謝東淇，劉 琦，蘇澤智，衛(wèi)帥毅，梅軍四，王 健，萬 露，楊公社，胡建宏

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100)

?；撬崤c抗生素復(fù)合劑對(duì)豬精液常溫保存效果的影響

謝東淇，劉 琦，蘇澤智，衛(wèi)帥毅，梅軍四，王 健，萬 露，楊公社，胡建宏

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100)

牛磺酸(Tau)具有良好的抗氧化性，為研究Tau與抗生素聯(lián)合使用對(duì)豬精液常溫保存效果的影響，以不含抗生素Modena稀釋液為對(duì)照基礎(chǔ)液設(shè)計(jì)3組試驗(yàn)，設(shè)Modena稀釋液+ 慶大霉素(2×105IU)+復(fù)方新諾明(2.5×104IU)為處理 1，Modena基礎(chǔ)液上分別添加0.5、1、5和10 mmol/L的Tau 為處理 2，處理 1配伍處理 2則為處理 3，每24 h檢測(cè)精子活率、頂體完整率、丙二醛(MDA)濃度以及總抗氧化能力(T-AOC)，分析Tau與抗生素復(fù)合劑對(duì)豬精液常溫保存效果的影響。結(jié)果表明，處理3效果最好，處理 2 次之，處理 1最差，各處理間差異顯著，當(dāng)處理 3中Tau的添加量為5 mmol/L時(shí)，豬精液保存5 d后，精子活率為64.11%，頂體完整率為72.10%，T-AOC活性和MDA濃度分別為4.76 U/mL和1.42 nmol/mL。因此，Tau與抗生素復(fù)合劑可以提高豬精液的常溫保存效果，最適添加濃度為5 mmol/L。

?；撬?；抗生素；豬精液；常溫保存

豬精液常溫液態(tài)保存與冷凍精液相比，具有輸精后母豬繁殖成績(jī)好(受胎率、分娩率和窩產(chǎn)仔數(shù)高)、所需費(fèi)用低、操作程序簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)；從精液的保存效果考慮，常溫液態(tài)保存的精液更有利于豬的繁殖，能夠產(chǎn)生更大的經(jīng)濟(jì)效益[1]。近年來，有關(guān)豬精液常溫保存稀釋粉的研究不斷取得新進(jìn)展，但是相關(guān)技術(shù)仍然不成熟[2]，有待完善。

牛磺酸(taurine，Tau)是一種含巰基氨基酸，主要為中樞神經(jīng)系統(tǒng)提供營(yíng)養(yǎng)，與胚胎發(fā)育、提高視力和保護(hù)肝臟等有關(guān)。有研究[3]表明，?；撬峥赏ㄟ^雙向調(diào)節(jié)細(xì)胞膜上Ca2+，調(diào)節(jié)細(xì)胞膜對(duì)陽(yáng)離子的通透性，保護(hù)膜上磷脂層完整性，降低細(xì)胞內(nèi)氧自由基水平，增強(qiáng)抗氧化酶活性，對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用，所以Tau不僅具有保護(hù)細(xì)胞質(zhì)膜通透性、維持滲透壓、消除自由基的作用，也能夠保護(hù)細(xì)胞膜完整率?？寡趸瘎┰谪i精液保存方面起到清除自由基、防止精子氧化損傷的作用，但目前對(duì)于Tau的抗氧化研究主要在羊和犬的精液冷凍保護(hù)[4-5]，而對(duì)于豬精液常溫保存尤其是與抗生素聯(lián)合使用方面鮮有報(bào)道，本研究通過檢測(cè)精子活率、頂體完整率、T-AOC和MDA指標(biāo)，分析Tau與抗生素聯(lián)合使用對(duì)豬精液常溫保存效果的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

?；撬?w≥98%)購(gòu)自上海源葉生物技術(shù)有限公司，硫酸慶大霉素(針劑型，5 mL/支，8×104IU)由陜西必康制藥有限公司生產(chǎn)；復(fù)方新諾明(粉劑，25 g/100 g，20×105IU)，上海騎驃動(dòng)物保健品公司。

