孫 紅 蘇同兵 汪維紅 盧桂香于拴倉 張鳳蘭* 余陽俊 張德雙 趙岫云（ 北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京006； 北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，北京00097）

白菜葉片表皮蠟粉成分及合成相關(guān)基因表達(dá)分析

孫 紅1，2蘇同兵2汪維紅2盧桂香2
于拴倉2張鳳蘭2*余陽俊2張德雙2趙岫云2
（1北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京102206；2北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，北京100097）

為了解白菜葉片表皮蠟粉晶體結(jié)構(gòu)形態(tài)、成分及合成，以有蠟粉的R-o-18和無蠟粉的15E-545-2為試材，利用掃描電鏡觀察成熟期新鮮葉片表皮的晶體結(jié)構(gòu)；采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）分析二者在蠟粉成分上的差別，以峰面積為指標(biāo)，定量計算蠟粉組分含量。結(jié)果表明：5 000×下R-o-18上下表皮的蠟粉晶體均呈致密的面包屑狀，大小約為10 μm；15E-545-2則沒有觀察到類似結(jié)構(gòu)。GC-MS分析結(jié)果表明，R-o-18成熟期葉片表皮蠟粉成分中含酮類2種，占表皮蠟粉提取物的1.02%；醇類4種，占8.33%；烷烴10種，占55.09%；酯類2種，占26.34%。15E-545-2中檢測到酮類1種，占3.83%；醇類3種，占9.17%；脂肪酸4種，占23.29%；烷烴1種，占9.32%。蠟粉合成途徑Bra034583、Bra018412、Bra032670、Bra027907、Bra027906、Bra027904、Bra027902基因在兩個材料中都呈先升后降的表達(dá)趨勢；且蠟粉性狀顯現(xiàn)期在R-o-18中的表達(dá)均高于15E-545-2，初步證明此7個基因是與白菜葉片表皮蠟粉合成相關(guān)的基因。

白菜；表皮蠟粉；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；電鏡掃描；RT-PCR

白菜（Brassica rapa L.）是十字花科蕓薹屬蕓薹種作物（AA，2n=20），具有悠久的栽培歷史。我國是世界上公認(rèn)的白菜起源中心，種植面積廣，經(jīng)過長期的馴化和栽培，逐漸形成了豐富的多樣性，在我國蔬菜生產(chǎn)和周年供應(yīng)中占有主導(dǎo)地位。

植物蠟質(zhì)是對覆蓋于裸露在空氣中的植物組織表皮脂質(zhì)成分的一個集體稱呼（Cheng & Russell，2004），還包括地下的木栓質(zhì)基質(zhì)、愈傷組織、花粉粒以及種皮中的脂類（岑斌和王慧中，2009）。它是由親脂性化合物構(gòu)成的疏水層，一般呈綠灰色、灰白色霜狀，在十字花科蔬菜作物上稱之為蠟粉（張曦，2013）。植物表皮蠟質(zhì)因其晶體結(jié)構(gòu)可以有效反射紫外線（Cameron et al.，2005），能夠防止過量紫外線的傷害從而保護(hù)植物免受生物或非生物的不利因素的危害（曾瓊 等，2013；楊柳依 等，2016）。但是，對于以葉片為產(chǎn)品的葉菜類蔬菜，植株表面有無蠟粉通常能決定其商品品質(zhì)（牟向麗等，2013），無蠟粉葉片往往與優(yōu)質(zhì)相關(guān)聯(lián)，更受消費(fèi)者歡迎。鑒于蠟粉在白菜品質(zhì)育種中扮演重要的角色，有必要對白菜蠟粉進(jìn)行生理生化方面的研究探索。

