黃秋偉 毛立彥 唐毓瑋 黃欣欣 石蘭蓉 龍凌云

摘 要：以超臨界CO2萃取熱帶睡蓮鮮樣所得的精油與水相為材料，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析兩者的揮發(fā)性組分，采用四種體外抗氧化法測定和比較兩者的抗氧化活性。結(jié)果表明，精油的揮發(fā)性組分種類要明顯多余水相的，且精油中主要組分為萜烯類化合物，含量最高組分為6，9-十七碳二烯（含量為25.41 %），水相中主要組分為芳香醇類化合物，含量最高組分為苯甲醇（含量為72.86%）。四種體外抗氧化法比較結(jié)果均表現(xiàn)為精油>水相，水相具備原花的部分花香和一定的抗氧化活性，可以進一步的開發(fā)利用。

關(guān)鍵詞：熱帶睡蓮 精油 水相 超臨界CO2萃取 抗氧化活性

中圖分類號： ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A

睡蓮是睡蓮科（Nymphaeaceae）睡蓮屬（Nymphaea Linn.）多年生宿根浮葉植物的統(tǒng)稱，依據(jù)分布區(qū)域和生態(tài)適應(yīng)性可分為耐寒睡蓮和熱帶睡蓮兩大類，其中，大多數(shù)的熱帶睡蓮品種及栽培種的鮮花均具有清雅宜人的芳香氣味，而芳香氣味的產(chǎn)生一般與植物精油密切相關(guān)。用于植物精油提取的技術(shù)較多，除了常用的蒸餾法外[1]，超臨界流體萃取是目前主要技術(shù)手段之一，其中常見報道的流體介質(zhì)又以二氧化碳居多[2-4]。超臨界流體萃取技術(shù)原料可以是固體干樣、固體鮮樣、液體樣，當(dāng)用來萃取鮮樣時，其分離產(chǎn)物為互不相溶的兩種形態(tài)，可以稱之為油相和水相，油相為精油等非極性成分，水相為隨萃取流體介質(zhì)而流出的含水副產(chǎn)物。當(dāng)前，關(guān)于睡蓮的研究報道熱點主要是基于不同技術(shù)手段探究睡蓮系統(tǒng)發(fā)育[5-8]、睡蓮基因組及花色組成因子研究[9-10]、睡蓮代謝物組成[11]、睡蓮生理特性及其對水體修復(fù)機制[12-15]等，而關(guān)于睡蓮精油提取及其活性研究的報道較為罕見。本文采用超臨界CO2萃取法來萃取熱帶睡蓮 “保羅蘭”鮮花樣品，利用GC-MS檢測手段檢測分析萃取得到的精油和水相揮發(fā)性組分，通過四種體外抗氧化法來對比兩者的抗氧化活性，為兩者后期在食品及日用化妝品領(lǐng)域的開發(fā)提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

供試植物：采摘于廣西亞熱帶作物研究所睡蓮資源種質(zhì)圃，采摘品種為熱帶睡蓮“保羅蘭”;CO2氣體（食品級，純度≥99.99 %）：廣西國信氣體研究院有限公司;無水乙醇（2.5 L裝分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司;1，1-二苯基-2苦基肼自由基：東京化成工業(yè)株式會社;2，2-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6磺酸）二胺鹽：上海源葉生物科技有限公司;其余化學(xué)試劑（分析純）：采購于廣西南寧茵興科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

HA221-40型超臨界流體萃取裝置：江蘇南通華安超臨界萃取有限公司;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（7980A/5975C）：美國Agilent公司;50/30μm CAR/PDMS/DVB萃取纖維頭：美國SUPELCO公司;GR200型電子分析天平：日本A&D公司;T6新世紀紫外可見分光光度計：上海普析通用儀器公司;其余為實驗室常規(guī)設(shè)備。

