何世道，楊瑞秀，劉 博，苑德鵬，姚 遠，孫艷秋，高增貴

(沈陽農(nóng)業(yè)大學 植物免疫所，遼寧 沈陽 110866)

玉米大斑病菌StSNF1的基因組定位、蛋白質結構預測及表達分析

何世道，楊瑞秀，劉 博，苑德鵬，姚 遠，孫艷秋，高增貴

(沈陽農(nóng)業(yè)大學 植物免疫所，遼寧 沈陽 110866)

為了明確StSNF1在玉米大斑病菌基因組中的位置，解析該基因編碼蛋白的結構特征，探究該基因在侵染寄主的不同時期、分生孢子萌發(fā)侵染過程中以及不同碳源培養(yǎng)下的表達情況。結果表明，該基因ID號為008026214，全長3 046 bp，位于scaffold_17負鏈的97 793-100 838位置。StSNF1與玉米圓斑病菌SNF1同源關系較近，由877個氨基酸殘基編碼而成。StSNF1蛋白具有氮端的蛋白激酶結構域、氮端的碳代謝產(chǎn)物去阻遏蛋白激酶結構域和碳端的激酶相關結構域。在蛋白激酶結構域內(nèi)，具有ATP結合位點和絲氨酸/蘇氨酸活性位點。Real-time PCR結果表明，StSNF1在侵染后期高表達，72 h表達量最高；StSNF1在分生孢子萌發(fā)24 h時(即侵入絲形成時期)表達量最高；StSNF1在蔗糖為單一碳源的培養(yǎng)基中表達量最高，果膠培養(yǎng)基次之。綜上所述，StSNF1與侵染寄主和碳源利用密切相關，在侵染后期發(fā)揮作用，利用寄主細胞內(nèi)的非發(fā)酵型碳源進行次級侵染。

玉米大斑病菌；SNF1；蛋白激酶；表達分析

玉米大斑病是全世界玉米種植區(qū)的常見病害，它是由凸臍蠕孢菌(Exserohilumturcicum(Pass.) Leonard & Suggs)引起的一種玉米葉部病害[1-2]。在我國東北、華北北部、西北和南方山區(qū)冷涼玉米產(chǎn)區(qū)發(fā)病比較嚴重[3]。玉米大斑病流行可使玉米減產(chǎn)30%，而種植感病品種產(chǎn)量損失可達50%之多[4]，給玉米生產(chǎn)帶來嚴重威脅。

目前，關于玉米大斑病菌致病因子研究主要集中在細胞信號傳導途徑類、細胞壁降解酶類、氧化還原酶類、黑色素類以及毒素等方面，其中細胞信號傳導途徑包括cAMP-PKA系統(tǒng)和MAPK通路等。cAMP-PKA系統(tǒng)中5′-AMP的濃度直接調(diào)控AMPK(AMP-activated protein kinase)的活性[5]。SNF1p(蔗糖非發(fā)酵蛋白激酶，Sucrose nonfermenting 1 protein kinase)，屬于AMPK家族，它是碳源代謝去阻遏過程中的關鍵酶，首次是在釀酒酵母中被發(fā)現(xiàn)，在真核生物中普遍存在且高度保守[6-7]。

碳分解代謝物阻遏(Carbon catabolite repression，CCR)是微生物中普遍存在的一種機制，微生物通常優(yōu)先利用簡單的發(fā)酵碳源(如葡萄糖)，該碳源的代謝產(chǎn)物會對其他非發(fā)酵碳源相關基因的表達或相關蛋白的活性產(chǎn)生抑制作用[8-9]。在酵母中，酵母菌優(yōu)先利用葡萄糖，當葡萄糖含量充足時，SNF1p活性將會受到抑制；當葡萄糖匱乏時，酵母則會利用非發(fā)酵碳源維持自身新陳代謝，在此過程中SNF1p起到了關鍵作用。此外，酵母ΔSNF1無法利用蔗糖，在乙醇或甘油為單一碳源的培養(yǎng)基上生長時均受到抑制[10]。

