趙 帥，羅文巧，王 聰，吳洪啟，汪 勇，王中華,權(quán) 力

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

植物表皮蠟質(zhì)是覆蓋在植物表面與外界環(huán)境之間的一層疏水性保護屏障，主要由超長鏈脂肪酸及其衍生物如脂肪酸、烷烴、初級醇、醛、二酮和酯等化合物組成[1]，可以起到防止水分的非氣孔性散失，進而增強植物抵御干旱的能力[2]。除此之外，表皮蠟質(zhì)在植物抵抗病菌入侵、昆蟲吞食[3]以及紫外輻射、霜凍傷害[4-5]等生物和非生物脅迫中也表現(xiàn)出重要的作用。表皮蠟質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)會因物種的不同或同種植物的器官不同，而表現(xiàn)出不同的類型，蠟質(zhì)晶體的結(jié)構(gòu)主要有柱狀、片狀、管狀、線狀等，并且蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的差異主要由構(gòu)成蠟質(zhì)晶體的化學(xué)成分決定，片狀晶體主要含有初級醇等成分，而管狀晶體通常含有大量的 β-二酮[6]。同時，蠟質(zhì)含量較高的植物表面往往呈白霜狀表型[7-8]。

小麥作為我國主要的糧食作物之一，其產(chǎn)量受到干旱、蟲害、病害等生物脅迫和環(huán)境脅迫的嚴重影響。近年來，大量關(guān)于植物表皮蠟質(zhì)以及其植物生物學(xué)功能的研究表明，植物表皮蠟質(zhì)對植物的生長發(fā)育有很大的影響[9-10]。在大麥的穎殼和葉片的表皮蠟質(zhì)成分中，穎殼的烷烴和二酮含量占比相對于葉片明顯升高[11]。對小麥的研究也表明，烷烴和二酮在穎殼表皮蠟質(zhì)組分中占有較大比例，而在葉片表皮蠟質(zhì)組分中初級醇占有絕對優(yōu)勢[12]。隨著小麥的生長發(fā)育，葉片的表皮蠟質(zhì)成分中烷烴和二酮的比例大幅提高，并且隨著生長進程的推進而繼續(xù)增加，但初級醇仍占據(jù)主導(dǎo)地位[12]。這些研究盡管對小麥一些器官的表皮蠟質(zhì)進行測定和分析，但僅選取了部分器官的表皮蠟質(zhì)，缺乏整體性。目前，對小麥不同器官整體蠟質(zhì)組分和含量的相關(guān)研究較少。本研究選取表皮蠟質(zhì)表型存在明顯差異的兩個小麥品種泰山4447和濟麥6097，對其7個不同器官的表皮蠟質(zhì)組分進行測定，利用掃描電鏡觀察蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)，通過比較小麥不同器官的表皮蠟質(zhì)組分和晶體結(jié)構(gòu)差異，并結(jié)合失水率檢測分析表皮蠟質(zhì)對葉片中水分的非氣孔性散失產(chǎn)生的影響，以期為揭示小麥蠟質(zhì)的合成機理以及蠟質(zhì)成分與抗逆性的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試材料為表皮蠟質(zhì)表型存在明顯差異的兩個小麥品種泰山4447(綠色表型)和濟麥6097(白霜狀表型)。試驗材料種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)西區(qū)科研試驗田，在小麥抽穗期采集穗部、葉鞘、穗下莖、旗葉、倒二葉、倒三葉和倒四葉七個器官的表皮蠟質(zhì)進行氣相色譜分析、掃描電鏡觀察和生理指標檢測。