1.2 方法

1.2.1 熱帶睡蓮花鮮樣的超臨界萃取

參照黃秋偉[16]等的研究方法，利用超臨界CO2萃取法來提取睡蓮鮮樣。稱取開花一天的熱帶睡蓮“保羅蘭”鮮花雄蕊50 g，超臨界萃取壓力為27.5 MPa，萃取溫度為45 ℃，循環(huán)萃取時間設(shè)置為120 min。萃取結(jié)束后，收集分離釜中萃取物的上層精油并轉(zhuǎn)移至離心管中于4 ℃冷藏，同時收集萃取得到的下層水相，也轉(zhuǎn)移至離心管中于4 ℃冷藏。

1.2.2 萃取物揮發(fā)性組分的GC-MS測定

1.2.2.1 樣品預(yù)處理

油相：取0.5 g精油樣品置于20 ml頂空瓶中，擰緊瓶蓋。于60 ℃下平衡5 min后，用固相微萃取針60 ℃下萃取20 min，然后于進樣口解吸5 min。

水相：取6 ml水相樣品置于20 ml頂空瓶中，擰緊瓶蓋。于60 ℃下平衡5 min后，用固相微萃取針60 ℃下萃取20 min，然后于進樣口解吸5 min。

1.2.2.2 分析條件

色譜條件：色譜柱為HP-INNOWAX毛細管柱子（30m×0.25mm×0.25μm）;載氣為He，流速1 mL/min，分離比5：1;進樣溫度為250 ℃;升溫程序為起始溫度為40 ℃，保持5 min，以8 ℃/min，升至250 ℃，保持5 min。質(zhì)譜條件：EI電離子源，能量70eV;離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，接口溫度250℃，掃描范圍30～400 m/z。

1.2.3 萃取物對DPPH自由基的清除作用

將精油與水相分別用無水乙醇配制成0.01、0.10、1.00、10.00 mg/mL濃度液，以這4個濃度液進行預(yù)試驗，試驗反應(yīng)時間暫定20 min，來確定試驗對象的起始濃度。預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)精油在1.00 mg/mL的濃度時表現(xiàn)出清除效果，而水相要達到10.00 mg/mL時才表現(xiàn)出清除效果。因此睡蓮精油、水相分別以1.00 mg/mL、10.00 mg/mL作為起始濃度，并設(shè)置兩個濃度遞增梯度范圍，以這兩個濃度梯度作為清除DPPH自由基能力測定的濃度梯度，其它的抗氧化測定指標也采用這兩個濃度梯度。

1.2.3.1 清除DPPH自由基反應(yīng)時間的確定

參考劉帥濤[17]等的研究方法，分別量取精油與水相的一低一高兩個濃度1 mL，將這兩個濃度液分別與1 mL的0.04 mg/mL DPPH溶液于比色皿中混合作為處理組，另取濃度液溶劑即無水乙醇1 mL與1 mL的0.04 mg/mL DPPH溶液與比色皿中混合作為空白組。處理組和空白組加樣混合完畢后，馬上在波長為517 nm的光波下測定吸光值，并開始計時，以空氣作為空白調(diào)零，同時以吸光值為縱坐標，時間梯度為橫坐標，繪制動力學(xué)曲線，取反應(yīng)平衡的時間點作為自由基清除體系的反應(yīng)時間。

1.2.3.2 清除DPPH自由基能力測定

量取對照組與試驗組中的各個濃度液和無水乙醇各2 mL，分別與2 mL的0.04 mg/mL DPPH溶液混合，另取各個濃度液2 mL與2 mL ?DPPH溶液的溶劑混合。三個混合液混合均勻后靜置于黑暗條件下常溫反應(yīng)，反應(yīng)時間則依據(jù)1.2.3.1步驟的結(jié)果中反應(yīng)平衡點來設(shè)定。反應(yīng)時間到達后，置于517 nm的光波下測量，以空氣作為空白調(diào)零，記錄對應(yīng)的吸光值。樣品濃度液與DPPH溶液混合液的吸光值記為Ai;樣品濃度液與DPPH溶液溶劑混合液的吸光值記為Aj;無水乙醇與DPPH溶液混合液記為A0。并按照下式計算清除率，并以樣品濃度對數(shù)為X，自由基清除率為Y，作線性回歸求方程，算出清除率為50%的樣品濃度（IC50）：

