崔麗朋 宋麗華 黃澤軍 高建昌 國艷梅 杜永臣 王孝宣（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

番茄黃化基因Netted Viresce（NV）的遺傳定位及生理特性研究

崔麗朋 宋麗華 黃澤軍 高建昌 國艷梅 杜永臣 王孝宣*
（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

以瑪娜佩爾為受體親本，以野生番茄潘那利LA0716為供體親本，通過多代回交構(gòu)建近等基因系。對近等基因系中黃化突變（nv）植株和野生型植株的表型性狀和主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行分析，并測定葉綠素含量、凈光合速率等；利用透射顯微鏡觀察葉綠體超微結(jié)構(gòu)。以回交系BC6為母本與nv植株進(jìn)行回交，同時(shí)BC6植株進(jìn)行自交，觀察并統(tǒng)計(jì)BC7及BC6S1群體植株的表型，分析遺傳規(guī)律；利用BC7S1分離群體進(jìn)行基因精細(xì)定位，結(jié)合高通量基因組重測序，篩選僅在黃化突變位點(diǎn)目的區(qū)域內(nèi)的SNP位點(diǎn)，并結(jié)合基因注釋分析候選基因。結(jié)果表明：與正常植株相比，黃化植株表現(xiàn)植株矮小、葉片窄小、葉色黃化，葉片的葉綠素含量、凈光合速率顯著降低，氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度、蒸騰速率顯著升高。葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察顯示，黃化植株葉綠體數(shù)目減少，類囊體的基粒片層和基質(zhì)片層未完全分化，垛疊不整齊。遺傳分析表明，瑪娜佩爾黃化性狀受1對隱性核基因控制；利用CAPS和InDel分子標(biāo)記將NV基因定位于9號染色體標(biāo)記InD-09-4-1和HP63/64之間，物理距離為51 Mb?，斈扰鍫柣蚪M重測序數(shù)據(jù)可利用率高，數(shù)據(jù)比對分析得到7個(gè)與光合作用相關(guān)的基因。

番茄；葉色突變體；生理特性；遺傳分析；基因定位

葉片是綠色植物進(jìn)行光合作用的主要器官，在植物的生長發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用。葉色突變體，又稱為葉綠素突變體，是研究植物光合機(jī)理、葉綠素生物合成、葉綠體結(jié)構(gòu)、功能及發(fā)育、抗病機(jī)制及激素生理等代謝過程的理想材料（Parks & Quail，1991；Fambrini et al.，2004），在分析鑒定遺傳轉(zhuǎn)化、基因功能、基因間互作等基礎(chǔ)研究中具有特殊價(jià)值（López-Juez et al.，1998；Larkin et al.，2003）；同時(shí)，葉色突變體可作為苗期標(biāo)記性狀用于雜交育種及品種純度快速鑒定，在良種繁育工作中發(fā)揮重要作用；某些葉色突變體性狀優(yōu)良，還可作為品種改良的理想種質(zhì)資源（苗晗等，2007）。因此，發(fā)掘和鑒定新的葉色突變基因，對其進(jìn)行克隆及分子機(jī)理研究，具有重要的理論意義和實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。

目前，葉色突變體在煙草（Okabe et al.，1977）、擬南芥（Carol et al.，1999）、水稻（Jung，2003）、玉米（Lonosky & Rodermel，2004）、大麥（Rzeznicka et al.，2005）、黃瓜（苗晗 等，2010）等作物上有較多的研究。已從葉綠素缺失突變體中鑒定克隆出多個(gè)調(diào)控葉綠素代謝和葉綠體發(fā)育的基因，例如葉綠素酸酯a氧化酶基因（CAO）、鎂螯合酶H亞基、I亞基和D亞基基因、葉綠體核糖體小亞基17基因（Oster et al.，2000；Schultes et al.，2000）。Chen等（2005）研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥EGY1基因發(fā)生突變，導(dǎo)致類囊體數(shù)量大大減少，捕光蛋白復(fù)合物明顯減少，葉綠體發(fā)育異常導(dǎo)致葉色突變。林植芳等（2004）研究發(fā)現(xiàn)，水稻葉綠素b缺失可能會(huì)導(dǎo)致PSⅡ 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能的熱穩(wěn)性降低。葉色突變體沒有“午休”現(xiàn)象，且氣孔導(dǎo)度較對照組增大，可為光合作用提供更多的原料（葉威，2014）。因此，葉色突變體可用于研究光合色素代謝、葉綠體的結(jié)構(gòu)與功能、光合作用、植物對光照等環(huán)境因素的反應(yīng)方式等生命活動(dòng)。