1.2 方 法

1.2.1 蠟質(zhì)的提取

將一定樣品置于裝有25 mL三氯甲烷的50 mL玻璃燒杯中45 s，操作中輕輕搖晃燒杯加速蠟質(zhì)溶解，而后加入20 μL C24烷烴作為內(nèi)標并將燒杯放置于通風(fēng)廚中室溫蒸發(fā)。待三氯甲烷揮發(fā)完全后，重新加入5 mL三氯甲烷溶解并用膠頭滴管轉(zhuǎn)入15 mL樣品瓶，而后置于通風(fēng)廚中室溫靜置蒸發(fā)。待揮發(fā)完全后重新加入1 mL三氯甲烷并用漏斗過濾到GC樣品瓶中。三氯甲烷揮發(fā)完全后分別加入20 μL吡啶和20 μL雙(三甲基硅烷基)三氯乙酰胺[Bis-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide]，密封后放入70 ℃水浴鍋中衍生反應(yīng)1 h。反應(yīng)完全后用氮氣恒溫吹干儀(70 ℃)吹干GC樣品瓶后重新加入1 mL三氯甲烷溶解蠟質(zhì)，最后使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC/MS-QP2010,日本島津公司)和氣相色譜儀(GC/FID-2010PLUS，日本島津公司)分析蠟質(zhì)成分。每個樣品設(shè)三個重復(fù)。

1.2.2 蠟質(zhì)組分及含量測定

利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 (GC-MS) 檢測小麥各個器官表皮蠟質(zhì)成分的離子峰，然后檢索質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(http://metlin.scripps.edu/index.php)鑒定表皮蠟質(zhì)中各種化合物后得到標準樣品圖。利用氣相色譜-火焰離子化檢測儀 (GC-FID) 檢測蠟質(zhì)成分的離子峰，使用LabSultion軟件積分后獲得峰面積，以內(nèi)標的峰面積為標準分別對各種化合物定量分析。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 (GC-MS) 和氣相色譜-火焰離子化檢測儀 (GC-FID) 的檢測條件為：標準進樣量為1 L，設(shè)置進樣口溫度為280 ℃，調(diào)整分流比為5∶1，檢測器溫度為320 ℃；檢測程序如下：50 ℃保持2 min，以20 ℃· min-1升溫至240 ℃保持2 min，1.5 ℃· min-1升溫至320 ℃保持15 min。計算蠟質(zhì)中各組分的相對含量。

相對含量=各組分離子峰面積/總離子峰面積

1.2.3 蠟質(zhì)晶體觀察

將小麥各個器官的樣品用回形針分別固定在硬紙板上，將固定好的樣品放置在50 ℃烘箱中干燥備用。提前將導(dǎo)電膠粘貼在托盤上，將完全干燥的各個樣品切成2 mm×2 mm的正方形小塊，粘貼在導(dǎo)電膠上，抽真空后鍍金(E-1045,Hitachi)制樣,最后在場發(fā)式掃描電子顯微鏡(S-4800,Hitachi)上觀察各部位表皮蠟質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)。

1.2.4 葉片失水率檢測

選取抽穗期離體旗葉葉片(3片葉片為一組，設(shè)置3個重復(fù))，將樣品放置黑暗環(huán)境中1 h使葉片上氣孔完全關(guān)閉，取出葉片后立即用千分之一天平稱重并計時，該質(zhì)量為原始質(zhì)量，時間點為0 h，而后分別在0.5、1、2、3、4、5和 6 h時間點稱重。各時間點的失水率為原始質(zhì)量與各時間點處樣品質(zhì)量之差與原始質(zhì)量的比值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2007對數(shù)據(jù)進行整理，用DPS v 7.05軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥不同器官表皮蠟質(zhì)組分及其相對含量的差異

GC-MS和GC-FID分析結(jié)果顯示，兩小麥品種不同器官的表皮蠟質(zhì)主要包含初級醇、脂肪酸、脂肪醛、烷烴、二酮、酯等脂肪族化合物(表1)。兩品種葉片表皮蠟質(zhì)中初級醇的含量最高，相對含量為45.30%～76.87%。兩品種的穎殼表皮蠟質(zhì)中二酮含量最高，相對含量分別為58.38%和84.21%。泰山4447的穗下莖和葉鞘表皮蠟質(zhì)中烷烴相對含量最高，相對含量分別為50.04%和40.18%；二酮次之，相對含量分別為25.83%和26.56%。而濟麥6097的穗下莖和葉鞘表皮蠟質(zhì)中二酮含量最高，相對含量分別為55.20%和 44.94%；烷烴次之，相對含量分別為28.03%和29.54%。這說明兩個品種表皮蠟質(zhì)的組分一致，二者在各個器官中二酮和初級醇含量差異顯著，濟麥6097穗部、穗下莖和葉鞘等器官的表皮蠟質(zhì)中二酮含量顯著高于泰山4447，而初級醇的含量則相反。