DPPH清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/A0]×100

1.2.4 萃取物清除ABTS+自由基能力測定

參考白海娜[18]等的方法，并調(diào)整用量。吸取等體積的2.6 mmol/L 過硫酸鉀溶液與7.4 mmol/L ABTS+自由基溶液均勻混合后，置于暗室且室溫條件下反應(yīng)12～16 h。用無水乙醇將混合液稀釋40～50倍，調(diào)整其在波長734 nm處的吸光值在0.70±0.05的范圍內(nèi)。量取對照組與試驗組中的各個濃度液0.2 mL與2 mL稀釋液于比色皿中混合，同時量取0.2 mL無水乙醇與2 mL稀釋液于比色皿中混合，加樣完畢后靜置6 min反應(yīng)，之后快速測量734 nm處的吸光值。樣品濃度混合液的吸光值記為Ai;無水乙醇混合液的吸光值記為A0。并按照下式計算清除率，并以樣品濃度對數(shù)為X，清除率為Y，作線性回歸求方程，算出清除率為50%的樣品濃度（IC50）：

ABTS+自由基清除率（%）=[（A0-Ai）/A0]×100

1.2.5 萃提物總還原力測定

參考張俊霞[19]等和邢玉娟[20]等的測定方法。量取精油與水相的稀釋濃度液各1 mL，并置于玻璃試管中，然后依次與同體積的0.2 mol/mL磷酸鹽緩沖液（pH=6.6）、1%鐵氰化鉀溶液均勻混合。混合液于在50 ℃處水浴反應(yīng)20 min，反應(yīng)完畢后快速置于冰水中冷卻。加入10%三氯乙酸溶液1 mL終止反應(yīng)，冷卻液于12000 r/min轉(zhuǎn)速下，低溫高速離心10 min，吸取上清液2.0 mL，加入2.0 mL蒸餾水，0.4 mL0.1%三氯化鐵溶液，混勻后靜置10 min，并測定混合液在波長為700 nm處的吸光度。

1.2.6 萃提物鐵還原總抗氧化能力（FRAP）測定

參考楊少輝[21]等的方法，先配制FRAP工作液，然后配制10 mmol/L的硫酸亞鐵標準母液，并將其稀釋成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mmol/L的硫酸亞鐵測定標液，吸取各濃度標液0.1 ml于試管中，分別加入FRAP 工作液2.9 mL，設(shè)定水浴溫度為37 ℃，反應(yīng)30 min，同時以水為空白對照，于光波長 593 nm 處測定吸光度，以標液濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制硫酸亞鐵標準曲線，求出線性方程。按照測標準曲線的方法進行測定樣品抗氧化能力，分別吸取 0.1 mL的不同試驗濃度精油和水相稀釋液。樣品的總抗氧化能力 FRAP值以亞鐵離子的摩爾濃度來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)性組分分析結(jié)果

睡蓮精油和水相經(jīng)頂空固相微萃取，通過氣相-質(zhì)譜聯(lián)用檢測技術(shù)對其內(nèi)含組分進行分析，其揮發(fā)性成分種類總離子流圖如圖1和圖2所示。其中含量超過5%的主成分見表1。

由圖1和圖2可以明顯看出，精油譜圖的出峰數(shù)目要明顯高于水相的，每一個峰就相當(dāng)于檢測到一個化合物，這表明精油揮發(fā)性化合物種類多于水相。結(jié)合譜圖的保留指數(shù)，通過NIST08譜圖庫進行解譜分析，精油共檢出54種已知成分，水相共檢出14種已知成分[16]。此外，由表1數(shù)據(jù)可見，依據(jù)峰面積歸一化法進行定量分析，精油中含量超過5%的化合物有5種，且這些揮發(fā)性化合物主要是萜烯類，有3種組分，其中含量最高的組分為6，9-十七碳二烯，含量為25.41%;水相中含量超過5%的化合物只有2種，且都是芳香醇類化合物，其中含量最高的組分為苯甲醇，含量可達到72.86%，且苯甲醇為精油和水相兩者揮發(fā)性組分主要組成的共有成分。