有關(guān)模式植物擬南芥中的蠟質(zhì)合成、運(yùn)輸?shù)南嚓P(guān)機(jī)理研究較多（Broun et al.，2004；連金番 等，2011），特別是在抗旱性方面，水稻（Cervantes et al.，2002）、玉米、小麥（張蕓蕓 等，2014）上的研究也有許多，但是白菜中并不多見。擬南芥蠟質(zhì)合成相關(guān)基因有20多個，包含蠟質(zhì)直接合成、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控和激素水平調(diào)控相關(guān)等多個層面的基因；其中直接控制擬南芥蠟質(zhì)合成的基因分別為位于醇合成途徑上的At4g33790、At5g37300和位于烷烴合成途徑上的At1g02205、At1g57750（圖1）。本試驗(yàn)采用掃描電鏡觀察成熟期白菜葉片表皮晶體結(jié)構(gòu)，并采用氣相-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）分析蠟粉組分及含量；利用熒光定量PCR技術(shù)對白菜中與擬南芥2條蠟質(zhì)合成途徑中4個關(guān)鍵基因的同源基因進(jìn)行表達(dá)分析，為進(jìn)一步了解控制白菜中蠟粉合成的機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

圖1 擬南芥中的蠟質(zhì)合成途徑

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2016年在北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心進(jìn)行。供試材料為歐洲白菜R-o-18，該品種成熟期葉片表面呈現(xiàn)白色霜狀；無蠟粉材料15E-545-2是R-o-18通過EMS誘變得到的；均由北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心白菜遺傳育種課題提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 表皮蠟粉電鏡觀察 供試材料生長至成熟期，用鋒利的刀片分別在有蠟粉和無蠟粉新鮮植株葉片相同的中心位置取3 mm×4 mm的平面，注意不要觸碰到待觀察的部位。3次重復(fù)。將制好的平面直接粘在樣品臺上，進(jìn)行導(dǎo)電處理。使用日本島津公司的S-3400N掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.2 表皮蠟粉化學(xué)成分檢測 以三氯甲烷為有機(jī)溶劑提取葉片表皮蠟粉。分別稱取成熟期的有蠟粉和無蠟粉材料的新鮮葉片各20 g，依次在分別盛有80 mL室溫三氯甲烷和60 ℃的三氯甲烷中浸提1 min，合并提取液到1個燒杯中，將燒杯置于通風(fēng)櫥中，待提取液揮發(fā)蒸干后分別收集提取物到青霉素瓶中，加入5 μg正二十四烷作為內(nèi)參，并加入100 μL BSTFA作為衍生試劑，用橡膠塞蓋好并用封口膜密封后放置在70 ℃水浴中衍生1 h，衍生后的樣品用氮吹儀吹去衍生試劑，加入1 mL三氯甲烷，進(jìn)行GC-MS分析。2次重復(fù)。

應(yīng)用島津GCMS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測。色譜柱：DB-5MS，石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。色譜條件為載氣：He（99.999%）；進(jìn)樣口溫度：270 ℃；柱流速：14.0 mL·min-1，恒定流速；分流比：10∶1；離子源溫度：200 ℃；傳輸桿溫度：280 ℃；溶劑延遲時間：4 min。升溫程序：總時間43 min，初始溫度50 ℃，保持1 min，然后以20 ℃·min-1升溫至170 ℃，保持2 min，再以5 ℃·min-1升溫至300 ℃，保持8 min。依據(jù)各化合物的沸點(diǎn)不同從而把化合物依次分離出來。經(jīng)過GC-MS檢測，解析得到離子峰，依據(jù)質(zhì)譜庫鑒定離子。

1.2.3 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 同時種植R-o-18和15E-545-2各20株，待植株長到兩葉一心（4月5日）時開始取材，每隔8 d取1次，共取4次樣。利用天根公司的RNA Prep Pure植物總RNA提取試劑盒（離心柱型）提取植物的總RNA。3次重復(fù)。

RNA反轉(zhuǎn)錄采用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒，具體操作：在RNase-Free離心管中加入2 μL 5×gDNA Eraser Buffer、1 μL gDNA Eraser、2 μL總RNA、5 μL RNase-Free ddH2O，混勻；在PCR儀上42 ℃加熱2 min；向反應(yīng)物中加入4 μL 5×PrimeScriptⅡ、1 μL Prime Script RT Enzyme MixⅠ、1 μL RT Primer Mix、4 μL RNase-Free dH2O，混勻；放入PCR儀37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。用RNase-Free ddH2O將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA稀釋到150 ng·μL-1待用。

