吳建寶 馬齊兵 胡傳榮，2 何東平，2

(武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，武漢 430023) (國(guó)家糧食局糧油資源綜合開發(fā)工程技術(shù)研究中心2，武漢 430023)

超聲輔助水相酶法提取油茶籽油及蛋白的工藝優(yōu)化

吳建寶1馬齊兵1胡傳榮1，2何東平1，2

(武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，武漢 430023) (國(guó)家糧食局糧油資源綜合開發(fā)工程技術(shù)研究中心2，武漢 430023)

為了提高水相酶法油脂提取率，研究采用超聲輔助提取油茶籽油及水解蛋白。應(yīng)用Plackett-Burman設(shè)計(jì)聯(lián)用響應(yīng)面分析法對(duì)超聲輔助水相酶法提取油茶籽油和水解蛋白的工藝進(jìn)行優(yōu)化。首先用Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)篩選出具有顯著效應(yīng)的3個(gè)因素——超聲時(shí)間、pH和反應(yīng)時(shí)間；然后采用響應(yīng)面分析法確定主要影響因素的最優(yōu)工藝條件為超聲時(shí)間30 min、pH 9和反應(yīng)時(shí)間3.5 h，在此條件下，油茶籽油得率為89.704%，油茶籽蛋白得率為90.638%，與預(yù)測(cè)值誤差不超過(guò)0.5%。這表明Plackett-Burman設(shè)計(jì)聯(lián)用響應(yīng)面分析法建立的模型具有可行性。

Plackett-Burman 設(shè)計(jì) 超聲波 水相酶法 響應(yīng)面

油茶籽油的脂肪酸組成與橄欖油十分相似，對(duì)防止血管硬化和高血壓等現(xiàn)代文明病的發(fā)生有益，受到廣大消費(fèi)者的青睞[1-2]。油茶籽油中含有多種有益的生理活性成分類如角鯊烯、維生素E和類胡蘿卜素以及其特有的茶多酚和山茶甙等，且其含有的多糖成分有助于抗癌[3]，油茶籽蛋白中含有對(duì)人體生長(zhǎng)發(fā)育起到重要作用的賴氨酸和色氨酸，其含有的多糖成分具有抗癌活性，還可以作為蛋白強(qiáng)化劑、低脂乳飲品等，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[4-6]。

水相酶法作為“安全、高效、綠色”的制油技術(shù)其提取的油純度高，磷脂含量、酸值及過(guò)氧化值低，色澤淺、污染少、易精煉，能夠很好地保存油料里的油酸和亞油酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[7-8]。超聲波以其高頻振動(dòng)有效破碎細(xì)胞，能縮短提取時(shí)間，同時(shí)對(duì)油脂與蛋白質(zhì)結(jié)合體進(jìn)行空化作用，保護(hù)有效成分不被破壞[9]。Shah等[10]通過(guò)超聲波進(jìn)行預(yù)處理，然后進(jìn)行水酶法提取，不僅油脂提取率大幅增加，而且縮短了提取時(shí)間。

本研究在水酶法[11]的基礎(chǔ)上通過(guò)超聲輔助來(lái)提高油脂及蛋白得率，首先采用PB設(shè)計(jì)試驗(yàn)篩選出對(duì)油脂提取率和蛋白提取率有顯著作用的因素，然后進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析[12-13]，確定最佳提取工藝條件，旨在為油茶籽油和蛋白的開發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

油茶籽仁：實(shí)驗(yàn)室自制；堿性蛋白酶(Alkaline Protease)：BIOSHARP公司；維生素E標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Supelco 公司；角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品(純度99%)：上海江萊生物科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

JY98-IIID型超聲波細(xì)胞破碎儀：寧波新芝生物科技有限公司；K9840自動(dòng)凱氏定氮儀：濟(jì)南海能儀器有限公司；GC-14C 氣相色譜儀(FID 檢測(cè)器)、LC-20AT 高效液相色譜儀(紫外檢測(cè)器，C18色譜柱)：日本島津公司；TD5A—WS離心機(jī)：湖南省凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；DZF-6050型真空干燥箱：上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

