龐真貞 王 良 高 磊 劉欽贊 李 曄

人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞與牙髓干細(xì)胞生物學(xué)功能差異研究

龐真貞 王 良 高 磊 劉欽贊 李 曄

目的：從不同角度對人乳牙牙髓干細(xì)胞(SHED)與恒牙牙髓干細(xì)胞(DPSCs)的生物學(xué)功能進(jìn)行對比研究，探討對骨改建的影響。方法：有限稀釋法分離培養(yǎng)SHED和DPSCs，成脂誘導(dǎo)14d進(jìn)行油紅O染色、成骨誘導(dǎo)21d進(jìn)行茜素紅染色；ELISA法檢測IL-6、TNF-α分泌水平；兩種干細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)及成骨誘導(dǎo)7d后進(jìn)行ALP染色、實(shí)時定量PCR檢測Runx2、RANKL、OPG基因表達(dá)。結(jié)果：分離獲得的SHED和DPSCs具有成骨、成脂分化能力，符合干細(xì)胞特點(diǎn)。SHED的炎性細(xì)胞因子IL-6、TNF-α的表達(dá)均高于DPSCs(P<0.01)；成骨誘導(dǎo)7d后SHED的ALP活性強(qiáng)于DPSCs(P<0.05)；且經(jīng)成骨誘導(dǎo)后兩種干細(xì)胞均表達(dá)Runx2、OPG和RANKL，但SHED的表達(dá)水平明顯高于DPSCs(P<0.05)。結(jié)論：SHED與DPSCs相比不僅具有較強(qiáng)的成骨分化能力，而且還兼具較強(qiáng)的破骨能力，提示SHED可能參與骨改建調(diào)控機(jī)制。

人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞；牙髓干細(xì)胞；TL-6；Runx2

干細(xì)胞是指有克隆形成能力的未分化細(xì)胞，具有自我更新和多向分化的特點(diǎn)。目前，用于組織修復(fù)和再生的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells， MSC)多采用成體多能干細(xì)胞[1]。近年來，牙源性干細(xì)胞逐漸成為學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)，Gronthos[2]等于2000年成功分離了人恒牙牙髓干細(xì)胞(Dental Pulp Stem Cells，DPSCs)，隨后，M iura[3]等從正常脫落的兒童乳牙中分離得到一種間充質(zhì)干細(xì)胞[4]，并命名為人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞(stem cells from human ex foliated deciduous teeth，SHED)。二者皆具有成體干細(xì)胞的特性，細(xì)胞表面表達(dá)多種間充質(zhì)干細(xì)胞特異性標(biāo)記物且具有較強(qiáng)的增殖能力和多向分化潛能[5]。乳牙與恒牙在來源和成牙特性上相近，然而，在結(jié)構(gòu)和組織學(xué)上有一定差異，近期有研究證實(shí)與DPSCs相比SHED增殖能力強(qiáng)，倍增時間短，且具有較高克隆形成能力及成骨分化能力[6]，但具體作用機(jī)制不清。本研究通過對比SHED和DPSCs的功能差異關(guān)鍵因子的分泌表達(dá)，為探討SHED可能參與骨改建調(diào)控機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1.材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、青鏈霉素、鏈霉素(Gibco，美國)、0.25%胰蛋白酶；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas，美國)；TRIzol Reagent(Life Technologies，NY)；超凈工作臺(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，中國)；實(shí)時定量PCR儀(Applied Biosystems 7500，美國Life Technologies公司)；IL-6、TNF-αElisa試劑盒(上海通蔚生)；ALP試劑盒(上海碧云天)。

1.2 樣本收集 收集2014年12月至2015年2月保定市第一中心醫(yī)院口腔科5-7歲兒童正常乳恒牙替換期自然脫落乳牙樣本。脫落乳牙無明顯齲壞，無牙髓病變及根尖周炎，牙根吸收達(dá)牙根1/2-2/3，且所有納入個體無系統(tǒng)疾病。同期于口腔外科收集18-25歲青年因正畸治療拔除的前磨牙或因埋伏阻生而拔除的第三磨牙樣本。所取得恒牙均無明顯齲壞，無牙髓病變及根尖周病變，且所有納入個體無系統(tǒng)疾病。本研究經(jīng)保定市第一中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，取得患者知情同意。