表1 泰山4447和濟麥6097不同器官中蠟質(zhì)組分及其相對含量Table 1 Wax components and their relative contents on different organs of Taishan 4447 and Jimai 6097 %

表2 泰山4447和濟麥6097不同器官表皮蠟質(zhì)的碳鏈長度分布Table 2 Carbon chain length distribution of wax on different organs of Taishan 4447 and Jimai 6097 %

同一行數(shù)據(jù)后不同大、小字母分別表示不同器官中蠟質(zhì)相同組分在0.01和0.05水平差異顯著。TS：泰山4447；JM：濟麥6097。
Different capital and small letters following the values in same line indicate significant differences among different carbon chain length of components at 0.01 and 0.05 levels,respectively.TS：Taishan 4447;JM:Jimai 6097.

2.2 小麥不同器官表皮蠟質(zhì)各組分鏈長的分布

經(jīng)對兩小麥品種七個器官表皮蠟質(zhì)的GC-MS分析和質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索，一共鑒定出29種脂肪族化合物。初級醇主要是鏈長分布為C20～C32的偶數(shù)碳鏈醇；脂肪酸主要是鏈長分布在C20～C28的偶數(shù)碳鏈酸；脂肪醛主要是鏈長分布C22～C28的偶數(shù)碳鏈醛；烷烴主要是鏈長分布為C23～C33奇數(shù)碳鏈烷烴；二酮的碳鏈長度為C31，包含 β-二酮和OH-β-二酮兩種化合物及其同分異構(gòu)體；酯是主要鏈長分布為C40～C48偶數(shù)碳鏈酯(表2)。

在不同器官表皮蠟質(zhì)所含的初級醇中，C28醇相對含量在兩品種泰山4447和濟麥609葉片表皮蠟質(zhì)中占有絕對優(yōu)勢，相對含量分別為38.50%～69.00%和40.01%～70.95%。在不同器官表皮蠟質(zhì)所含的烷烴中，C31烷烴的相對含量最高，在泰山4447和濟麥609中分別為5.49%～25.09%和3.52%～14.59%，且在泰山4447各個器官中的相對含量均高于濟麥6097。在兩個小麥品種不同器官表皮蠟質(zhì)所含的二酮中，泰山4447的旗葉、穗下莖、葉鞘和穎殼中β-二酮含量與濟麥6097差異顯著，其中泰山4447和旗葉表皮蠟質(zhì)、穗下莖和葉鞘中β-二酮含量分別為11.38%、23.80%和24.93%，在濟麥6097中分別為18.77%、40.24%和48.80%。兩個品種的脂肪族化合物鏈長一致，而含量差異主要體現(xiàn)在β-二酮。濟麥6097的表皮蠟質(zhì)中β-二酮的相對含量顯著高于泰山4447。小麥各器官中表皮蠟質(zhì)中脂肪酸、脂肪醛和酯相對含量較小，因而這些化合物碳鏈的占比也較少。

2.3 小麥不同器官表皮蠟質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)

從掃描電鏡觀察結(jié)果看，泰山4447和濟麥6097各器官蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)存在明顯的差異，其中兩品種的旗葉近軸面(圖1A、1E)、倒二葉(圖1C、1D、1G、1H)、倒三葉(圖1I、1J、1M、1N)和倒四葉(圖1K、1L、1O、1P)的蠟質(zhì)晶體均呈現(xiàn)片狀結(jié)構(gòu)；旗葉遠軸面(圖1B、1F)的蠟質(zhì)晶體均呈現(xiàn)管狀結(jié)構(gòu)；穗下莖(圖1R、1U)和葉鞘(圖1S、1V)的蠟質(zhì)晶體均呈管狀結(jié)構(gòu)；差異明顯的是泰山4447的穎殼蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出管狀和片狀共存(圖1Q)，而濟麥6097的穎殼蠟質(zhì)晶體則為單一管狀結(jié)構(gòu)(圖1T)。