圖1 超聲輔助水相酶法提取油茶籽油和水解蛋白的工藝流程圖

1.3.2 油和蛋白質(zhì)提取率計(jì)算公式

1.3.3 綜合隸屬度計(jì)算公式

在試驗(yàn)中，有2個(gè)目標(biāo)值(油提取率和蛋白提取率)，并且要求油提取率和蛋白提取率的目標(biāo)值都是越大越好，設(shè)置一個(gè)綜合的目標(biāo)值(綜合隸屬度Y)，其計(jì)算方法為：

Y=b1Y1+b2Y2

根據(jù)2個(gè)目標(biāo)值的重要性，取b1=b2=0.5，Y1和Y2為油提取率和蛋白提取率隸屬度。隸屬度的計(jì)算公式為：

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.4.1 單因素試驗(yàn)

分別考察超聲時(shí)間、超聲溫度、超聲功率、料液比、酶添加量、pH、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間等因素對(duì)油提取率和蛋白提取率的影響。

1.4.2Plackett-Burman設(shè)計(jì)

應(yīng)用DesignExpert8.0軟件，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定Plackett-Burman試驗(yàn)的因素和水平。以綜合隸屬度為響應(yīng)值，包括超聲時(shí)間、超聲溫度、超聲功率、料液比、酶添加量、pH、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間8個(gè)因素以及每個(gè)因素分別確定高(1)、低(-1)兩水平，同時(shí)添加3個(gè)虛擬因子作為誤差分析，共計(jì)12組試驗(yàn)。

表1 Plackett-Burman 試驗(yàn)因素編碼及水平

1.4.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在Plackett-Burman試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-

Behnken的中心組合原理，以超聲時(shí)間、pH值和反應(yīng)時(shí)間為自變量，以綜合隸屬度Y為響應(yīng)值，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)因素及水平編碼表

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶籽仁中主要成分

對(duì)剝殼后的油茶籽仁的主要成分進(jìn)行測(cè)定，其主要成分見(jiàn)表3。

表3 油茶籽仁中主要成分表

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

前期的單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)超聲時(shí)間、超聲溫度、超聲功率、料液比、酶添加量、pH、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間分別為30min、45 ℃、300W、1∶5、1.5%、9、60 ℃和3.5h時(shí)，其可以得到最優(yōu)的油提取率和蛋白提取率，分別為85.85%和89.12%、86.45%和87.24%、86.18%和89.73%、85.96%和89.24%、87.53%和88.74%、88.12%和89.04%、86.09%和88.15%、87.36%和89.45%。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，確定PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和水平。

2.3Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果與分析

Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，采用DesignExpert8.0對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到綜合隸屬度Y關(guān)于各因素的一階回歸方程模型：

Y=0.025 8-5.58E-3A+5.333E-3B+2.4E-4C+0.064 3D+1E-2E-0.074 2F-5.33E-4G+0.184 33H

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值

由表5可知，回歸模型在95%概率水平下顯著，即該模型擬合良好；模型的校正決定系數(shù)R2=0.967 2，表明96.72% 的試驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性可用此模型來(lái)解釋[14]。在分析的8個(gè)因素中，超聲時(shí)間(P=0.034<0.05)、pH(P=0.016<0.05)和反應(yīng)時(shí)間(P=0.008 8<0.01)對(duì)綜合隸屬度有顯著影響，因此在響應(yīng)面試驗(yàn)分析中，將超聲時(shí)間、pH和反應(yīng)時(shí)間3個(gè)因素作為考察的最優(yōu)水平條件。其余的5個(gè)因素由于對(duì)綜合隸屬度的影響不顯著，故采用單因素試驗(yàn)的最佳條件：超聲溫度45 ℃、超聲功率300W、料液比1∶5、酶添加量1.5%和反應(yīng)溫度60 ℃。

表5 各因素方差及顯著性分析

注：**為差異極顯著(P<0.01)，*為差異顯著(P<0.05)，余同。

2.4Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)及數(shù)學(xué)模型的建立

采用DesignExpert8.0軟件，對(duì)表6中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，建立回歸模型，得到綜合隸屬度對(duì)編碼自變量超聲時(shí)間、pH值和反應(yīng)時(shí)間的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=-24.848 50+0.208 36A+2.430 25F+6.511 75H-7.275E-3AF-0.018 1AH+0.098 5FH-1.26E-3A2-0.1382 5F2-0.99H2

