王建鳳,石佳麗,劉艷,杜振霞,賈麗,馮月超,范筱京,張經(jīng)華
(1.北京化工大學,北京 100029;2.北京市理化分析測試中心,北京市食品安全分析測試工程技術研究中心,北京 100089;3.北京聯(lián)合大學旅游學院,北京 100101)
超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定牛奶中三種頭孢菌素類抗生素的研究
王建鳳1,2,石佳麗2,3,劉艷2,杜振霞1,賈麗2,馮月超2,范筱京2,張經(jīng)華2
(1.北京化工大學,北京 100029;2.北京市理化分析測試中心,北京市食品安全分析測試工程技術研究中心,北京 100089;3.北京聯(lián)合大學旅游學院,北京 100101)
本試驗建立了固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(SPE-UPLC-MS/MS)同時檢測牛奶中3種頭孢菌素類抗生素含量的方法,同時對三種物質(zhì)斷裂機理進行考察。樣品用0.5mol/L的磷酸二氫鉀緩沖溶液提取,MCX固相萃取柱進行凈化,液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進行測定,采用多反應監(jiān)測(MRM)模式進行定性和定量分析。3種頭孢菌素類抗生素的檢出限(S/N=3)范圍為0.1~0.5μg/kg,定量限(S/N=10)范圍為0.25~1μg/kg,樣品加標回收率范圍為90%~117%。
MCX固相萃??;超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜;頭孢菌素類抗生素;牛奶
頭孢菌素類抗生素是分子中含有頭孢烯的半合成抗生素,又稱先鋒霉素類抗生素,其作用方式是殺菌性的,對各種細菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定,對β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生菌也具有優(yōu)異的抗菌活性,其臨床治療效率高、抗菌譜廣、殺菌力強,相比青霉素更具耐酸及耐青霉素酶、過敏反應少、毒性低等特性[1],因此在獸醫(yī)臨床及禽畜飼養(yǎng)中得到廣泛的應用。針對畜禽在飼養(yǎng)過程中易濫用頭孢菌素類抗生素引起的殘留,可能會導致消費者在食用后帶來的健康損害、抗藥及過敏的風險問題[2],動物源性食品中抗生素殘留問題必須引起高度重視。
目前,針對頭孢菌素類抗生素的檢測,鐘長鳴等[3]運用液相色譜法測定片、膠囊、顆粒中的頭孢羥氨芐,為藥典中頭孢羥氨芐的測定提供了參考;夏登寧等[4]運用液相色譜法測定血漿中的頭孢氨芐,采用流動相為pH3.0的0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液:乙腈:甲醇(76∶16∶8),色譜行為良好;何文亮等[5]運用表面活性劑增敏熒光分光光度法測定牛奶中頭孢拉定,利用頭孢拉定在堿性條件下降解產(chǎn)物熒光強度被表面活性劑增敏特性,運用熒光分光光度法對牛奶中的頭孢拉定進行測定;郭丹等[6]運用高效毛細管電泳法測定注射用頭孢拉定的含量,該方法準確快速,可為頭孢拉定的質(zhì)量控制提供參考;何東旭等[7]運用高效毛細管電泳同時測定了頭孢噻肟與頭孢羥氨芐,方法精密度高。報道較多的是液相色譜法[1,3,4]、熒光分光光度法[5]、毛細管電泳法[6,7]等,但這些方法的靈敏度均較低。
為了進一步提高頭孢菌素類抗生素檢測技術的靈敏度和定性、定量準確度,以液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)為代表的高靈敏度質(zhì)譜技術的開發(fā)成為抗生素檢測技術的發(fā)展趨勢[8~11]。Nasi Li等[9]建立了同時檢測牛奶中2種頭孢菌素類的UPLC-MS/MS的分析方法;張奧博[10]建立了牛奶中3種頭孢菌素類物質(zhì)同時檢測的UPLC-MS/MS的分析方法。Xiao-Lin Hou等[11]建立了牛奶中頭孢拉定和頭孢噻吩的UPLC-MS/MS的分析方法,并運用固相萃取進行凈化;王建鳳等[12]運用HLB固相萃取柱,建立了牛奶中6種頭孢菌素類的分析方法。