2.4 小麥品種旗葉的失水率差異

檢測結(jié)果顯示，泰山4447和濟麥6097的離體旗葉失水率均隨時間的增加呈明顯增加趨勢，在離體10 h至30 h兩個品種差異顯著，其中泰山4447和濟麥6097在離體30 h時的失水率分別為75.4%和68.2%(圖2)，說明泰山4447的旗葉水分非氣孔性散失快于濟麥6097。

圖2 泰山4447和濟麥6097旗葉的失水率Fig.2 Water loss rate of flag leaves of Taishan 4447 and Jimai 6097

3 討 論

植物表皮蠟質(zhì)會因物種、組織器官及生長發(fā)育的不同而存在較大差異，同時會受到光照、溫度等環(huán)境的影響[5]。本研究通過GC-MS和GC-FID測定了兩個小麥品種抽穗期不同器官表皮蠟質(zhì)的成分及含量，通過電鏡觀察各個器官表皮蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，泰山4447和濟麥6097的表皮蠟質(zhì)主要由29種化合物組成，包含7種初級醇、5種脂肪酸、4種脂肪醛、6種烷烴、5種酯和2種二酮。不同器官之間表皮蠟質(zhì)成分相似，但各成分相對含量存在顯著差異。汪 勇等[9,14]研究中發(fā)現(xiàn)，小麥葉片表皮蠟質(zhì)中烷烴的占比最高，穗和鞘等器官表皮蠟質(zhì)中二酮的占比最高。本研究中兩小麥品種在旗葉、倒二葉、倒三葉和倒四葉中烷烴含量最高,初級醇的含量次之，其中白霜狀表型濟麥6097的穗下莖、穗部和葉鞘中二酮含量最高，綠色表型泰山4447在穎殼表皮蠟質(zhì)中二酮含量最高，但是在鞘和穗下莖表皮蠟質(zhì)中烷烴含量高于二酮含量，且三個器官表皮蠟質(zhì)中二酮含量與濟麥6097相比顯著降低。Adamskin等也認為，白霜狀表型小麥表皮蠟質(zhì)中含有大量的二酮[12]。本研究中，綠色表型濟麥6097的穎殼、葉鞘和穗下莖外觀可見明顯的白霜，而倒二葉、倒三葉和倒四葉則沒有，二酮含量的差異可能是導(dǎo)致了不同器官表皮蠟質(zhì)表型不同的主要原因。因此，濟麥6097和泰山4447表皮蠟質(zhì)表型的差異也很可能由二酮的含量決定。植物蠟質(zhì)層由填充于角質(zhì)內(nèi)的內(nèi)層蠟質(zhì)和覆蓋于角質(zhì)層外的外層蠟質(zhì)組成，一般內(nèi)層蠟質(zhì)呈無定形態(tài)，而外層蠟質(zhì)會形成蠟質(zhì)晶體堆積在角質(zhì)層外，并受到蠟質(zhì)成分和環(huán)境的影響[15]。在二穂短柄草[16]和節(jié)節(jié)麥[17]等植物葉片蠟質(zhì)中因含有大量的初級醇而呈現(xiàn)出片狀晶體結(jié)構(gòu)，而蠟質(zhì)柱狀晶體含有大量的β-二酮、初級醇等化合物[6]。在本研究中，兩個小麥品種倒二葉、倒三葉、倒四葉、旗葉近軸面的蠟質(zhì)晶體呈整齊的片狀結(jié)構(gòu)，而倒二葉、倒三葉、倒四葉、旗葉近軸面的蠟質(zhì)成分中初級醇的含量占比最高；旗葉遠軸面的蠟質(zhì)晶體呈管狀結(jié)構(gòu)，旗葉遠軸面的蠟質(zhì)成分中二酮含量占比最高；穗下莖和葉鞘的蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)呈管狀，同時其蠟質(zhì)成分中二酮含量占比最高，泰山4447的穎殼蠟質(zhì)晶體出現(xiàn)片狀與管狀共存的現(xiàn)象，而濟麥6097的穎殼蠟質(zhì)只有管狀晶體，這可能與其穗部蠟質(zhì)成分中含有較高的初級醇有關(guān)。