Real-time PCR引物序列由Brassica Database查詢得到，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，由北京博邁德生物公司合成。

Real-time PCR體系：上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 3 μL，Light Cycler 480 SYBR GreenⅠMaster 5 μL。Real-time PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火12 s，72 ℃延伸15 s，40個循環(huán)。利用Light Cycler 480SW軟件處理數(shù)據(jù)，軟件會自動計算標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值等，再利用Microsoft Excel 2010軟件繪制基因表達(dá)差異圖。

1.2.4 蠟粉合成相關(guān)基因的熒光定量檢測 通過TAIR（http：//www.arabidopsis.org/）獲得模式植物擬南芥中與蠟質(zhì)合成相關(guān)的基因At4g33790、At5g37300、At1g02205、At1g57750，利用Brassica Database（http：//brassicadb.org/brad/）獲得與蠟粉合成相關(guān)的白菜中同源基因及引物序列（表1）。

表1 擬南芥與白菜中蠟質(zhì)合成相關(guān)基因及其RT-PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 白菜葉片表皮蠟粉電鏡觀察結(jié)果

在掃描電子顯微鏡100×下觀察，15E-545-2葉片上下表皮較光滑，未觀察到蠟粉層（圖2-A、B），R-o-18葉片上下表皮均呈現(xiàn)致密的蠟粉層（圖2-C、D）；1 000×下15E-545-2葉片上下表皮及氣孔周圍未觀察到蠟粉晶體（圖3-A、B），R-o-18上下表皮及氣孔周圍則觀察到豐富的蠟粉晶體（圖3-C、D）；5 000×下15E-545-2上下表皮及氣孔周圍未發(fā)現(xiàn)蠟粉晶體（圖4-A、B），R-o-18上下表皮及氣孔周圍觀察到豐富的蠟粉晶體，呈面包屑狀，大小約為10 μm（圖4-C、D）。

2.2 白菜葉片表皮蠟粉成分

由圖5可以看出，本試驗(yàn)采用的程序和方法較好地分離出了R-o-18和15E-545-2葉片表皮蠟粉成分。

圖2 白菜葉片表皮蠟粉100×電鏡觀察結(jié)果A，B分別為15E-545-2上、下表皮；C，D分別為R-o-18上、下表皮；下圖同。

圖3 白菜葉片表皮蠟粉1 000×電鏡觀察結(jié)果

圖4 白菜葉片表皮蠟粉5 000×電鏡觀察結(jié)果

圖5 R-o-18和15E-545-2葉片表皮蠟粉成分色譜圖A為R-o-18：1，酮類；5，醇類；7，C14烷烴；9，C15烷烴；10，C16烷烴；11，4-叔丁基-2-（1-甲基-2-硝基乙基）環(huán)己酮；12，C18烷烴；14，C20烷烴；16，C28烷烴；17，C19烷烴；18，C24烷烴（內(nèi)參）；23，C36烷烴；26，C35烷烴；27，醇類；31，酯類；32，C40烷烴；33，1，2-十六烷二醇；36，酯類；38，1，3-三十烷二醇。B為15E-545-2：1，酮類；9，C15烷烴；12，1-四十烷醇；17，C16脂肪酸；20，C18脂肪酸；22，C24烷烴（內(nèi)參）；23，C20脂肪酸；32，C16脂肪酸；34，C28醇；38，C30醇。箭頭所示為剔除溶劑成分后的蠟粉成分色譜峰。