2.2 DPPH自由基的清除作用

2.2.1 DPPH自由基清除體系反應(yīng)時間的確定

精油與水相的自由基混合液和無水乙醇自由基混合液在波長517 nm下的吸光值隨著時間延長的動力學(xué)曲線結(jié)果見圖3和圖4。

由圖3和圖4可以看出，隨著時間的延長，精油與水相的自由基混合液的吸光值表現(xiàn)出規(guī)律性的下降趨勢。

此外，兩組作為對照的無水乙醇混合液在不加樣品的情況下，吸光值隨著時間延長，變化曲線接近水平線，說明了本試驗所選用的DPPH自由基體系較為穩(wěn)定。添加高低濃度睡蓮精油的自由基混合液，當(dāng)反應(yīng)時間超過30 min后，兩者的吸光值均無變化，說明睡蓮精油清除自由基反應(yīng)平衡點為30 min;水相對自由基的降色效果較弱，且反應(yīng)較慢，當(dāng)時間為90 min時，高低兩個濃度的水相才使得自由基混合溶液吸光值從0.572分別降至0.411、0.448，超過這一時間點后吸光值無變化，由此說明水相清除自由基的反應(yīng)平衡點為90 min。

2.2.2 DPPH自由基清除能力測定結(jié)果

精油與水相對DPPH自由基的清除率隨濃度梯度的變化結(jié)果見圖5和圖6。

圖中不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05），下同。

由圖5和圖6可以看出，在所選取的濃度梯度范圍內(nèi)，睡蓮精油和水相對DPPH自由基的清除率隨著濃度的提高而升高，且各個梯度值的清除率均表現(xiàn)出顯著性差異，通過清除曲線所得的回歸方程計算，超臨界花油清除自由基的IC50為3.848 mg/mL（R2=0.956），而水相在試驗濃度范圍內(nèi)所產(chǎn)生的自由基清除率均低于50%，因而無法計算IC50。

2.3 ABTS+自由基清除能力的測定結(jié)果

精油與水相對ABTS+自由基的清除率隨濃度梯度的變化結(jié)果見圖7和圖8。

從圖7和圖8中可以看出，試驗濃度范圍內(nèi)的精油對自由基的清除率隨濃度提高而表現(xiàn)出顯著性地升高，而水相在所設(shè)定的10.00～80.00 mg/mL濃度范圍內(nèi)，清除率隨著濃度提高而升高，且彼此間差異顯著，當(dāng)濃度提升至100.00 mg/mL，清除率雖有升高，但相對于80.00 mg/mL的清除率無顯著性變化;經(jīng)回歸方程計算，精油清除自由基的IC50為2.107 mg/mL（R2=0.963），而水相在濃度范圍內(nèi)的自由基清除率均低于50%，因而無法計算IC50。

2.4 總還原力的測定結(jié)果

精油與水相的總還原力大小隨濃度梯度的變化結(jié)果見圖9和圖10。

從圖9和圖10可看出，在試驗濃度范圍內(nèi)，隨著濃度梯度的不斷提高，精油和水相的所表現(xiàn)出來的總還原力，即吸光值均呈現(xiàn)逐漸增大的態(tài)勢。此外，精油的吸光值總體上高于水相，隨著濃度的提高，前者與后者的差值就越大，而試驗中樣品吸光值越大，表明其相對應(yīng)總還原力就越強。

