷基磺酸鈉0.1 g)為流動相；柱溫30℃，檢測波長265 nm。理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計算應(yīng)不低于2 000。分別吸取對照品溶液，供試品溶液和陰性對照溶液，照色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰。結(jié)果顯示在鹽酸小檗堿對照品同一保留時間位置上，供試品溶液出現(xiàn)明顯的色譜峰，而陰性對照溶液無感染。HPLC色譜圖(圖1～2)。

圖1 黃芩的TLC圖譜

圖2 黃連的TLC圖譜

2.3.2 對照品溶液的制備 取鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含鹽酸小檗堿1.084 mg(對照品儲備液)，精密量取1 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 精密量取結(jié)腸樂灌腸液10 mL，置具塞錐形瓶中，精密加入鹽酸-甲醇(1∶100)混合溶液20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，蒸干，殘渣用甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，濾過，即得。

2.3.4 陰性對照溶液的制備 取缺制黃連、黃柏的樣品，按“2.3.3”項下方法制備成陰性對照品溶液(圖3)。

圖3 結(jié)腸樂灌腸液的HPLC圖譜

2.3.5 線性關(guān)系 精密量取鹽酸小檗堿對照品貯備液1 mL，2 mL，4 mL，8 mL，16 mL，分別置于100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即為不同濃度的對照溶液。含鹽酸小檗堿分別為10.84、21.68、43.35、86.70、173.40 μg/mL，按2.3.1項下色譜條件分析，以濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)峰面積值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得鹽酸小檗堿的回歸方程，Y＝99.02X＋68.70，R2＝0.999 8。在10.84～173.40 μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.6 精密度試驗 精密吸取對照品溶液，按2.3.1項下條件連續(xù)進(jìn)樣6次進(jìn)行測定，記錄鹽酸小檗堿峰面積的RSD為0.26%，表明儀器具有良好的精密度。

2.3.7 重現(xiàn)性試驗 取同一批號的結(jié)腸樂灌腸液(批號140225)6份，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行分析。結(jié)果鹽酸小檗堿的平均含量為0.214 mg/mL，RSD(n＝6)為0.62%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗 取結(jié)腸樂灌腸液(批號140225)，按“2.3.3”項下方法配制供試品溶液，分別于0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h進(jìn)樣，按上述色譜條件分別測定，以峰面積計算，結(jié)果鹽酸小檗堿的RSD為0.59%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.3.9 加樣回收率試驗(表1) 取已知含量的結(jié)腸樂灌腸液樣品(批號140225)6份，加入鹽酸小檗堿對照品貯備液2 mL，按“2.3.3”項下制備供試品溶液，依上述色譜條件進(jìn)樣分析，計算回收率。

2.3.10 樣品測定 取結(jié)腸樂灌腸液樣品3批(批號140225，140508，140731)，按“2.3.3”方法制備供試品溶液，按上述色譜條件對鹽酸小檗堿的含量進(jìn)行測定，結(jié)果3批樣品中鹽酸小檗堿的含量分別為0.214 mg/mL，0.162 mg/mL，和0.168 mg/mL。

表1 加樣回收率試驗測定結(jié)果

3 討論

3.1 TLC鑒別 通過實驗，制定了黃芩和黃連的TLC鑒別方法，該方法特征斑點明顯色譜分離清晰，可作為結(jié)腸樂灌腸液中黃芩和黃連的專屬性鑒別。

3.2 波長及流動相的選擇 本制劑以黃連為君藥，黃柏為臣藥，而鹽酸小檗堿為黃連和黃柏所共有的主要指標(biāo)成分，因此將鹽酸小檗堿的含量作為該制劑質(zhì)量控制的指標(biāo)。取供試品溶液，以水為空白對照，于200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，鹽酸小檗堿的在波長為230 nm，265 nm，340～350 nm處均有較強吸收峰，文獻(xiàn)報道其檢測波長有采用265 nm，亦有277 nm，345 nm和350 nm[5-10]，其目的都是減小雜質(zhì)峰的干擾，增加檢測的準(zhǔn)確性。本文測定中采用265 nm雜質(zhì)干擾小，故檢測波長確定為265 nm。對多種流動相進(jìn)行了考察，根據(jù)樣品的分離度、保留時間等因素，確定了最佳流動相為乙腈－0.1%磷酸溶液(45∶55)(每100 mL溶液加十二烷基磺酸鈉0.1 g)。

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典2015年版(一部)[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：301，304-305.

[2]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典2015年版(四部)[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：57-61．

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[5]吳永芹，秦婷，秦峰，等.HPLC法測定葛根芩連片中鹽酸小檗堿的含量[J].中國藥事，2010，24(4)：354-357.

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Objective To establish the quality standards for Jiechangle Enema.Methods TLC was adopted for qualitative identification of Scutellaria baicalensis and Coptis chinensis in the prescription of Jiechangle Enema，and high performance liquid chromatography(HPLC)was adopted to measure the content of Berberine hydrochloride，which was the effective constituent of Jiechangle Enema.Results The lamina chromatogram of test samples of Scutellaria baicalensis and Coptis chinensis in Jiechangle Enema showed spots with the same color as those corresponding spots in the control chromatogram；the content of Berberine hydrochloride was 10.84 ～173.40 μg/mL，with good range linear relation(r＝0.999 8).The average recovery rate of Berberine hydrochloride was 97.71%(n＝6，RSD＝0.55%).Conclusion The established method is simple and convenient with accurate results，which can be used effectively for the quality control of this preparation.

Jiechangle Enema；Quality standard；TLC；High performance liquid chromatography(HPLC)；Berberine hydrochloride

2016-10-09)

軍隊醫(yī)療機構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高科研專項課題(14ZJZ01-1)

1005-619X(2017)04-0351-03

10.13517/j.cnki.ccm.2017.04.006

250022 濟(jì)南軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗所(孫旭，吳洋，李興東，劉云云，馬曉昱，陳瑤)；471000 解放軍第150醫(yī)院(姚惠鳳)

陳瑤