1.3 SHED和DPSCs的分離、培養(yǎng) 充分消毒乳、恒牙牙體周圍組織后拔牙，立即放入預(yù)冷含高倍雙抗α-MEM培養(yǎng)基中，2小時內(nèi)原代取材。參照Gronthos[2]等的方法，在超凈臺中，PBS液反復(fù)沖洗，乳牙直接用拔髓針拔取牙髓組織；而恒牙則通過牙鉆從牙冠打開牙髓腔，再用拔髓針拔取牙髓，用含有青、鏈霉素雙抗的0.1m L/L PBS反復(fù)沖洗，剪碎，約1mm×1mm×1mm的組織塊。4%Ⅰ型膠原酶消化45m in，加入含150m L/L胎牛血清和青、鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液終止消化，1000r/m in離心5m in，棄上清，加入含20% FBS的α-MEM培養(yǎng)液接種于35mm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)2d半量換液，之后每2-3d半量換液，細(xì)胞達(dá)到80%-90%匯合時，用胰酶消化傳代，按1∶3比例傳代。采用有限稀釋法對SHED進(jìn)行克隆分離：將第一代處于對數(shù)期的SHED計(jì)數(shù)，有限稀釋至密度為約10個/m L，以100μl/孔接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24h后，挑出單個細(xì)胞的孔，繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3d半量換液(α-MEM，15%FBS)；待單克隆面積至孔底60%以上時，消化法移至24孔板、6孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)，逐步擴(kuò)增至107數(shù)量級，以P3代用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.4 成脂成骨分化 取第3代的SHED和DPSCs，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，以1×105個/孔的密度接種于6孔板中，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組3孔。待細(xì)胞密度生長至60%-70%將細(xì)胞進(jìn)行成脂、成骨誘導(dǎo)。成脂誘導(dǎo)：用含有地塞米松1μmol/L，吲哚美辛200μmol/L、IBMX 0.5μmol/L，胰島素10mg/L、胎牛血清100mg/L的DMEM誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)14d后，鏡下觀察胞漿內(nèi)出現(xiàn)圓形空泡后，棄成脂誘導(dǎo)液，PBS漂洗3遍后將細(xì)胞用40g/L的多聚甲醛室溫固定30 m in。PBS漂洗3遍，置油紅O工作液中浸15-20 m in，蒸餾水沖洗5遍，顯微鏡下觀察。成骨分化：用含有地塞米松10μmol/L，vitC 50μmol/L，β磷酸甘油鈉10mmol/L、胎牛血清100 m L/L的DMEM誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)，每周換液3次，21d后，40g/L的多聚甲醛固定1.5h，PBS漂洗3遍，加入茜素紅37℃染色30-45m in，PBS沖洗后鏡下觀察。

1.5 細(xì)胞因子檢測 將P3代SHED及DPSCs按1×105個/m l的密度接種到24孔板中，設(shè)置4個副孔。待細(xì)胞貼壁后，棄原培養(yǎng)液，PBS沖洗3遍，將SHED及DPSCs加入常規(guī)培養(yǎng)液(含15% FBS、100μmol/L抗壞血酸、0.292m g/m l谷氨酰胺、100U/m l青霉素/鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基)，24h后收集各個培養(yǎng)孔內(nèi)的培養(yǎng)液，離心后取上清液進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA)。 按 照 IL-6、TNF-α ELISA檢測試劑盒說明建立標(biāo)準(zhǔn)曲線后每孔加入待測樣品100μl，洗板，每孔加入一抗工作液50μl，反應(yīng)板充分混勻后置于37℃60m in，洗板后加入底物液100μl，置于37℃，避光保存10m in，最后每孔加入50μl終止液混勻，在450nm處測吸光值。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。

1.6 堿性磷酸酶染色 第3代SHED和DPSCs以1×104個/孔的密度接種于12孔板中并隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組3孔。正常及成骨誘導(dǎo)，每3d換液培養(yǎng)至7d，棄原培養(yǎng)液，按照堿性磷酸酶試劑盒說明書配制染液，將細(xì)胞用PBS洗3次，加4%多聚甲醛固定液，固定30m in。PBS洗3次，加ALP染液37℃孵育45m in。蒸餾水輕輕沖洗，洗去染液，照相。顯微鏡下觀察染色結(jié)果，藍(lán)色為陽性。