2.5 總抗氧化力的測定結(jié)果

本次試驗所測得的硫酸亞鐵標準曲線見圖11。精油與水相的總抗氧化力測定結(jié)果見圖12和圖13。

由圖11的標準曲線方程，將所測得到的吸光值換算成FRAP值。由圖12和圖13可以看出，精油與水相的稀釋液濃度越高，所還原得到的FRAP值越高，相對應(yīng)的總抗氧化力就越強。在試驗的濃度范圍內(nèi)，精油和水相各個處理濃度間彼此相應(yīng)的總抗氧化力差異顯著。此外，低濃度下精油得到的FRAP值要高于水相，但差值相差不大，隨濃度的提高，兩者的差值逐步增大，當(dāng)濃度均達到最大時，精油與水相對應(yīng)的FRAP差值已由起始濃度時的0.003 mmol/L增大到了的0.250 mmol/L。試驗中樣品測試結(jié)果換算的FRAP值越高，表明其相對應(yīng)的總抗氧化力越強。

3 討論與結(jié)論

利用超臨界萃取睡蓮花鮮樣，除了可以得到睡蓮花精油，還可以得到與精油不相溶的水相，所謂水相實質(zhì)上是利用超臨界流體親和溶解及易分離的特性，在萃取鮮樣材料時，因材料帶有水，部分水會跟著流體流出分離后所出現(xiàn)的一種副產(chǎn)物，是一種混合有天然產(chǎn)物的混合相[22]。目前關(guān)于植物精油超臨界流體萃取研究[23]，基本上均以CO2為主，且萃取材料均為干樣，而用鮮樣作為萃取材料的研究極為罕見，這是由于大多數(shù)研究都是以提高超臨界精油產(chǎn)率為目的，而鮮樣含水量高，會增加超臨界流體傳質(zhì)阻力，降低精油的萃取率[24]，所以目前關(guān)于超臨界精油活性研究報道較多，而超臨界水相活性的相關(guān)研究基本沒有。

本研究主要采用GC-MS測定分析超臨界萃取睡蓮花鮮樣所得到睡蓮花精油和水相兩者的揮發(fā)性組分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)精油揮發(fā)組分種類要多于水相的，且精油主要揮發(fā)組分為萜烯類，水相主要揮發(fā)組分為芳香醇類;同時采用DPPH自由基清除、ABTS+自由基清除、總還原力、總抗氧化力這四種體外抗氧化測定模型，來測定及對比睡蓮花精油和水相的抗氧化活性?？寡趸钚詫Ρ仍囼灲Y(jié)果表明，在試驗設(shè)置的濃度范圍內(nèi)，對于DPPH和ABTS+這兩種自由基的清除能力，睡蓮花精油>水相;對于總還原力的強弱，睡蓮花精油>水相。因此，從整體的抗氧化測定結(jié)果來看，睡蓮花精油的抗氧化活性要明顯強于水相，但水相與精油揮發(fā)性主要組成成分均具有苯甲醇，因而相當(dāng)于具有鮮花部分的揮發(fā)性香氣成分，且從試驗結(jié)果中也可以看出，當(dāng)水相用乙醇稀釋至10 mg/mL的濃度時，稀釋液才對本次試驗采用的自由基模型表現(xiàn)出清除效果，因而看出在這一稀釋濃度時就具備一定的抗氧化活性，因而有一定的開發(fā)價值。

參考文獻

[1] ? ? 何新萍，高新慧，敬思群，等. ?響應(yīng)面法優(yōu)化茴香花精油提取工藝條件及精油組成分析[J].食品工業(yè)，2011，32（10）：4-7.

[2] ? ? ?趙令江，莘海亮，楊梅花，等. ?超臨界CO2萃取柑橘皮精油工藝研究[J]. 凱里學(xué)院學(xué)報，2019，37（3）：32-35.

[3] ? ? ?劉麗娜.響應(yīng)面法優(yōu)化超臨界CO2萃取紅樹莓籽精油的工藝[J]. 糧食與油脂，2019，32（8）：40-42.

[4] ? ? 丁仡，李源棟，劉秀明，等. ?超臨界CO2萃取印蒿精油工藝優(yōu)化及成分分析[J]. 食品研究與開發(fā)，2019，40（24）：167-172.

[5] ? ? 劉艷玲，徐立銘，倪學(xué)明，等. ?基于ITS 序列探討睡蓮屬植物的系統(tǒng)發(fā)育[J]. 武漢大學(xué)學(xué)報（理學(xué)版），2005（2）：258-262.