1.2 精液的采集

試驗(yàn)精液來源于武功縣山佳種豬場(chǎng) 20 月齡健康成年杜洛克種公豬，通過手握法采精，收集中段富含精子部分，過濾后保存于保溫杯中，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。選取色澤和氣味正常、精子活率在80%以上、密度為3×108～5×108mL-1的精液，備用。

1.3 精液稀釋與保存

將合格精液分成 3 組，稀釋液配置：對(duì)照組為Modena基礎(chǔ)液，處理 1 在Modena基礎(chǔ)液中加入慶大霉素(2×105IU)和復(fù)方新諾明(2.5×104IU)，處理 2 在Modena基礎(chǔ)液的基礎(chǔ)上加入不同濃度Tau，處理 3 為處理 1 和處理 2 的配伍，待精液溫度與稀釋液溫度一致時(shí)，對(duì) 3 個(gè)處理分別進(jìn)行1∶5倍數(shù)稀釋，再將其包裹于 5 層干毛巾內(nèi)，待其逐漸降溫至室溫后放入 17 ℃ 恒溫箱，每 12 h輕微翻轉(zhuǎn)精液 1 次，防止精子沉淀。

1.4 測(cè)定指標(biāo)

每隔 24 h檢測(cè) 1 次各指標(biāo)，每個(gè)指標(biāo)重復(fù) 3 次。

1.4.1 精子活率 檢測(cè)前輕微翻動(dòng)精液瓶，使沉淀精子混勻，采用 1 000 μL移液槍吸取 1 mL精液于 2 mL離心管中，再將離心管置于 17 ℃水浴鍋緩慢升溫至 37 ℃后水浴 1 min，吸取 10 μL精液于 37 ℃恒溫加熱板的載玻片上，蓋好蓋玻片后 40 倍顯微鏡觀察 5 個(gè)視野下精子直線運(yùn)動(dòng)情況，記錄數(shù)據(jù)。

1.4.2 頂體完整率、T-AOC與MDA濃度 試驗(yàn)操作分別遵照南京建成生物工程研究所所售精子快速染色試劑盒、總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒與丙二醛(MDA)試劑盒的操作說明。

1.4.3 有效存活時(shí)間 以精子活率≥60%的最長(zhǎng)保存時(shí)間為準(zhǔn)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析(One-way ANOVA)，用Duncan’s多重比較分析差異顯著性。數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析2.1 不同處理對(duì)豬精液常溫保存精子活率的影響

由表 1 可知，當(dāng)精液保存 5 d后，處理 3 中精子活率均大于處理 1 和2，但組內(nèi)差異不顯著(P>0.05)；從圖 1 可以看出，處理 3 中，隨著Tau的添加量增加，5 d內(nèi)精子活率呈現(xiàn)先升高后降低的不規(guī)律變化，當(dāng)Tau的添加量為 5 mmol/L時(shí)，其精子活率顯著高于其他組(P<0.05)，效果最佳。

2.2 不同處理對(duì)豬精液常溫保存精子頂體完整率的影響

由表 2 可知，當(dāng)保存 3 d后，相同濃度下處理 3 精子頂體完整率大于其他 2 個(gè)處理，差異不顯著(P>0.05)；從圖 2可以看出，處理 3 中Tau添加量為 1和 5 mmol/L時(shí)，Tau能有效提高精子頂體完整率，其中添加量為 5 mmol/L時(shí)效果最好。

2.3 不同處理對(duì)豬精液常溫保存精液T-AOC濃度的影響

由圖 3 可知，隨著Tau添加量逐漸增大，T-AOC活性先顯著增大(P<0.05)，后急劇下降(P<0.05)，添加量為0.5、1、5 mmol/L的處理 3 以及添加量為1、5 mmol/L的處理 2 T-AOC活性均顯著高于不含Tau的處理 1(P<0.05)，其中 5 mmol/L Tau的效果最佳(P<0.01)，而同時(shí)添加抗生素和Tau的處理 3 效果顯著優(yōu)于單獨(dú)添加Tau的處理 2(P<0.05)，添加 10 mmol/L的處理組效果最差。

表1 不同處理組常溫保存后的豬精子活率Table 1 Boar sperm motility under different treatments %

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).下同。

Note:Different lowercase letters in the same column indicate significant difference atP<0.05.The same as below.