1.7 實(shí)時定量PCR 將P3代SHED和DPSCs低密度接種T25培養(yǎng)瓶，常規(guī)培養(yǎng)條件及成骨誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)7d，后用Trizol裂解并提取成骨總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYBR Green試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR檢測，目的基因及管家基因在不同的反應(yīng)管中進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系20μl。反應(yīng)條件：95℃變性 20m in，95℃ 30s，60℃1m in，40個循環(huán)。采用實(shí)時熒光定量PCR儀監(jiān)測記錄數(shù)據(jù)，結(jié)果根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，軟件自動計(jì)算后得出。試驗(yàn)重復(fù)3次。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)處理，兩組數(shù)據(jù)間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。設(shè)P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 SHED和DPSCs均具有成脂、成骨分化能力 經(jīng)過低密度接種培養(yǎng)獲取的SHED和DPSCs具有干細(xì)胞的基本形態(tài)，細(xì)胞均成長梭形、胞漿均勻、核圓、核仁清晰，呈旋渦狀生長。SHED及DPSCs向成骨方向誘導(dǎo)過程中，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，突觸消失，胞體增大，形態(tài)近方形或多邊形，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21d后茜素紅染色陽性，可見礦化結(jié)節(jié)。SHED及DPSCs成脂誘導(dǎo)14d后，胞漿內(nèi)出現(xiàn)圓形空泡，并逐漸融合，油紅O染色可見呈紅色的脂滴顆粒(圖1)。這說明我們所分離培養(yǎng)的細(xì)胞符合SHED及DPSCs特性，為下步實(shí)驗(yàn)打下了基礎(chǔ)。

圖1 SHED和DPSCs成脂、成骨誘導(dǎo)分化(200倍)

2.2 SHED和DPSCs TNF-α、IL-6分泌量及基因表達(dá)水平檢測 TNF-α、IL-6在干細(xì)胞參與的骨改建過程中發(fā)揮一定作用，本研究首先采用Elisa方法檢測SHED及DPSCs TNF-α、IL-6分泌量，結(jié)果顯示常規(guī)培養(yǎng)條件下SHED TNF-α、IL-6分泌量顯著高于DPSCs(P<0.01，圖2A)。實(shí)時定量PCR對TNF-α、IL-6在兩組細(xì)胞中表達(dá)的檢測結(jié)果與Elisa結(jié)果一致，SHED TNF-α、IL-6分泌量顯著高于DPSCs，其中SHED TNFα的表達(dá)水平是DPSCs的3.11倍(P<0.01，圖2B)。

圖2 A：ELISA檢測細(xì)胞因子分泌水平；B：SHED和DPSCs常規(guī)培養(yǎng)3天后提取RNA檢測炎癥相關(guān)基因表達(dá)

2.3 SHED和DPSCs成骨誘導(dǎo)7天后ALP染色 將SHED和DPSCs成骨誘導(dǎo)7天后進(jìn)行ALP染色，大體觀察見SHED和DPSCs成骨誘導(dǎo)后ALP染色較常規(guī)對照組增強(qiáng)。倒置顯微鏡下觀察，多數(shù)細(xì)胞質(zhì)有藍(lán)紫色顆粒沉淀，且SHED染色較DPSCs深，可見SHED比DPSCs ALP陽性表達(dá)率高(圖3)。

圖3 SHED和DPSCs成骨誘導(dǎo)7d后ALP染色(100倍)

2.4 SHED和DPSCs成骨誘導(dǎo)7d后關(guān)鍵基因表達(dá)檢測 實(shí)時定量PCR檢測結(jié)果顯示，SHED和DPSCs均表達(dá)成骨早期關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子基因Runx2。常規(guī)培養(yǎng)條件下SHED Runx2表達(dá)水平顯著高于DPSCs，成骨誘導(dǎo)7d后兩組細(xì)胞Runx2表達(dá)水平均顯著升高(P＜0.05)，SHED成骨誘導(dǎo)組表達(dá)值最高(圖4A)。常規(guī)條件下SHED和DPSCs OPG表達(dá)無顯著差異，成骨誘導(dǎo)后均顯著上調(diào)，成骨誘導(dǎo)后SHED OPG表達(dá)水平顯著高于DPSCs成骨誘導(dǎo)組(P＜0.05，圖4B)。在RANKL表達(dá)上，成骨誘導(dǎo)7d后DPSCs較對SHED組降低，SHED增高4.37倍(P<0.05，圖4C)。

圖4 SHED和DPSCs成骨、破骨相關(guān)基因表達(dá)

3.討論

乳牙生理性根吸收是兒童乳恒牙替換期的一種自然生理現(xiàn)象，關(guān)于機(jī)制乳牙生理性根吸收，有學(xué)者指出可能與炎癥環(huán)境、繼承恒牙萌出時的壓力或咬合創(chuàng)傷有關(guān)，但都尚處于探索階段。目前對根吸收的研究多傾向于乳牙自身相關(guān)組織，因此乳牙牙髓干細(xì)胞是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

有研究表明乳牙生理性根吸收的過程與骨重塑的過程相似。本實(shí)驗(yàn)選用Runx2和OPG兩種成骨向分化相關(guān)特異性基因視作向成骨細(xì)胞分化的檢測指標(biāo)[7]，結(jié)果顯示，成骨誘導(dǎo)后，SHED和DPSCs的成骨相關(guān)基因Runx2和OPG表達(dá)量均較正常培養(yǎng)組有所提高，且SHED的Runx2和OPG表達(dá)增加水平均明顯高于DPSCs，該結(jié)果也再次驗(yàn)證SHED較DPSCs具有更強(qiáng)成骨分化能力[8-9]。