式中：Y為綜合隸屬度；A為超聲時(shí)間/min；F為pH；H為反應(yīng)時(shí)間/h。對(duì)該回歸方程模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，綜合隸屬度的方差分析結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 綜合隸屬度的回歸方程方差分析結(jié)果

表6 Box-Behnken試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.5 最佳工藝的條件預(yù)測(cè)及驗(yàn)證試驗(yàn)

采用DesignExpert8.0軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行預(yù)測(cè)，分析得到的最優(yōu)條件為：超聲時(shí)間31.22min、pH9.19、反應(yīng)時(shí)間3.46h。在此條件下，綜合隸屬度為0.825。在表6中試驗(yàn)14得到的響應(yīng)值大于理論值0.825，這是由于響應(yīng)模型是針對(duì)大部分?jǐn)?shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)值，試驗(yàn)14只是個(gè)意外單個(gè)值，從統(tǒng)計(jì)學(xué)的角度出發(fā)并不具有代表性，不會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響[16]。

為了便于實(shí)際操作，選用的條件為：超聲時(shí)間30min、pH9和反應(yīng)時(shí)間3.5h，在此條件下共做4組平行試驗(yàn)，測(cè)得油及蛋白質(zhì)提取率的平均值分別為89.704%、90.638%，計(jì)算其綜合隸屬度為0.823，試驗(yàn)結(jié)果與理論預(yù)測(cè)值吻合，相對(duì)誤差在誤差范圍(<0.5%)內(nèi)，說(shuō)明通過(guò)該模型優(yōu)化出來(lái)的工藝條件可以使用。

2.6 水相酶法油茶籽油及水解蛋白性能指標(biāo)參數(shù)

將優(yōu)化后的最佳工藝下制取的油茶籽油和蛋白進(jìn)行理化指標(biāo)測(cè)定及成分分析，結(jié)果見(jiàn)表8、表9。

表8 水相酶法油茶籽油的理化指標(biāo)及主要營(yíng)養(yǎng)成分

由表8可以看出，水相酶法得到的油茶籽油的基本理化指標(biāo)已達(dá)到國(guó)家一級(jí)壓榨油茶籽油的質(zhì)量要求[17]，其不需要脫酸、脫色等精煉工藝，且脂肪酸組成均符合油茶籽油的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)；與橄欖油的不飽和脂肪酸含量相差不大，角鯊烯的含量低于橄欖油，但VE含量卻高于橄欖油[18]。制取的油茶籽蛋白中含有一定量的多糖，具有抗氧化、降血脂、提高免疫力等生物功能[19]。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)從8種因素中選取對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響大的3種因素，通過(guò)響應(yīng)面分析法建立綜合隸屬度關(guān)于超聲時(shí)間、pH和反應(yīng)時(shí)間的模型，其回歸方程顯著，可以用來(lái)進(jìn)行預(yù)測(cè)提取率。超聲波輔助水相酶法提取油茶籽油和水解蛋白的最佳工藝參數(shù)為：超聲溫度45 ℃，超聲時(shí)間30min，超聲功率300W，料液比1∶5、加酶量1.5%，酶解pH9，反應(yīng)溫度60 ℃，反應(yīng)時(shí)間3.5h，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得油茶籽油得率為89.704%，油茶籽蛋白得率為90.638%。使用Plackett-Burman設(shè)計(jì)聯(lián)用響應(yīng)面分析法可以縮短試驗(yàn)時(shí)間、減少試驗(yàn)次數(shù)及試驗(yàn)資源浪費(fèi)同時(shí)又能實(shí)現(xiàn)條件優(yōu)化，其優(yōu)化后的預(yù)測(cè)結(jié)果與試驗(yàn)結(jié)果吻合性較好。將離心分離后得到的油和水解蛋白進(jìn)行質(zhì)量指標(biāo)檢測(cè)，油茶籽油的質(zhì)量達(dá)到壓榨油茶籽油一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，不需要完全精煉，可以減少精煉成本；油茶籽蛋白中含有一定量的多糖，具有抗氧化性等多種生物活性，可以作為一種天然的抗氧化劑應(yīng)用于食品工業(yè)中。