在番茄上，有關(guān)葉色突變體的研究報(bào)道也較多。Terry和Kendrick（1999）報(bào)道，番茄黃化突變體au和yg-2為核隱性基因突變，分別是血紅色素加氧酶和植物光敏色素合酶基因發(fā)生突變。番茄突變體lutescent1和lutescent2葉片和果實(shí)中葉綠素合成速率降低而降解速率增加，果肩顏色淺綠，果實(shí)成熟時(shí)間延遲，表明葉綠體在果實(shí)成熟啟動(dòng)中發(fā)揮一定作用（Barry & Giovannoni，2012）。Powell等（2012）利用番茄突變體發(fā)現(xiàn)GLK可以增加果實(shí)中的葉綠素含量，其過表達(dá)有利于光合基因的表達(dá)以及葉綠體的發(fā)育，并能增加果實(shí)中糖類和類胡蘿卜素的積累，提高果實(shí)品質(zhì)。

瑪娜佩爾（Manapal）作為經(jīng)典的番茄遺傳育種材料，是一種葉色突變體，含有的NV基因與Tm-2緊密連鎖，對煙草花葉病毒抗性強(qiáng)，且配合力較好，已被作為苗期標(biāo)記性狀廣泛應(yīng)用于番茄抗病遺傳育種，但在分子遺傳基因NV及植株生理特性方面的研究鮮見報(bào)道。高代回交系材料的遺傳背景相同，僅在個(gè)別染色體片段上存在差異，其株系與受體親本出現(xiàn)的表型差異理論上認(rèn)為是差異染色體片段引起的，因此在基因定位方面具有準(zhǔn)確、快速、省時(shí)的優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)以瑪娜佩爾為輪回親本、潘那利LA0716為供體構(gòu)建回交近等基因系群體，通過對光合色素含量、葉綠體結(jié)構(gòu)、光合特性等進(jìn)行測定、觀察及分析，研究瑪娜佩爾突變體的生理特性；并將傳統(tǒng)遺傳定位方法與高通量測序篩選稀有突變的研究方法相結(jié)合，對nv突變位點(diǎn)進(jìn)行遺傳定位，為NV基因的克隆與分子機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2014年2月至2015年12月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所進(jìn)行。供試材料為栽培番茄瑪娜佩爾、野生番茄潘那利LA0716以及來源于瑪娜佩爾與潘那利番茄LA0716雜交后并以瑪娜佩爾為輪回親本構(gòu)建的回交近等基因系群體BC6、BC6S1、BC7、BC7S1、BC7S2，表型有黃化植株和正常綠葉植株。潘那利起源于秘魯，耐旱，抗蟲性與抗病性強(qiáng)，與栽培番茄雜交親和性較好，種子來源于Tomato Genetics Resource Center（TGRC，http：// tgrc.ucdavis.edu/）；瑪娜佩爾于1975年從美國引入，其植株黃化、生長緩慢，含隱性黃化基因nv，并與Tm-2基因緊密連鎖。

采用32孔穴盤育苗，幼苗生長至四葉一心時(shí)定植于本所北圃場溫室，常規(guī)方法管理。利用高代回交群體BC7和BC6S1進(jìn)行表型調(diào)查和分析NV基因遺傳規(guī)律；以BC6S1和BC7S1為分離群體，在幼苗期利用分子標(biāo)記篩選出黃化（nv/nv）和正常綠葉（NV/NV）苗各10株，用于調(diào)查主要農(nóng)藝性狀及相關(guān)生理指標(biāo)。此外，利用BC7S1（1 200株）和BC7S（2800株）的分離群體進(jìn)行NV基因遺傳定位。