SNF1 在植物病原真菌中的功能已有報道，主要集中在碳源利用、致病性和產(chǎn)孢等方面。植物病原菌中，玉米圓斑病菌(Cochlioboluscarbonum)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)、大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)、指狀青霉菌(Penicilliumdigitatum)等SNF1突變株在利用單一碳源方面存在嚴重缺陷，但不同真菌的SNF1突變株在利用碳源方面所產(chǎn)生的缺陷存在差異[11]。如ΔFoSNF1在利用果膠方面與野生型無明顯差異，但ΔPdSNF1在只含有果膠的培養(yǎng)基上生長卻嚴重受阻。玉米圓斑病菌、尖孢鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、大麗輪枝菌、指狀青霉菌中，SNF1通過調(diào)控細胞壁降解酶相關基因來影響致病性，以上幾種SNF1突變株致病性均下降。此外ΔMoSNF1分生孢子的萌發(fā)和附著孢的形成受阻，ΔPdSNF1在培養(yǎng)和侵染過程中產(chǎn)孢量下降[12-17]。

本研究利用生物信息學技術，分析StSNF1在基因組中的位置、該基因編碼蛋白的理化性質以及結構特征，并利用Real-time PCR技術對玉米大斑病菌侵染寄主過程中、分生孢子萌發(fā)侵染過程中以及不同碳源培養(yǎng)下StSNF1的表達模式進行初步探究，為進一步明確StSNF1的生物學功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 玉米大斑病菌(Setosphaeriaturcica)野生型菌株SYY1303由沈陽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院植物免疫所玉米病害實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒(MiniBEST Universal RNA Extraction Kit)、反轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit With gDNA Eraser)、Real-time PCR試劑盒(SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ)均購于TaKaRa公司。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，加水定容至1 L。水瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂12 g，加水定容至1 L。改良Fries培養(yǎng)基：蔗糖30 g，酒石酸胺5 g，NaCl 0.1 g，CaCl20.1 g，KH2PO41 g，NH4NO31 g，MgSO40.5 g，酵母浸膏0.5 g，瓊脂12 g，加水定容至1 L。

1.2 試驗方法

1.2.1StSNF1的生物信息學分析 通過Blast搜索S.turcica基因組數(shù)據(jù)庫(JGI，http：//genome.jgi.doe.gov/Settu1)，確定StSNF1在基因組中的精確位置。利用軟件MEGA 4.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹。利用在線軟件ProtParam(http：//www.expasy.org/tools/protparam.html)分析核酸及氨基酸序列、蛋白質理化性質。利用在線軟件InterProScan(http：//www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/)對StSNF1蛋白的功能域進行預測。分別利用SOMPA和PHYRE2軟件對StSNF1蛋白的二級結構和三維結構進行分析與預測[18-20]。

1.2.2 玉米大斑病菌侵染過程中StSNF1的表達分析 將玉米大斑病菌菌株SYY1303培養(yǎng)于PDA平板上，26 ℃黑暗培養(yǎng)7 d。用直徑為1 cm的打孔器打取菌餅，用鑷子將菌柄接種至玉米葉片上，保濕24～48 h。分別在接種后0，6，12，24，36，48，72，96，120 h，剪取菌餅下方的玉米葉片80～100 mg，液氮速凍樣品，-80 ℃保存?zhèn)溆?。利用Snapgene軟件設計Real-time PCR引物，以18S rRNA作為內(nèi)參基因[21]，引物序列如下：StSNF1-F：5′-TCTTGAAACAG