圖1 處理3中不同濃度Tau常溫保存后的豬精子活率Fig.1 Boar sperm motility under different concentrations of Tau in group 3

圖2 處理 3 中不同濃度Tau常溫保存后的豬精子頂體完整率Fig.2 Boar sperm acrosome integrity under different concentrations of Tau in group 3

Table 2 Boar sperm motility under different treatments %

圖3 精液保存 5 d各處理組中T-AOC活性Fig.3 T-AOC activity of treatments measured in 5 days during semen preservation

2.4 不同處理對(duì)豬精液常溫保存精液MDA濃度的影響

如圖 4 可知，添加 0.5 mmol/L Tau不能有效地降低保存5 d的精液MDA濃度(P>0.05)，而當(dāng)Tau的添加量達(dá)到 1和 5 mmol/L時(shí)，配合抗生素組顯著降低精液中的MDA濃度(P<0.05)，其中 5 mmol/L為最適添加量，效果明顯好于其他處理組(P<0.01)，當(dāng)添加量達(dá)到 10 mmol/L時(shí)，精液中的MDA濃度顯著高于其他處理組(P<0.05)。

3 討 論

3.1 不同濃度Tau對(duì)豬精液常溫保存精子活率和頂體完整率的影響

活率是評(píng)價(jià)精子質(zhì)量的最直觀標(biāo)準(zhǔn)，而頂體完整率在一定程度上反應(yīng)精子的質(zhì)量。Vasco[6]研究發(fā)現(xiàn)，由于精液在常溫保存中不可避免地受到空氣中氧氣的影響，精子代謝產(chǎn)生高濃度的活性氧(ROS)。正常生理狀況下，豬精液中含有自身的抗氧化體系，能去除部分ROS造成的氧化損傷，當(dāng)ROS的產(chǎn)生速度與其去除速度不平衡時(shí)，氧化應(yīng)激也由此產(chǎn)生[7]，發(fā)生一系列的脂質(zhì)過氧化等有害反應(yīng)，導(dǎo)致精子的質(zhì)膜、頂體以及其他結(jié)構(gòu)功能受到損傷[8-9]。因此，添加抗氧化劑理論上可以抑制脂質(zhì)過氧化的發(fā)生，提高精子活率。Cerolini等[10]通過添加維生素E發(fā)現(xiàn)，精液稀釋劑中添加抗氧化劑能夠抑制精子質(zhì)膜的脂質(zhì)過氧化，提高活率。近年來，Tau不斷地被用于羊及牛的精液冷凍保存中[11-12]。Sanchez-Partida等[13]研究認(rèn)為，Tau具有調(diào)節(jié)滲透壓和抗氧化的作用，精液中添加抗氧化物質(zhì)能夠起到很好的延長(zhǎng)精子保存時(shí)間的效果。本試驗(yàn)結(jié)果表明，5 mmol/L的Tau可以延長(zhǎng)精子的保存時(shí)間及提高頂體完整率，且配合抗生素處理 3 效果更顯著，分別單獨(dú)添加抗生素組和Tau組效果較差，其中單獨(dú)添加抗生素組效果最差。其原因可能是由于?；撬崤c 2 種抗生素聯(lián)合使用對(duì)精子具有某種良性調(diào)節(jié)作用。慶大霉素屬于氨基糖苷類抗生素，為強(qiáng)極性陽(yáng)離子，不被生物體代謝，在抑制細(xì)菌的同時(shí)對(duì)細(xì)胞也有一定毒害，慶大霉素和新霉素可明顯抑制鈣離子內(nèi)流，?；撬崮苷{(diào)節(jié)鈣離子的穩(wěn)定性，既能抑制鈣離子內(nèi)流，也能在某種情況下促進(jìn)鈣離子內(nèi)流，兩者一定程度上存在拮抗作用[14]，劉海瑛[15]研究證實(shí)牛磺酸能拮抗慶大霉素的耳毒性，可能正由于?；撬釋?duì)抗生素的一定拮抗作用而減輕對(duì)精子的毒害。同時(shí)，牛磺酸與抗生素可能在一定程度上能協(xié)調(diào)精子膜內(nèi)外的Ca2+和Na2+平衡，有利于精子細(xì)胞膜完整。Tau具有抗氧化功能，是一種很有前景的細(xì)胞保護(hù)劑[16]，Sanchez-Partida[13]等認(rèn)為 25～50 mmol/L Tau能提高冷凍精子的運(yùn)動(dòng)性，陳寵霞等[17]認(rèn)為10 mmol/L Tau不僅能夠提高冷凍兔精子的運(yùn)動(dòng)性，還可以顯著提高兔精子的頂體完整率，與本試驗(yàn)結(jié)果類似。但是本試驗(yàn)Tau添加量達(dá)到 10 mmol/L時(shí)，精子活率和頂體完整率顯著降低，這可能是一方面因?yàn)椴煌锓N精子的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量和抗氧化酶含量不同，并且不同保存方式對(duì)Tau的需求量不一樣導(dǎo)致[18-19]，而 10 mmol/L在本試驗(yàn)中已超過豬精液的耐受范圍，反而對(duì)精子造成額外損傷,過量的Tau可能對(duì)稀釋液的滲透壓造成影響，導(dǎo)致精子的不正常損傷。胡琦等[20]研究認(rèn)為，當(dāng)牛磺酸濃度過大(100 mmol/L)時(shí)，能抑制細(xì)胞的增值和移行；葛健等[21]研究添加?；撬釋?duì)體外兔角膜內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)濃度超過 6%時(shí)部分細(xì)胞出現(xiàn)死亡，這與本研究結(jié)果基本一致。