1.2 生理特性分析

1.2.1 農(nóng)藝性狀評價(jià) 對于BC6S1群體中的黃化植株和正常植株，在紅熟期第1至第3穗果中分別選取10個(gè)完全成熟、有代表性的正常果實(shí)進(jìn)行稱重，計(jì)算平均單果質(zhì)量；并測定果實(shí)可溶性固形物含量。在第4穗果實(shí)開始成熟時(shí)測定株高，以主莖基部到第4穗果實(shí)的高度為測定標(biāo)準(zhǔn)；正常植株和黃化植株各測定10株，取平均值。整個(gè)生育期觀察葉色變化情況。

1.2.2 光合色素含量測定 當(dāng)BC7S1群體的黃化植株和正常植株生長至30、60、90 d時(shí)，分別選取生長點(diǎn)往下第2至第3片真葉中生長良好的新鮮成熟葉片100 mg，放入15 mL玻璃試管中，在通風(fēng)櫥中加入10 mL乙醇丙酮混合液（乙醇∶丙酮=1 V∶1 V），置于黑暗條件下過夜浸提至葉片組織發(fā)白；每處理3次重復(fù)。提取液用島津公司的UV-1800分光光度計(jì)分別測定663、645 nm和470 nm波長的OD值，計(jì)算葉片葉綠素a（Chla）、葉綠素b（Chlb）、類胡蘿卜素含量（Caro）和總?cè)~綠素含量（Chl）（楊沖，2014）。

1.2.3 葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察 分別選取BC7S1群體黃化植株和正常植株生長點(diǎn)下第2至第3片真葉中新鮮成熟葉片，切成1 mm2左右的均勻小塊，盡量避開大葉脈，每株取9小塊；樣品離體后立即浸入4%戊二醛溶液中進(jìn)行固定，經(jīng)磷酸緩沖液漂洗后用1%四氧化鋨溶液固定，乙醇梯度脫水，環(huán)氧樹脂滲透包埋，切片、染色后在透射電子顯微鏡下觀察（H-7500，Hitachi Limited，JPN），利用掃描相機(jī)（832，Gatan，USA）掃描獲取照片。透射電鏡樣品制備和觀察均在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所進(jìn)行。

1.2.4 光合作用測定 當(dāng)BC7S1群體的黃化植株和正常植株生長至70、100 d時(shí)，采用LI-6400便攜式光合儀測定凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（G2）、胞間CO2濃度（Ci）、蒸騰速率（Tr）等指標(biāo)；正常植株和黃化植株各測定5株，選取生長點(diǎn)下第3至第5片真葉，每株測3次，計(jì)算平均值。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2007軟件和SAS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 遺傳分析

1.3.1 基因遺傳定位 選取第9號染色體SGN（https：//solgenomics.net/）網(wǎng)站上公布的以及本所鮮食番茄課題組自行開發(fā)的70個(gè)SSR及InDel分子標(biāo)記對雙親及F1進(jìn)行遺傳分析，共篩選出21個(gè)具有多態(tài)性的標(biāo)記；利用21個(gè)分子標(biāo)記對BC7S1和BC7S2群體的2 000株單株進(jìn)行遺傳分析，結(jié)合表型鑒定結(jié)果對目的基因進(jìn)行遺傳定位。DNA提取采用改良的CTAB法（Fulton et al.，1995）。PCR反應(yīng)體系（10 μL）：DNA模板1 μL（50～100 ng·μL-1），正、反向引物各0.2 μL（10 μmol·L-1），2×GoTaq GreenMaster Mix 5 μL，ddH2O 3.6 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 4 min；94 ℃40 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。酶切體系（15 μL）：PCR產(chǎn)物10 μL，限制性核酸內(nèi)切酶0.2 μL（10 U），10×Buffer 1.5 μL，ddH2O 3.3 μL。將PCR-酶切混合液置于適宜的溫度下反應(yīng)4～16 h；酶切產(chǎn)物經(jīng)1.5%～1.8%的瓊脂糖凝膠電泳、凝膠成像儀捕捉圖像觀察統(tǒng)計(jì)。InDel標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物用8.0%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染后觀察。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，部分序列如表1所示。