GAAGCAGTGTG-3′，StSNF1-R：5′-CCAACTAACCCG

TACTCAGGTA-3′，18S-F：5′-GGCATCAGTATTCAGGTTGTC-3′，18S-R：5′-GTTAAGACTACGACGGTATC-3′，引物均由上海生工生物工程有限公司合成。采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取玉米大斑病菌不同侵染時期樣品的RNA。采用PrimeScriptTMRT Reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒進行cDNA的合成。采用美國伯樂公司CFX96熒光定量PCR儀，以不同侵染時期的cDNA為模板，SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒進行Real-time PCR擴增。25 μL PCR體系中包含：2×SYBR?Premix ExTaqTM12.5 μL，StSNF1基因上下游引物各1 μL，模板2 μL，加雙蒸水至25 μL。Real-time PCR程序：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，60 ℃，30 s，40個循環(huán)；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s。每個樣品設置4個技術性重復，3個生物學重復。

1.2.3 玉米大斑病菌分生孢子萌發(fā)侵染過程中StSNF1的表達分析 將玉米大斑病菌菌株SYY1303培養(yǎng)于PDA水瓊脂平板上，26 ℃黑暗培養(yǎng)，分別收集6，12，24 h的分生孢子，采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取玉米大斑病菌分生孢子萌發(fā)不同時期樣品的RNA。采用PrimeScriptTMRT Reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒進行cDNA的合成。采用Real-time PCR方法檢測不同階段的表達規(guī)律，方法同1.2.2。

1.2.4StSNF1在不同碳源培養(yǎng)下的表達分析 將玉米大斑病菌菌株SYY1303培養(yǎng)于改良的固體Fries培養(yǎng)基，其中將碳源換成1%的葡萄糖、蔗糖、果糖、果膠和甘油，26 ℃黑暗培養(yǎng)7 d，收集菌絲提取RNA，反轉錄成cDNA，采用Real-time PCR方法檢測StSNF1的表達情況，方法同1.2.2。

2 結果與分析

2.1StSNF1的生物信息學分析

2.1.1StSNF1在基因組中的定位 以前期擴增到的StSNF1序列為探針序列，利用BlastN搜索玉米大斑基因組數(shù)據(jù)庫，基因ID號為008026214，基因全長3 046 bp，scaffold_17負鏈的97 793-100 838位置。

2.1.2 系統(tǒng)發(fā)育分析 利用MEGA 4.0軟件對StSNF1與玉米圓斑病菌、指狀青霉菌、核盤菌、尖孢鐮刀菌、紅褐肉座菌和稻瘟病菌的SNF1核苷酸序列進行系統(tǒng)發(fā)育與分析。由圖1可知，StSNF1與CcSNF1同源關系較近。

圖1 StSNF1系統(tǒng)發(fā)育樹

2.1.3 理化性質分析 利用ProtParam軟件對StSNF1蛋白理化性質進行分析，該蛋白質含有877個氨基酸殘基，分子量為97 941.49，理論等電點為8.29，預測該蛋白質在280 nm處的吸光度為0.871～0.873，不穩(wěn)定系數(shù)為53.24，脂肪系數(shù)為74.41，蛋白質的平均疏水性為-0.638。

2.1.4 保守功能域分析 通過InterProScan在線軟件對StSNF1蛋白質序列進行分析，結果發(fā)現(xiàn)，該蛋白質的N端第62-317個氨基酸殘基位置具有1個蛋白激酶結構域，第359-406個氨基酸殘基具有1個泛素相關結構域(UBA)、碳代謝產(chǎn)物去阻遏蛋白激酶結構域，而C端具有5個激酶相關結構域1(KA1)，分別是第473-495，538-589，575-688，743-784，842-875個氨基酸殘基(圖2)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，在蛋白激酶結構域內(nèi)，第71-94位置具有蛋白激酶ATP結合位點，第183-195位置具有絲氨酸/蘇氨酸活性位點。

2.1.5 StSNF1蛋白結構域分析及高級結構預測 StSNF1蛋白的二級結構是由SOMPA軟件分析得到，發(fā)現(xiàn)該蛋白中無規(guī)則卷曲的含量為48.23%，由423個氨基酸殘基構成，α-螺旋的含量為27.59%，β-折疊含量較少，占15.85%，β-轉角含量最少，僅占8.32%(圖3)。