A和E:泰山4447和濟麥6097旗葉的近軸面；B和F：泰山4447和濟麥6097旗葉的遠軸面；C和G：泰山4447和濟麥6097倒二葉近軸面；D和H：泰山4447和濟麥6097倒二葉遠軸面；I和M：泰山4447和濟麥6097倒三葉近軸面；J和N：泰山4447和濟麥6097倒三葉遠軸面；K和O：泰山4447和濟麥6097倒四葉近軸面；L和P：泰山4447和濟麥6097倒四葉遠軸面；Q和T：泰山4447和濟麥6097穎殼；R和U：泰山4447和濟麥6097穗下莖；S和V：泰山4447和濟麥6097葉鞘。A and E:Adaxial surface of flag leaf blade of Taishan 4447 and Jimai 6097; B and F:Abaxial surface of flag leaf blade of Taishan 4447 and Jimai 6097; C and G:Adaxial surface of top second leaf blade of Taishan 4447 and Jimai 6097; D and H:Abaxial surface of top second leaf blade of Taishan 4447 and Jimai 6097; I and M:Adaxial surface of top third leaf blade of Taishan 4447 and Jimai 6097; J and N:Abaxial surface of top third leaf blade of Taishan 4447 and Jimai 6097; K and O:Adaxial surface of top fourth leaf blade of Taishan 4447 and Jimai 6097; L and P:Abaxial surface of top fourth leaf blade of Taishan 4447 and Jimai 6097; Q and T:Glume surface of Taishan 4447 and Jimai 6097; R and U:Peduncle surface of Taishan 4447 and Jimai 6097; S and V:Leaf sheath surface of Taishan 4447 and Jimai 6097.

小麥器官表皮蠟質(zhì)的合成與環(huán)境脅迫有著密切聯(lián)系。蠟質(zhì)合成相關(guān)基因通過調(diào)控蠟質(zhì)合成調(diào)整植物的抗逆性[14]；在擬南芥中 CER1基因的過表達可以提高蠟質(zhì)成分的合成，進而擬南芥的抗逆性[18]； SLCER6基因參與蠟質(zhì)合成中超長鏈脂肪酸的延伸，在番茄突變體中葉片和果實表皮蠟質(zhì)成分的含量因基因突變而顯著減少，使番茄角質(zhì)層失水率顯著增加，進而導(dǎo)致植株不育[19-20]。小麥各器官的蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)和蠟質(zhì)成分含量與各器官的生物學(xué)功能有很大的關(guān)系，表皮蠟質(zhì)中二酮的含量高低可影響植物外觀表型[21-22]，白霜狀的表型有助于防止植物的非氣孔性水分散失，并且蠟質(zhì)含量與植物的抗旱性呈正相關(guān)[23]。本研究對小麥旗葉的生理檢測發(fā)現(xiàn)，蠟質(zhì)含量較低的小麥品種旗葉擁有較高的失水效率。電鏡觀察結(jié)果表明，兩個品種表皮蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)相似。氣相色譜-火焰離子化檢測 (GC-FID)發(fā)現(xiàn)，兩個品種旗葉的蠟質(zhì)成分并不存在差異，而濟麥6097的旗葉相對于泰山4447有較高的蠟質(zhì)含量，這進一步說明表皮蠟質(zhì)影響了小麥葉片中水分的非氣孔性散失。