白菜表皮蠟粉的主要成分包括特長鏈烷烴、酯、脂肪醇和酮。R-o-18葉片表皮蠟粉中檢測到烷烴10種，酮2種，酯2種，醇4種；烷烴的碳原子數(shù)變化范圍為C14～C54，包括C14、C15、C16、C18、C19、C20、C28、C35、C36、C40；4種醇中有2種不能確定名稱，另外2個分別為1，2-十六烷二醇、1，3-三十烷二醇；2種酯不能確定名稱；2種酮中1種是4-叔丁基-2-（1-甲基-2-硝基乙基）環(huán)己酮，另1種不能確定名稱。此結(jié)果與張曦（2013）的研究結(jié)果存在差異，可能是由于不同材料間的蠟粉成分含量存在差異（Chen et al.，2003；Broun et al.，2004），環(huán)境因素例如干旱脅迫等亦可能導(dǎo)致表皮蠟粉成分的變化（張蕓蕓等，2014）。

圖6 白菜葉片表皮蠟粉合成相關(guān)基因的RT-PCR檢測結(jié)果

無蠟粉材料15E-545-2與有蠟粉材料R-o-18葉片表皮蠟粉成分差異如表2所示。二者的成分差異主要表現(xiàn)在烷烴和酯類上，這與前人推斷烷烴合成途徑可能是蠟質(zhì)合成的主要途徑一致（Beattie &Marcell，2002；Chen et al.，2003）。

2.3 白菜葉片表皮蠟粉合成相關(guān)基因的RT-PCR檢測結(jié)果

由圖6可以看出，Bra034583、Bra011470、Bra018412、Bra032670、Bra027907、Bra027906、Bra027904、Bra027902這8個基因在有蠟粉材料和無蠟粉材料中的表達(dá)量大多呈先升高后下降的趨勢，表達(dá)量上調(diào)大多數(shù)出現(xiàn)在4月21日（蠟粉性狀明顯期）；在蠟粉性狀出現(xiàn)前相關(guān)基因的表達(dá)量差異沒有明顯的規(guī)律性。進(jìn)一步比較4月21日的相對表達(dá)量（圖7），發(fā)現(xiàn)Bra034583、 Bra018412、Bra032670、Bra027907、Bra027906、Bra027904、Bra027902這7個基因在R-o-18中的表達(dá)量均高于15E-545-2，說明這7個基因可能與蠟粉的合成有密切關(guān)系。其中，Bra027906、Bra027904、Bra027902的表達(dá)量相對較高，可能在控制蠟粉合成中功能作用較其他基因更大；此外，這3個基因均是位于烷烴合成通路上的基因，結(jié)合GC-MS分析結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了烷烴合成途徑可能是白菜葉片表皮蠟粉合成的主要途徑，有無蠟粉這一性狀很可能是位于烷烴合成途徑上的某個基因。

Bra034583是擬南芥醇合成途徑中與控制成醇酯酰Co-A還原酶合成基因CER4在白菜中的同源基因，所以Bra034583的基因功能很可能也是調(diào)控成醇酯酰Co-A的合成。同樣，Bra018412基因是擬南芥醇合成途徑中蠟質(zhì)合成酶基因AT5G37300的同源基因；Bra032670是合成醛脫羰基反應(yīng)酶基因CER1的同源基因；Bra027907、Bra027906、Bra027904、Bra027902是合成中鏈烷烴羥化酶基因CYP96A15的同源基因。結(jié)合RT-PCR檢測、電鏡觀察以及蠟質(zhì)成分分析結(jié)果，當(dāng)蠟粉性狀開始明顯（4月21日）時，Bra034583基因的表達(dá)量上調(diào)致使促進(jìn)醇合成途徑上初級醇的合成增多；Bra018412基因在有蠟粉材料中的表達(dá)上調(diào)，在無蠟粉材料中可能受蠟質(zhì)合成途徑外基因共同調(diào)控作用導(dǎo)致抑制；另一條合成途徑上的Bra032670、Bra027907、Bra027906、Bra027904、Bra027902基因表達(dá)上調(diào)，致使表型結(jié)構(gòu)上有蠟粉材料可以觀察到清晰的蠟粉晶體結(jié)構(gòu)，蠟粉主要成分含量也都較無蠟粉材料高。初步證明這7個基因是與白菜葉片表皮蠟粉合成相關(guān)的基因。