圖4 精液保存5 d各處理組中MDA濃度Fig.4 MDA content of treatments measured in 5 days during semen preservation

3.2 不同濃度Tau對(duì)豬常溫保存精液T-AOC與MDA含量的影響

MDA是精子膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物之一，可以反映精子過氧化反應(yīng)的程度[22]，而T-AOC是反應(yīng)體系中總抗氧化能力的指標(biāo)，可以直接反映出精子抗氧化水平即精子對(duì)抗自由基攻擊的能力[23]。Motlagh等[24]和Chanapiwat等[25]分別在精液中添加迷迭香和生育酚2種抗氧化物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)精子存活時(shí)間得到延長(zhǎng)，ROS反應(yīng)和MDA含量得到控制，說明抗氧化劑能很好的抑制精子氧化反應(yīng)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在精液稀釋液中添加 5 mmol/L的Tau能顯著降低MDA的含量，同時(shí)提高精液中T-AOC的濃度，符合Tau的抗氧化特性。Aly等[26]研究表明，Tau可以減少硫丹對(duì)大鼠造成的精子活力降低，提高精液的抗氧化能力。朱宇旌等[27]發(fā)現(xiàn)，在公豬日糧中添加Tau可以有效地降低精液中MDA含量，提高SOD、GSH-PX活性。彭杰等[28]在大鼠胰島細(xì)胞外液培養(yǎng)基中添加Tau也發(fā)現(xiàn)Tau處理組能夠顯著提高T-AOC并降低MDA含量，與本研究結(jié)果一致。本研究中，當(dāng)Tau添加量為 10 mmol/L時(shí)，T-AOC和MDA同樣出現(xiàn)較大的浮動(dòng)，這與精子活率及頂體完整率變化基本一致，可能是由于添加Tau過量引起。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)Tau配合抗生素時(shí)效果明顯好于單獨(dú)使用抗生素或者Tau的處理，原因可能有以下兩方面。一方面，精液中很難避免微生物[29]，而常溫條件(17 ℃)加上稀釋液含有葡萄糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為細(xì)菌的生存提供條件，尤其是諸如大腸桿菌等細(xì)菌可以短時(shí)間內(nèi)對(duì)精子產(chǎn)生巨大傷害[30-31]，因此抗生素的添加可以大幅度提升精子保存效果，本試驗(yàn)中處理 3 的效果好于處理 2 符合此原理，但是處理 1 效果不如處理 2 這可能是因?yàn)榫簶悠分屑?xì)菌含量較少，抑制細(xì)菌而延長(zhǎng)精液保存時(shí)間的效果不如抗氧化劑明顯，因?yàn)榭寡趸瘎┰诰罕４嬷衅鸬街陵P(guān)重要的作用，抗氧化劑不僅可以加強(qiáng)精液中的抗氧化能力，作為豬精液冷凍保護(hù)劑，還可以保護(hù)精子的染色體等內(nèi)在物質(zhì)，延長(zhǎng)精液保存時(shí)間[32]，這可能也是造成兩組差異的原因之一。另一方面，抗生素能抑制氧化反應(yīng)，Priuska等[33]證明慶大霉素是鐵的螯合劑，鐵作為生物氧化劑在自由基反應(yīng)中起催化作用，慶大霉素的螯合一定程度能降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生MDA等副產(chǎn)物，與?；撬嵩诳寡趸矫嫫鸬絽f(xié)同作用。