本試驗針對3種堿性頭孢菌素類抗生素,考察了其斷裂機理,同時由于MCX對于凈化和富集堿性化合物效果較好,運用MCX固相萃取柱,建立了牛奶中3種堿性頭孢菌素類抗生素的UPLC-MS/MS檢測方法,并將其應用于實際樣品的檢測中。
1.1 儀器與試劑
UPLC XEVO-TQ MS型超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(Waters公司);Acquity UPLC BEH C18色譜柱(1.7μm,2.1*50mm,Waters公司);CR22G高速冷凍離心機(Hitachi公司);Vortex-Genie 2渦旋混合器(美國Scientific Industries公司);KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);N-EVAP112氮吹儀(美國Organomation公司);OASIS MCX固相萃取柱(6cc,500mg,Waters公司)。
乙酸銨(色譜純,北京百靈威科技有限公司);甲醇(色譜純,Optima公司);甲酸(色譜純,Alfa Aesar公司);氫氧化鈉(分析純,西隴化工股份有限公司);鹽酸(優(yōu)級純,國藥集團化學試劑有限公司);磷酸氫二鉀(分析純,國藥集團化學試劑有限公司);氨水(分析純,國藥集團化學試劑有限公司);乙酸鋅(分析純,國藥集團化學試劑有限公司);超純水。
0.05 mol/LPBS:稱取11.4g磷酸氫二鉀溶解于1L超純水中,使用時用1mol/L NaOH和6mol/L HCl調(diào)節(jié)至合適的pH值;2%甲酸(V/V):準確量取2mL甲酸,與98mL超純水混合均勻;2%氨水-甲醇(V/V):準確量取2mL氨水,與98mL甲醇混合均勻;0.5mmol/L乙酸銨水溶液(A):稱取0.193g乙酸銨溶解于0.5L超純水中,過0.45μm濾膜,用甲酸調(diào)pH值至5。183g/L乙酸鋅水溶液:稱取219g乙酸鋅于燒杯中,加少量水超聲溶解,待溶解后轉移至1L的容量瓶中,多次洗滌燒杯,合并洗滌液于容量瓶中,再加入32mL乙酸,用水定容至刻度。
頭孢類標準品的1 000mg/L標準儲備液,保存于4℃。用甲醇-水(5∶95,V/V)稀釋,得1mg/L混合標準工作液。
1.2 色譜質(zhì)譜條件
色譜條件:B E H C 1 8色譜柱(1.7μm,2.1*50mm);流動相:0.5mmol/L乙酸銨水溶液(A,pH=5)和甲醇(B);流速:0.2mL/min;柱溫:25℃;進樣量:5μL。梯度洗脫程序:0~2min,5%~10%B;2~5min,10%~25%B;5~7min,25%~35%B;7~9min,35%~95%B;9~11.5min,95%~5%B。
質(zhì)譜條件:采用MRM模式,ESI(+)分析。MRM參數(shù)見表1。
表1 3種頭孢菌素類抗生素的多反應監(jiān)測質(zhì)譜參數(shù)
1.3 樣品處理
1.3.1 樣品提取
準確稱取2g牛奶樣品于塑料離心管中,加入6mLPBS,渦旋混勻20s,再加入6mL乙酸鋅溶液,渦旋混勻20s后離心10min,取上清液,待凈化。
1.3.2 樣品凈化
將固相萃取柱依次用12mL甲醇、6mLPBS活化。樣品以3mL/min的流速過柱。依次用3mLPBS、6mL2%甲酸、6mL甲醇淋洗柱,抽干,并用6mL2%氨水-甲醇洗脫目標物,收集洗脫液,于40℃氮吹至近干,用甲醇-水(5∶95,V/V)溶液定容至1mL,過0.22μm濾膜后待測。
2.1 色譜條件和質(zhì)譜條件
2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化及其斷裂機理研究