表2 R-o-18和15E-545-2葉片表皮蠟粉各組分相對含量

圖7 7個基因在4月21日的RT-PCR檢測結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)在無蠟粉材料中也檢測到了蠟粉的一些組分，這與李紅蓮（2014）在紅菜薹無蠟粉材料中也觀察到了蠟粉晶體結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果一致，推斷白菜無蠟粉突變體植株可能是控制蠟粉合成調(diào)控的基因受到了阻斷，導(dǎo)致蠟粉合成通路受阻，但仍有少量肉眼看不到的蠟粉成分。

本試驗(yàn)初步證實(shí)基因Bra034583、Bra018412、Bra032670、Bra027907、Bra027906、Bra027904、Bra027902與白菜葉片表皮蠟粉合成有關(guān)；基因Bra027899、Bra027898、Bra027897在R-o-18和15E-545-2兩份材料上的表達(dá)沒有呈現(xiàn)出規(guī)律性，關(guān)于其在有蠟粉材料和無蠟粉材料上的表達(dá)仍需進(jìn)一步研究。另外，盡管從表達(dá)趨勢上看相關(guān)基因大多呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，但是Bra018412、Bra011470、Bra032670在無蠟粉材料中的表達(dá)呈現(xiàn)出如上趨勢后又驟然高出有蠟粉材料，具體原因尚未可知，需進(jìn)一步探究。

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Analysis of Leaf Cuticular Wax Composition of Brassica rapa L. and Related Gene Expression

SUN Hong1，2，SU Tong-bing2，YU Shuan-cang2，ZHANG Feng-lan2*，YU Yang-jun2，ZHANG Deshuang2，ZHAO Xiu-yun2，WANG Wei-hong2，LU Gui-xiang2
（1College of Plant Science and Technology，Beijing College of Agriculture，Beijing 102206，China；2Beijing Vegetable Research Center，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100097，China）

In order to understand the cuticular wax structure morphology，components and compound of Brassica rapa L.，this paper took ‘R-o-18’（in waxy）and ‘15E-545-2’（in glossy）as material and observed the crystal texture of fresh leaves cuticule by scanning electron microscope，analyzed the differences between these 2 wax components with GC-MS，and quantitatively calculated wax content taking peak area as target．The results showed that the waxy crystals on both side of ‘R-o-18’ leaf surface showed a dense breadcrumbs-like structure．5 000 times could clearly see the crystal showing breadcrumbs，and the size was about 10 μm. No similar structure was observed on ‘15E-545-2’．The results of GCMS showed that there were 2 ketones in wax powder of ‘R-o-18’，accounting for 1.02% of the extract of epidermal wax powder．And 10 alkanes accounted for 55.09%，4 alcohols accounted for 8.33%，2 esters accounted for 26.34%，respectively．Fatty acid was the major component of ‘15E-545-2’，accounting for 23.29%．And ketone，alcohol，alkane accounted for 3.83%，9.17%，9.32%，respectively．Seven genes（Bra034583，Bra018412，Bra032670，Bra027907，Bra027906，Bra027904，Bra027902）mentioned above in both material showed the tendency of increasing first then declining．And in the waxy traits appearing period，the above mentioned genes expression in ‘R-o-18’ was higher than that in ‘15E-545-2’．These results preliminary proved that these 7 genes did paly roles in synthesis of leaf cuticular wax．

Brassica rapa L. ；Cuticular wax；GC-MS；Scanning electron microscope；RT-PCR

孫紅，碩士研究生，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：xinersunhong@126.com

*通訊作者（Corresponding author）：張鳳蘭，女，研究員，博士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：zhangfenglan@nercv.org

2017-02-27；接受日期：2017-06-13

科技部“十三五”重點(diǎn)研發(fā)項目（2016YFD0101701，2016YFD0100506），國家自然科學(xué)基金項目（31401875，31171970），北京市自然科學(xué)基金項目（6172008，6154025）