表1 NV基因遺傳定位的InDel分子標(biāo)記

1.3.2 瑪娜佩爾基因組重測序及候選基因分析 采用改良的CTAB法提取瑪娜佩爾植株幼嫩葉片基因組DNA。由北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司進(jìn)行文庫構(gòu)建、基因組重測序，采用Illumina Hiseq 2500進(jìn)行雙端鏈特異性測序?，斈扰鍫柣蚪M重測序數(shù)據(jù)由深圳藍(lán)圖基因科技有限公司進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

為了快速定位目標(biāo)突變基因，將瑪娜佩爾基因組序列與已公布的360份番茄材料及Heinz1706基因組進(jìn)行序列比對，獲得僅在瑪娜佩爾中存在的特異SNP突變位點(diǎn)，再篩選出目的基因區(qū)域的純合SNP（非同義純合突變，Non-synonymous），以期找到候選基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型及相關(guān)農(nóng)藝性狀分析

與近等基因系中的正常植株相比，黃化植株在出苗20 d時(shí)表現(xiàn)生長緩慢且矮小，葉片窄小，葉色淡黃（圖1）。且在以后的生育期，葉片一直處于黃化狀態(tài)，整體生長勢弱，但能開花結(jié)果。

圖1 正常綠葉植株（左）和黃化植株（右）的表型彩色圖版見《中國蔬菜》網(wǎng)站：www.cnveg.org，下圖同。

此外，黃化植株的其他農(nóng)藝性狀也有較大變化，果實(shí)偏?。▓D2），單株產(chǎn)量和單果質(zhì)量都顯著低于正常植株，分別減少了32.87%和33.16%；果實(shí)可溶性固形物含量比正常植株低20.75%；4穗果株高比正常植株低49.11%，差異顯著（表2）。說明該基因的突變不僅影響到葉色，還對株高、單果質(zhì)量等農(nóng)藝性狀均有較大影響。

2.2 光合色素含量分析

由表3可知，黃化植株在出苗后30、60、90 d，葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量均顯著低于正常植株；出苗后30 d和60 d，葉綠素a/b顯著高于正常植株；出苗后60 d和90 d，類胡蘿卜素含量顯著低于正常植株。

2.3 葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察

與正常植株相比，黃化突變植株的葉肉細(xì)胞葉綠體數(shù)目較少，且分布部位不均勻，形狀不規(guī)則，葉綠體基粒片層發(fā)育嚴(yán)重受阻，類囊體片層發(fā)育不完全，排列方向變形扭曲，垛疊不整齊，且片層結(jié)構(gòu)模糊，發(fā)現(xiàn)有嗜鋨顆粒的積累（圖3）。這表明黃化突變植株的葉綠體類囊體系統(tǒng)發(fā)生了一定程度的損傷。

圖2 正常綠葉植株（左）和黃化植株（右）的果實(shí)

表2 BC6S1群體正常植株（NV/NV）和黃化植株（nv/nv）的農(nóng)藝性狀比較

表3 BC7S1群體正常植株（NV/NV）和黃化植株（nv/nv）的光合色素含量比較

圖3 正常植株與黃化植株葉肉細(xì)胞葉綠體超微結(jié)構(gòu)A、C，正常植株（NV/NV）；B、D，黃化植株（nv/nv）。

2.4 光合特性分析

由表4可知，黃化植株的凈光合速率在出苗后70 d和100 d比正常植株低53.12%、53.76%，差異顯著；而氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度和蒸騰速率顯著高于正常植株。