TNF-α為TNF家族重要成員之一，是目前公認(rèn)的最重要的一個內(nèi)源性誘生型促炎細(xì)胞因子，現(xiàn)有研究結(jié)果顯示炎性因子能夠影響成骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)、細(xì)胞外基質(zhì)的分泌以及成骨細(xì)胞的凋亡，且對破骨細(xì)胞的形成和活性具有重要的調(diào)節(jié)作用[10、11]。有實(shí)驗(yàn)表明，TNF也可以刺激基質(zhì)成骨樣細(xì)胞合成IL-6、PTH rp以及RANKL表達(dá)促進(jìn)破骨細(xì)胞發(fā)育。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示常規(guī)培養(yǎng)的DPSCs炎癥因子TNF-α和IL-6的分泌量明顯小于SHED,且在炎癥相關(guān)基因的表達(dá)倍數(shù)上更是小于 SHED。在骨的重塑過程中涉及經(jīng)典的RANK/RANKL/OPG(核因子κB受體活化劑/ RANK配體/骨保護(hù)素)受體配體系統(tǒng)，在骨質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用，且OPG和RANKL分別是破骨發(fā)生的抑制因子和促進(jìn)因子，RANKL與OPG者的比值在破骨細(xì)胞分化成熟中有重要作用[12]。RANK作為RANKL的受體，當(dāng)RANKL與RANK結(jié)合后，啟動傳遞破骨細(xì)胞分化信號，使破骨細(xì)胞前體細(xì)胞開始增殖、分化以及細(xì)胞融合，形成破骨細(xì)胞，從而促進(jìn)骨質(zhì)的吸收；而當(dāng)RANKL的另一種受體OPG與RANKL結(jié)合后，會抑制破骨細(xì)胞的功能，也會抑制破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的進(jìn)一步發(fā)育，從而抑制骨質(zhì)的吸收。在本實(shí)驗(yàn)中，SHED和DPSCs均表達(dá)RANKL和OPG，但SHED在破骨相關(guān)基因RANKL的表達(dá)呈上調(diào)趨勢，明顯高于DPSCs。結(jié)果提示SHED相對于DPSCs具有更強(qiáng)的破骨能力。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與DPSCs相比，SHED不僅具有更強(qiáng)的成骨分化能力，還兼有一定的破骨能力。但其具體的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚，還需進(jìn)一步研究。

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Comparative study on the biological function of dental pulp stem cells and dental pulp stem cells

PANG Zhen-zhen,WangLiang,GAO Lei,LIU Qin-zan,LI Ye
(Department of Stomatology,Baoding First Central Hospital,Hebei 071000,China)

Objective:Comparative study on the biological function of human dental pulp stem cells(SHED)and permanent teeth pulp stem cells(DPSCs)from different angles,and to explore the effect of bone reconstruction.Methods:SHED and DPSCs were isolated and cultured by lim iting dilution.Oil-red O staining was induced for 14 days,and alizarin red staining was carried out for 21 days.The levels of IL-6 and TNF-α were detected by ELISA.Two kinds of stem cells were cultured in vitro and induced by ALP after 7d staining.The expression of Runx2,RANKL and OPG were detected by real-time quantitative PCR.Results:The isolated SHED and DPSCs have osteogenic and adipogenic differentiation ability,which is consistent w ith the characteristics of stem cells.SHED expression of IL-6 and TNF-α were higher than that of DPSCs (P＜0.05);Both kinds of stem cells express Runx2 OPG and RANKL after osteoinductive differentiation,but the expression of SHED obviously higher than that of DPSCs(P＜0.05).Conclusion:Compared w ith DPSCs,SHED has not only the ability of osteogenic differentiation but also an osteoclast capacity,rem ind that SHED may participate in the bone reconstruction.

human exfoliated deciduous dental pulp stem cells;dental pulp stem cells;TL-6;Runx2

R78

A

1672-2973(2017)03-0000-00

2017- - )

龐真貞 保定市第一中心醫(yī)院口腔科 主治醫(yī)師 河北071000

王 良 保定市第一中心醫(yī)院手術(shù)室 護(hù)師河北 071000

高 磊 保定市第一中心醫(yī)院彩超室 副主任醫(yī)師 河北071000

劉欽贊 保定市第一中心醫(yī)院口腔科 醫(yī)師 河北 071000

李 曄 保定市第一中心醫(yī)院口腔科 主任醫(yī)師 河北071000