利用PHYRE2在線軟件預測并分析StSNF1蛋白的三維結構，第63-318個氨基酸殘基所構成的StSNF1蛋白部分的三維結構模型如圖4所示。該蛋白的三維結構包括一個C端域和一個N端域，C端域由2個α-螺旋和6個β-折疊組成，N端域由7個α-螺旋和2個β-折疊組成，兩者之間由形成裂縫的鉸鏈連接，符合二級結構預測結果。利用SAVES在線軟件對StSNF1蛋白的三維結構模型進行評估，并利用拉氏圖(The ramachandran diagram)鑒定構象的合理性。96.8%的殘基位點位于構象的核心區(qū)域，2.9%的殘基位點位于構象的允許區(qū)域，不合理殘基占0.3%；3D-1D score≥0.2占95.70%。綜上所述，在StSNF1蛋白的三維模型中，絕大多數(shù)的氨基酸殘基構成的二面角是合理的，空間結構穩(wěn)定，該模型具有合理性。

圖2 SNF1蛋白質的保守結構

h.α-螺旋；e.β-折疊；t.β-轉角；c.無規(guī)則卷曲。

2.2 玉米大斑病菌不同侵染時期StSNF1的表達規(guī)律

利用Real-time PCR檢測玉米大斑病菌在不同侵染時期的表達情況，如圖5所示，隨著侵染時間增加，StSNF1表達量逐漸增加，其中72 h時表達量最大，96 h時有所下調(diào)，120 h時表達量再次上調(diào)。

圖4 預測的StSNF1蛋白三維結構

2.3 玉米大斑病菌分生孢子侵染生長過程中StSNF1的表達規(guī)律

利用Real-time PCR檢測StSNF1在分生孢子侵染生長不同階段的表達規(guī)律，如圖6所示，StSNF1在分生孢子誘導萌發(fā)6 h(即附著胞形成時期)表達量最低，12 h(即附著胞成熟時期)表達量隨之升高，24 h(即侵入絲形成時期)表達量達到最大。

2.4StSNF1在不同碳源培養(yǎng)下的表達分析

利用Real-time PCR檢測StSNF1在不同碳源培養(yǎng)條件下的表達情況，如圖7所示，StSNF1在蔗糖

圖 5 玉米大斑病菌不同侵染時期StSNF1的表達量

圖 6 玉米大斑病菌分生孢子侵染生長過程中StSNF1的表達量

圖7 玉米大斑病菌不同碳源培養(yǎng)下StSNF1的表達量

培養(yǎng)基中表達量最高，其次是果膠培養(yǎng)基，在甘油培養(yǎng)基中表達量最低。

3 討論

本研究運用生物信息學技術，確定了StSNF1位于玉米大斑病菌基因組scaffold_17負鏈的97 793-100 838位置，全長為3 046 bp。通過同源性分析，該基因與CcSNF1同源關系較近。研究表明，SNF1p(蔗糖非發(fā)酵蛋白激酶，Sucrose nonfermenting 1 protein kinase)是AMPK在釀酒酵母中的同源蛋白，并且在真核生物中普遍存在且高度保守[6-7]，該激酶的活性受到環(huán)化腺苷酸(cAMP)信號通路中5′-AMP的調(diào)控[22]。本研究分析了StSNF1蛋白的保守功能域，發(fā)現(xiàn)該蛋白具有典型的蛋白激酶結構域、碳代謝產(chǎn)物去阻遏蛋白激酶結構域和KA1(Kinase associated domain 1)結構域[23-24]。在蛋白激酶結構域內(nèi)，具有ATP結合位點和絲氨酸/蘇氨酸活性位點，這與曾曉清在稻瘟病菌和劉一賢在香蕉枯萎病菌中的蛋白結構研究結果相同[25-26]，因此，StSNF1蛋白是典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員。