[1]何東平,相海.油茶籽加工技術(shù)[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,2015HeDongping,XiangHai.Thetechnologyofteaseedprocessing[M].Beijing：ChinaLightIndustryPress,2015

[2]柏云愛(ài),宋大海,張富強(qiáng),等. 油茶籽油與橄欖油營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的比較[J].中國(guó)油脂,2008,33(8):39-41BoYunai，SongDahai，ZhangFuqiang，etal.Thecomparisonofnutritionalvalueofoliveoilandcamelliaoleiferaseedoil[J].ChinaOilsandFats,2008,33(8):39-41

[3]JinXC.Bioactivitiesofwater-solublepolysaccharidesfromfruitshellofCamelliaoleiferaAbel:antitumorandantioxidantactivities[J].CarbohydratePolymers,2012, 87(3): 2198-2201

[4]徐航,許琪,李鵬飛，等.水酶法提取花生油水相制備低脂花生乳飲料[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2015, 41(4):81-86XuHang,XuQi，LiPengfei,etal.Preparationoflow-fatpeanutbeverageusingskimfractionfromaqueousextractionprocessing[J].FoodandFermentationIndustries,2015, 41(4):81-86

[5]韓宗元,江連洲,李楊,等.超聲波輔助水酶法提取油茶籽蛋白中五種酶的比較及響應(yīng)面優(yōu)化的工藝的研究[J].食品工業(yè)科技,2012,33(20)：151-155HanZongyuan,JiangLianzhou,LiYang,etal.Ultrasonicassistedintheaqueousenzymaticextractionofcamelliaseedproteinbythecomparisonoffiveenzymesandresearchofoptimizationofprocessbytheresponsesurfacemethodology[J].ScienceandTechnologyofFoodIndustry, 2012, 33(20): 151-155

[6]JinXC.Bioactivitiesofwater-solublepolysaccharidesfromfruitshellofCamelliaoleiferaAbel:antitumorandantioxidantactivities[J].CarbohydratePolymers,2012, 87(3): 2198-2201

[7]ShwetaShah,AparnaSharma,GuptaMN.ExtractionofoilfromJatrophacurcasL．seedkernelsbycombinationofultrasonicationandaqueousenzymaticoilextraction[J]．BioresourceTechnology,2005,96: 121-123

[8]章紹兵,王璋.水酶法從菜籽中提取油及水解蛋白的研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2007,23(9):213-219ZhangShaobing,WangZhang.Aqueousenzymaticextractiontechnologyofoilandproteinhydrolysatesfromrapeseed[J].TransactionsoftheChineseSocietyofAgriculturalEngineering,2007,23(9):213-219

[9]朱文學(xué),焦昆鵬,羅磊,等.綠豆皮黃酮的超聲波輔助水提工藝優(yōu)化及抗氧化活性[J].食品科學(xué),2015,36(16):12-17ZhuWenxue,JiaoKunpeng,LuoLei,etal.Optimizationofultrasonic-assistedextractionandantioxidativeactivitiesoftotalflavonoidsfrommungbean(Phaseolusradiatus)hull[J].FoodScience,2015,36(16):12-17

[10]ShahS,SharmaA,GuptaMN.ExtractionofoilfromJatrophacurcasLseedkernelsbycombinationofultrasonicationandaqueousenzymaticoilextraction[J].BioresourceTechnology, 2005, 96(1): 121-123

[11]吳建寶,周力,胡傳榮,等.水酶法同時(shí)提取油茶籽油及蛋白研究[J].糧食與油脂,2015,28(9):58-61WuJianbao,ZhouLi,HuChuanrong,etal.Aqueousenzymaticextractionofcamelliaoleiferaseedoilandproteinsimultaneously[J].Cereals&Oils,2015,28(9):58-61

[12]DasAK,MandauV,MandalSC.DesignofexperimentapproachfortheprocessoptimisationofmicrowaveassistedextractionoflupeolfromFicusracemosaleavesusingresponsesurfacemethodology[J].PhytochemicalAnalysis, 2013, 24(3):230-247