[6] ? ? 張海平，房偉民，陳發(fā)棣，等. ?部分睡蓮屬植物形態(tài)性狀的多樣性分析[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，32（4）：47-52.

[7] ? ? ?Péter P， Kinga K M， István S， et al. Genetic Variability of Thermal Nymphaea（Nympha- eaceae） Populations Based on ISSR Markers： Implications ?on ?Relationships， ?Hybridization， and Conservation[J]. Plant Molecular Biology Reporter， 2011， 29（4）： 906-918.

[8] ? ? 蘇群，楊亞涵，田 敏，等. ?睡蓮種質(zhì)資源遺傳多樣性分析及DNA 指紋圖譜構(gòu)建[J]. 熱帶作物學(xué)報，2020，41（2）：258-266.

[9] ? ? 朱滿蘭，王亮生，張會金，等. ?耐寒睡蓮花瓣中花青素苷組成及其與花色的關(guān)系[J]. 植物學(xué)報，2012，47（5）：437-453.

[10] ? Zhang L S， Chen F， Zhang X T， et al. The water lily genome and the early evolution of flowering plants[J]. Nature， 2020， 577（7788）： 79-84.

[11] ? 袁茹玉.不同品種睡蓮花揮發(fā)物組成及其茶湯功能成分和抗氧化活性評價[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[12] ? 古琴.低溫脅迫對不同熱帶睡蓮品種抗寒生理的影響[J]. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，32（5）：114-?118.

[13] ? 張雅君，吳含玉，張會金，等. ?夏季小花睡蓮?fù)λ~光抑制加劇的機制[J]. 植物生理學(xué)報，2018，54（1）：54-62.

[14] ? 柯美玉，陳栩. 光對睡蓮開花生物鐘的調(diào)控作用研究[J]. 中國園藝文摘，2018，（5）：21-25.

[15] ? 宋力，黃勤超，黃民生. ?利用荷花與睡蓮對沉積物中重金屬的修復(fù)研究[J]. 光譜學(xué)與光譜分析，2016，36（9）：2884-2888.

[16] ? 黃秋偉，毛立彥，龍凌云，等. ?熱帶睡蓮精油的超臨界CO2萃取優(yōu)化及其成分GC-MS分析[J]. 食品研究與開發(fā)，2020，41（7）：188-195.

[17] ? 劉帥濤，陶慧林，李錦艷. ?4種黃酮小分子對DPPH自由基的清除作用及構(gòu)效關(guān)系研究[J].分析測試學(xué)報，2012，31（1）：71-75.

[18] ? 白海娜，王振宇，劉瑞海，等. 白藜蘆醇與黑木耳多糖協(xié)同清除ABTS+自由基活性的研究[J]. 現(xiàn)代食品科技，2014，30（3）：64-68.

[19] ? 張俊霞，王應(yīng)玲，姜 寧，等. ?白花蛇舌草總黃酮提取工藝及其抗氧化活性研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，56（18）：3523-3527.

[20] ? 邢玉娟，陳 新，劉 梁，等. 水蒸氣蒸餾和超臨界萃取來鳳鳳菊精油抗氧化研究[J]. 食品研究與開發(fā)，2018，39（9）：1-5.

[21] ? 楊少輝，宋英今，王潔華，等. 雪蓮果體外抗氧化和自由基清除能力[J]. 食品科學(xué)，2010，31（11）：166-169.

[22] ? 徐懷德. ?天然產(chǎn)物提取工藝學(xué)[M]. 北京：中國輕工業(yè)出版社，2008： 135-137.

[23] ? 吳嘉碧，陳丹玲，陳侶平. ?植物精油提取方法研究進展綜述[J]. 化工設(shè)計通訊，2016，42（02）：33-34.

[24] ? 許克勇，吳彩娥，李元瑞. ?物料水分含量對油脂超臨界C02萃取的影晌[C]. 第五屆超臨界流體技術(shù)及應(yīng)用研討會論文集，2005：146-149.