2.5 基因遺傳定位

早期研究報(bào)道，瑪娜佩爾植株的黃化基因NV與抗煙草花葉病毒基因Tm-2緊密連鎖，位于9號染色體，呈隱性遺傳（張漢卿 等，1985）。本試驗(yàn)中，突變體瑪娜佩爾與潘那利LA0716雜交F1表現(xiàn)為正常綠葉；在高代回交BC6S1群體中表型為正常綠葉植株227株，黃化植株73株，分離比接近3∶1（表5）；在BC7群體中有52株表現(xiàn)為正常綠葉，48株為黃化植株，分離比接近1∶1，經(jīng)卡方檢驗(yàn)符合孟德爾遺傳分離定律，表明瑪娜佩爾黃化性狀由1個(gè)隱性核基因控制。

表4 BC7S1群體正常植株（NV/NV）和黃化植株（nv/nv）的光合特性

表5 黃化植株在BC6S1和BC7群體中的分離情況

表6 基因組重測序候選基因

從9號染色體上公布及開發(fā)的70個(gè)分子標(biāo)記中篩選出具有多態(tài)性差異的8個(gè)CAPS標(biāo)記和13個(gè)InDel標(biāo)記，利用這21個(gè)標(biāo)記對BC7S1和BC7S2群體的2 000株單株進(jìn)行重組篩選，結(jié)合表型鑒定結(jié)果將NV基因定位于標(biāo)記InD-09-4-1和HP63/64之間，物理距離為51 Mb。

2.6 黃化突變體基因組重測序及候選基因分析

利用高通量重測序技術(shù)篩選稀有突變的方法，對瑪娜佩爾黃化突變體進(jìn)行全基因組重測序。結(jié)果表明，數(shù)據(jù)質(zhì)控統(tǒng)計(jì)合格，樣品經(jīng)測序及生物信息學(xué)分析后共有121 M（具體數(shù)目121 312 323）raw reads都是Paired-end，reads比對率為99%，覆蓋區(qū)域92%，平均深度38 X；共檢測到1 278 301個(gè)SNP位點(diǎn)，4 810個(gè)結(jié)構(gòu)性變異位點(diǎn)，其中包括376個(gè)染色體間易位（interchromosomal translocation，CTX）、722個(gè)染色體內(nèi)易位（intra-chromosome translocation，ITX）、2 401個(gè)缺失（deletion，DEL）、335個(gè)插入（insertion，INS）和976個(gè)轉(zhuǎn)置（inversion，INV）。

通過重測序序列比對分析，利用番茄基因組數(shù)據(jù)庫（https：//solgenomics.net/）的基因預(yù)測及注釋，對黃化突變體9號染色體目的片段SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因預(yù)測，得到了28個(gè)基因（表6）。其中，Solyc09g015290、Solyc09g015300、Solyc09g015320、Solyc09g015340、Solyc09g018800、Solyc09g059640編碼光反應(yīng)中心蛋白A，又稱P700葉綠素a脫輔基蛋白A（P700 chlorophyll a apoprotein A），含有pasA和pasB基因的interpro domain，參與PS Ⅰ蛋白質(zhì)復(fù)合物形成；Solyc09g016930參與光合系統(tǒng)Ⅱ CP43葉綠素脫輔基蛋白（Photosystem Ⅱ CP43 chlorophyll apoprotein）合成，在植物光合作用中起著重要作用。這些基因預(yù)測與葉綠素合成或葉綠體發(fā)育相關(guān)，可能存在黃化突變的候選基因。Solyc09g055890編碼1個(gè)脂氧合酶，據(jù)前人報(bào)道，脂氧合酶在植物生長發(fā)育、成熟衰老等生命活動(dòng)中起著十分重要的調(diào)節(jié)作用，脂氧合酶過氧化物會(huì)通過抑制葉綠體的光化學(xué)活性、促進(jìn)蛋白酶失活等方式加速組織老化（Heitz et al.，1997；李彩鳳 等，2010）；Solyc09g057530編碼一類轉(zhuǎn)錄因子同源域-亮氨酸拉鏈蛋白（HD-Zip）ROC3，同源域亮氨酸拉鏈蛋白轉(zhuǎn)錄因子有多種功能，參與葉的發(fā)育、去黃化、脫落酸應(yīng)答和胚胎發(fā)生等生理生化過程（Ariel et al.，2007；Elhiti & Stasolla，2009）；Solyc09g012020編碼F-box家族蛋白，主要參與多種植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、逆境脅迫應(yīng)答等生命活動(dòng)，及光形態(tài)建成、光周期節(jié)律等過程（段桂芳，2014；霍冬英 等，2014）；Solyc09g014990是一類WRKY轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與植物生長發(fā)育、形態(tài)建成、激素代謝、衰老調(diào)控等生命過程（劉波，2012；祖倩麗 等，2015），也可能與黃化突變相關(guān)，候選基因有待進(jìn)一步確定。