植物病原真菌中SNF1的功能已有報道，Tonukari等[12]通過研究發(fā)現(xiàn)，C.carbonum的SNF1基因與細胞壁降解酶和毒力有關，CcSNF1突變株致病性下降。Lee等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在Gibberellazeae中SNF1可以調(diào)控細胞壁水解酶的活性，GzSNF1突變株對大麥的致病性下降，細胞壁降解酶相關基因表達下調(diào)。本研究首次在S.turcica侵染寄主過程中對StSNF1的表達情況進行探究，發(fā)現(xiàn)該基因在接種后72 h的表達量達到最大，唐琳等[27]研究表明，S.turcica細胞壁降解酶基因均在接種后期上調(diào)表達，這與本試驗中StSNF1表達的時間節(jié)點相一致，由此推測StSNF1可能參與調(diào)控細胞壁降解酶基因的表達。Yi等[14]研究發(fā)現(xiàn)，SNF1對于M.oryzae孢子的萌發(fā)有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，S.turcica分生孢子萌發(fā)侵染過程中StSNF1的表達量逐步上調(diào)，24 h時(侵入絲形成時期)達到最大，由此可以確定StSNF1與分生孢子萌發(fā)侵染有關。Tzima等[16]研究發(fā)現(xiàn)，V.dahliael中SNF1與碳源代謝密切相關，VdSNF1突變株無法利用果膠。本研究發(fā)現(xiàn)，StSNF1在蔗糖和果膠培養(yǎng)基上的表達量是在葡萄糖培養(yǎng)基上表達量的2～3倍，由此可以確定StSNF1與碳源利用有關。綜上所述，StSNF1在侵染后期表達，該基因通過調(diào)控細胞壁降解酶的活性侵染寄主，利用寄主細胞內(nèi)的非發(fā)酵型碳源進行次級侵染。

本研究通過Real-time PCR技術對StSNF1的表達情況進行了初步分析，想深入了解該基因的功能還需要獲得StSNF1突變株，通過比較野生型與突變株在碳源利用、菌體發(fā)育以及致病性等方面的差異來明確其功能。

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Analysis of the Genomic Location， Protein Structure Prediction and Expression ofStSNF1 inSetosphaeriaturcica

HE Shidao， YANG Ruixiu， LIU Bo， YUAN Depeng， YAO Yuan， SUN Yanqiu， GAO Zenggui

(Institute of Plant Immunology， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， China)

Sucrose nonfermenting 1 protein kinase is the key enzyme in the process of carbon source metabolic derepression. For this， the location ofStSNF1 in genome， the protein structural characteristics of StSNF1， the expression level ofStSNF1 at different infection stages in maize， different stages in the conidial invasive growth ofSetosphaeriaturcicaand under the different carbon sources were studied. The results showed that the Gene ID number was 008026214， length was 3 046 bp， located between 97 793 and 100 838 in the antisense strand of scaffold_17 in the genome ofS.turcica. The StSNF1 protein was more closely related toCochlioboluscarbonumSNF1， and encoded by 877 amino acid residues. StSNF1 showed characteristic conserved domains of protein kinase， carbon catabolite-derepressing protein kinase at N-terminal and a kinase associated domain 1 at C-terminal. An ATP binding site and a serine/threonine active site were found in the protein kinase domain. The results of Real-time PCR indicated that the expression ofStSNF1 was significantly up-regulated in late stage of infection， especially at 72 h. The expression trends ofStSNF1 was up-regulated during the conidia germination.The highest expression ofStSNF1 was found in the medium that sucrose as the sole carbon source followed by pectin. All the results suggestedStSNF1 was closely related to the infection and the carbon source utilization. Moreover， in the late stage of infection， the intracellular non-fermentable carbon sources of host were used in secondary infection.

Setosphaeriaturcica；SNF1；Protein kinase；Expression analysis

2017-04-20

國家重點研發(fā)計劃課題(2016YFD0300704)

何世道(1991-)，男，遼寧營口人，在讀碩士，主要從事玉米病害研究。

高增貴(1966-)，男，內(nèi)蒙古準格爾人，研究員，博士，主要從事玉米病害和蔬菜病害生物防治等研究。

S513.03;Q78

A

1000-7091(2017)03-0085-06

10.7668/hbnxb.2017.03.013