[13]易軍鵬,朱文學(xué),馬海樂(lè),等.響應(yīng)面法優(yōu)化微波提取牡丹籽油的工藝研究 [J].食品科學(xué),2009,30(14):99-104YiJunpeng,ZhuWenxue,MaHaile,etal.Optimizationofmicrowave-assistedextractionofoilfromPaeoniasuffruticosaAndr.seedsusingresponsesurfaceanalysis[J].FoodScience, 2009,30(14):99-104

[14]AbdulazizQM.ApplicationofPlacket-BurmanfactorialdesigntoimprovecitrininproductioninMonascusruberbatchcultures[J]．BotanicalBulletinofAcademiaSinica,2006,47(2) : 167-172

[15]項(xiàng)駟文，薛正蓮，秦艷飛，等．響應(yīng)面法優(yōu)化那西肽發(fā)酵條件[J]．中國(guó)抗生素雜志,2013,38( 6) : 430-433XiangSiwen,XueZhenglian,QinYanfei,etal.Optimizationoffermentationconditionfornosiheptideproductionbyresponsesurfacemethodology[J]．ChineseJournalofAntibiotics，2013，38( 6) : 430-433

[16]周國(guó)儀, 舒靜, 黃澤元. 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取芝麻葉黃酮的研究[J]．食品與機(jī)械, 2007, 23(3): 77-80ZhouGuoyi,ShuJing,HuangZeyuan.Optimizationofultrasound-assistedextractionofflavonoidsfromsesameleavesusingresponsesurfacemethod[J].FoodandMachinery, 2007, 23(3): 77-80

[17]GB11765-2003,油茶籽油[S]GB11765-2003,CamelliaoleiferaAbeloil[S]

[18]湯富彬,沈丹玉,劉毅華,等.油茶籽油和橄欖油中主要化學(xué)成分分析[J]．中國(guó)糧油學(xué)報(bào), 2013, 28(7)：108-113TangFubin,ShenDanyu,LiuYihua,etal.Analysisofmainchemicalcomponentsincamelliaoilandoliveoil[J]．JournaloftheChineseCerealsandOilsAssociation, 2013，28(7)：108-113

[19]MasudaY,ItoK,KonishiM,etal.ApolysaccharideextractedfromGrifolafrondosaenhancestheanti-tumoractivityofbonemarrow-deriveddendriticcell-basedimmunotherapyagainstmurinecoloncancer[J].CancerImmunolImmun, 2010, 59: 1531-1541.

Optimization of Ultrasound-Assisted Aqueous Enzymatic
Extraction of Oil and Protein from Camellia

Wu Jianbao1Ma Qibing1Hu Chuanrong1，2He Dongping1，2
(College of Food Science and Engineering，Wuhan Polytechnic University1，Wuhan 430023)
(Grain and Oil Resources Comprehensive Exploitation and Engineering Technology
Research Center of State Administration of Grain2，Wuhan 430023)

Ultrasound-assisted extraction of oil and hydrolyzed protein from camellia was studied in order to improve oil extraction by aqueous enzymatic.Ultrasound-assisted aqueous enzymatic extraction of oil and protein from camellia was optimized by Plackett Burman design combined with response surface methodology.Firstly，ultrasonic time，pH，response time were identified by Plackett-Burman design as the significant factors，then the extraction conditions were optimized by response surface analysis as follows：.ultrasonic time 30min，pH9 and response time 3.5 h.Under the above conditions，the yields of oil was 89.704%，the yields of protein was 90.638%，and the value error with the predict value was less than 0.5%.It indicated that the model build by Plackett Burman design combined with response surface methodology was reliability.

Plackett-Burman design，ultrasonic wave，aqueous enzymatic，response surface methodology

國(guó)家糧食局糧食公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201313012-03)

2015-11-14

吳建寶，男，1989年出生，碩士，油脂及植物蛋白研究

何東平，男，1957年出生，教授，博士生導(dǎo)師，糧食、油脂與植物蛋白工程

TS224

A

1003-0174(2017)06-0091-06