3 討論

本試驗(yàn)中，番茄黃化突變體瑪娜佩爾nv位點(diǎn)突變，植株表現(xiàn)矮小、葉片窄小、葉色黃化，變異性狀穩(wěn)定，易于鑒定。Liu等（2007）報(bào)道，一些水稻葉綠素缺失突變體中具有植株矮化特征。突變體植株葉片的葉綠素含量顯著低于正常綠葉植株，類胡蘿卜素含量降低幅度較小，這與多數(shù)黃化突變體如煙草、大麥、水稻、油菜的研究結(jié)果相同（胡忠 等，1981；譚新星 等，1996；董遵 等，2000；雷紅梅 等，2010）；葉綠素a/b值較大，與大部分葉色黃化突變體的葉綠素a/b值高于野生型也相一致（肖華貴，2013）。研究表明，當(dāng)葉片中的類胡蘿卜素合成受阻、含量下降時(shí)，不能起到保護(hù)葉綠素的作用，會(huì)導(dǎo)致葉綠素代謝異常，從而形成葉綠素缺失突變體（Koski & Smith，1951；Wallace & Schwarting，1954）。nv突變體可能是由于調(diào)控葉綠素合成途徑中的相關(guān)基因發(fā)生突變，致使代謝途徑發(fā)生變化，阻礙了葉綠素的合成；且很可能是在葉綠素a與葉綠素b合成分支前產(chǎn)生了干擾，主要是因?yàn)槿~綠素a到葉綠素b的轉(zhuǎn)化過程并沒有受到影響。

本試驗(yàn)中，黃化突變體體內(nèi)的葉綠體數(shù)目較少，分布不均勻，類囊體片層結(jié)構(gòu)發(fā)育不完全，葉綠體類囊體的系統(tǒng)受損，其凈光合速率比正常植株低50%以上，與葉綠素含量的降低比例基本一致，這表明nv突變體很可能是由于葉綠素含量的大幅度減少、葉綠體結(jié)構(gòu)的嚴(yán)重受損影響了葉片的光合功能，致使凈光合速率降低。有研究表明，光合機(jī)構(gòu)系統(tǒng)的功能平衡缺失，特別是類囊體結(jié)構(gòu)對光能的吸收和電子傳遞同暗反應(yīng)利用同化能力之間的失衡，是導(dǎo)致葉色突變體光合能力降低的關(guān)鍵因素（許曉明 等，2004）。