4 結(jié) 論

當(dāng)Tau添加濃度為 5 mmol/L時(shí)，配合 2×105IU 慶大霉素與 2.5×104IU 復(fù)方新諾明在豬精液常溫保存時(shí)，頂體完整率和T-AOC的提高及MDA的降低效果最為顯著，說明適量的Tau可以提高豬精液常溫保存效果，而對(duì)于Tau與抗生素協(xié)同作用的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯：顧玉蘭 Responsible editor:GU Yulan)

Effect of Taurine and Antibiotics Compounding Agent on Quality of Boar Semen Stored at Normal Temperature

XIE Dongqi, LIU Qi,SU Zezhi, WEI Shuaiyi,MEI Junsi,WANG Jian, WAN Lu, YANG Gongshe and HU Jianhong

(College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi 712100, China)

Tau has good oxidation resistance.In order to investigate the effect of compatibility of Tau and antibiotic on boar semen stored at room temperature, Modena without antibiotic as control,three groups were designed,Modena with gentamicin(2×105IU) and Cotrimoxazole(2.5×104IU) as group1, Modena with Tau (0.5 mmol/L,1 mmol/L,5 mmol/L,10 mmol/L) as group 2, and the group3 was diluted with Modena containing both Tau and antibiotic, and sperm motility, acrosome integrity, total antioxidative capacity (T-AOC)activity and malondialdehyde (MDA) content were measured and analyzed.The result showed that Modena supplemented with 5 mmol/L Tau could improve boar sperm motility, effective survival time and acrosome integrity, decrease MDA content and T-AOC activity.The results showed that group 3 was the best, group 2 comes second, and group 1 the worst, the effect had significant difference among them.After 5 days preservation, the group 3 showed that sperm motility, acrosome integrity were 64.11, 72.10%, respectively, T-AOC activity and MDA content were 4.76 U/mL and 1.46 nmol/mL, respectively.In conclusion, Modena supplemented with Tau and antibiotic reduced the oxidative stress and improved the sperm quality of boar semen during liquid storage at normal temperature, and 5 mmol/L Tau was the optimum concentration.

Taurine; Antibiotics; Boar sperm; Room temperature preservation

2016-01-20 Returned 2016-04-12

The National Technology System of Pig Industry of China (No.CARS-36); the Yangling Science and Technology Planning Project of China (No.2014NY-22); the Experimental Demonstration Station and Technology Achievement Promotion Project of Northwest A&F University(No.TGZX2015-18).

XIE Dongqi, male,master student.Research area: animal reproductive physiology.E-mail: axdqxdq@126.com

HU Jianhong, male,Ph.D,professor.Research area:animal reproductive physiology.E-mail: hjh19732008@126.com

日期：2017-06-05

2016-01-20

2016-04-12

國(guó)家生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-36)；楊凌示范區(qū)科技計(jì)劃(2014NY-22)；西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)示范站(基地)科技成果推廣(TGZX2015-18)。

謝東淇，男，碩士研究生，從事動(dòng)物生殖生理研究。E-mail: axdqxdq@126.com

胡建宏，男，博士，教授，主要從事家畜生殖生理調(diào)控研究。E-mail:hjh19732008@126.com

S814.3

A

1004-1389(2017)06-0820-07

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