由于nv位于著絲粒附近與Tm-2緊密連鎖，存在嚴(yán)重的重組抑制，交換頻率低，阻礙了常規(guī)圖位克隆方法進(jìn)行基因的精細(xì)定位及克隆。本試驗(yàn)利用稀有突變的基因克隆方法，將突變體的全基因組重測序數(shù)據(jù)與360份材料數(shù)據(jù)進(jìn)行對比分析，找到僅在突變體目的區(qū)域（基因上下游各1 kb之間的區(qū)域，包含啟動(dòng)子等結(jié)構(gòu)）含有的純合SNP突變位點(diǎn)。由于本試驗(yàn)得到的SNP差異位點(diǎn)較多，得到28個(gè)候選區(qū)域基因，其中7個(gè)與光合作用相關(guān)，因此候選基因有待進(jìn)一步研究確定。今后將在此基礎(chǔ)上擴(kuò)大分離群體，篩選重組單株，縮小基因的定位區(qū)間；同時(shí)，通過轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)驗(yàn)證7個(gè)葉綠素合成相關(guān)基因；此外，基因區(qū)間的SNP位點(diǎn)也可能會(huì)影響基因的功能，應(yīng)進(jìn)一步加深測序數(shù)據(jù)的分析與挖掘。

4 結(jié)論

番茄黃化突變體瑪娜佩爾的葉色黃化、葉片窄小、植株矮小，變異性狀穩(wěn)定。本試驗(yàn)通過光合色素含量分析、葉綠體結(jié)構(gòu)觀察、光合特性研究等發(fā)現(xiàn)，黃化植株葉片的葉綠素含量及凈光合速率顯著下降，且降低幅度較大；氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度、蒸騰速率顯著升高；葉綠體數(shù)目減少，類囊體的基粒片層和基質(zhì)片層未完全分化，垛疊不整齊?，斈扰鍫桙S化性狀受1個(gè)隱性核基因控制，其NV基因被定位于9號染色體分子標(biāo)記InD-09-4-1和HP63/64之間，物理距離為51 Mb。由于nv位于著絲粒附近與Tm-2緊密連鎖，存在嚴(yán)重的重組抑制，交換頻率低，將傳統(tǒng)遺傳定位方法同稀有突變的研究方法相結(jié)合，利用黃化突變體重測序數(shù)據(jù)與已公布的番茄材料測序數(shù)據(jù)進(jìn)行序列比對，預(yù)測得到目的區(qū)域28個(gè)候選基因，其中7個(gè)與光合作用相關(guān)。

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Physiological Characteristics and Genetic Mapping of Tomato Yellow Leaf Gene Netted Viresce（NV）

CUI Li-peng，SONG Li-hua，HUANG Ze-jun，GAO Jian-chang，GUO Yan-mei，DU Yong-chen，WANG Xiao-xuan*
（Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）

Near-isogenic lines derived by back-crossing were developed by using ‘Manapal’ as the recipient parent and wild-type tomato ‘Spennelllii LA0716’ as a donor parent．Ten ‘Manapal’ plants and 10 wild type（WT）NIL plants were selected to analyze their main agronomic traits，and measure chlorophyll content and photosynthetic characteristics．The ultra-structure of chloroplast was observed with transmission microscope．The segregation ratios of the seedlings with normal and yellow leaves in BC7and BC6S1populations were calculated and used for genetic analysis of nv．The BC7S1population was used for fine mapping of nv．The SNPs within the region of nv were identified by the alignment re-sequencing result of ‘Manapal’ and wild type tomato materials．Compared to WT plant，nv plant height was lower，nv leaves were narrower，its leaf color is yellowing．The content of chlorophyll，net photosynthetic rate were remarkably reduced．Stomatal conductance，inter-cellular CO2concentration and transpiration rate significantly went up in nv plants．In addition，the number of chloroplasts of nv plants was reduced．The grana lamellae and stroma lamellae of thylakoid stacking were not fully differentiated and irregularly arranged．These results suggested that the yellow leaf trait was controlled by a single recessive gene．The gene NV was mapped in a 51 Mb region on chromosome 9，between InDel makers 09-4-1 and HP63/64．Seven genes related to photosynthesis were identified in this region．

Tomato；Leaf color mutant；Physiological character；Genetic analysis；Gene mapping

崔麗朋，女，碩士研究生，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：cuilipeng502@163.com

*通訊作者（Corresponding author）：王孝宣，男，研究員，碩士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：wangxiaoxuan@caas.cn

2017-04-04；接受日期：2017-05-26

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31672153），大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-25）