為得到待測頭孢菌素類抗生素的最佳質(zhì)譜條件,用甲醇-水(5∶95,V/V)溶液分別配制3種頭孢菌素類抗生素的1mg/L的標準溶液,直接進行質(zhì)譜分析,一級質(zhì)譜全掃描確定其準分子離子峰,3種待測物質(zhì)均在ESI+模式下獲得準分子離子峰。以準分子離子峰為母離子進行二級質(zhì)譜掃描,選擇相對豐度較高的兩個碎片離子作為定量和定性離子,分別優(yōu)化各個離子對的錐孔電壓和碰撞能量,其最優(yōu)條件見表1。
三種物質(zhì)的主要斷裂形式均為β-內(nèi)酰胺鍵斷裂,頭孢氨芐和頭孢拉定均有158的碎片離子,該碎片離子為β-內(nèi)酰胺鍵直接斷裂,而頭孢羥氨芐的114碎片離子則為β-內(nèi)酰胺鍵直接斷裂后的碎片離子又失去羧基官能團而產(chǎn)生。
圖1 3種物質(zhì)的相同斷裂機理示意圖
2.1.2 色譜條件的優(yōu)化
以C18為色譜柱,甲醇-乙酸銨水溶液和乙腈-乙酸銨水溶液兩個體系分別作為流動相,考察3種頭孢菌素類抗生素在不同流動相體系中的響應,結果如圖2所示,以甲醇-乙酸銨水溶液為流動相的靈敏度高于乙腈-乙酸銨水溶液,因此試驗時選用甲醇-乙酸銨水溶液體系作為流動相。在該體系中,pH對頭孢拉定的影響不大;與該體系pH為5時作比較,當pH為3時,頭孢羥氨芐有明顯增加,然而頭孢氨芐響應降低41.45%,當pH為4時,頭孢羥氨芐響應下降32.97%,綜合考慮,選擇甲醇-乙酸銨水溶液體系為流動相,并用甲酸調(diào)節(jié)pH為5,其色譜圖如圖3。
圖2 流動相選擇優(yōu)化圖
圖3 3種物質(zhì)的色譜圖
2.2 標準溶液的穩(wěn)定性
頭孢菌素類抗生素中含有的β-內(nèi)酰胺環(huán)結構不穩(wěn)定,在酸、堿條件下會發(fā)生降解,中性條件下可能發(fā)生水解或分子重排[9]。為保證試驗數(shù)據(jù)的準確性,考察了放置溫度以及放置2d的標準溶液與新配制標準溶液的響應強度比值。
2.2.1 放置溫度對標準溶液穩(wěn)定性的影響
將配制好的標準溶液分別于室溫(25℃)和冷藏(4℃)條件下放置1d,比較不同條件下放置標準溶液的穩(wěn)定性差異。結果如圖4所示,25℃和4℃下各標準溶液的峰面積分別相差1.32%、3.28%、6.44%,相差不大,因此該標準溶液在室溫下放置1d和冷藏放置1d對試驗結果基本無影響。
圖4 25℃和4℃條件下放置1d標準溶液的穩(wěn)定性
2.2.2 放置時間對標準溶液穩(wěn)定性的影響
將配制好的標準溶液于4℃冷藏放置2d后與現(xiàn)配制的相同濃度的標準溶液進行比較,測其穩(wěn)定性,結果如圖5所示:各標準溶液的峰面積相差分別為4.31%、8.32%、2.82%,相差不大,因此4℃冷藏放置2d的標準溶液穩(wěn)定性與現(xiàn)配的標準溶液相差不大。一般情況下,標準溶液均采用現(xiàn)用現(xiàn)配,然而特殊情況下,基于穩(wěn)定性的測試,可以考慮使用冷藏條件下放置2d的標準溶液。
圖5 冷藏放置2d和現(xiàn)配制的標準溶液穩(wěn)定性
2.3 濾膜的影響
735 Human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes promotes fracture healing in rats
運用超高效液相色譜柱進行分析的樣品,通常需要運用濾膜進行過濾,然而部分化合物容易被濾膜所吸附,因此將配制好的標準溶液分別過膜和不過膜,比較過膜是否對待測化合物吸附,試驗結果如圖6所示。通過比較標準溶液過膜和不過膜后的試驗結果,峰面積相差分別為1.96%、8.59%、13.92%,均在誤差范圍內(nèi),因此認為濾膜對待測化合物吸附作用不明顯。
圖6 濾膜對標準溶液的影響
2.4 提取液的優(yōu)化
由于頭孢菌素類抗生素的結構中都同時含有酸性和堿性基團,化合物結構比較復雜,性質(zhì)差別比較大,通常均易溶于水,受pH值的影響也比較大,在樣品提取操作中,使用1mol/L的NaOH和6mol/L的HCl調(diào)節(jié)PBS的pH值,使用pH為6.5的PBS提取[12]。
由于提取液的體積對提取效率起著至關重要的作用,因此對提取液PBS的體積進行優(yōu)化。分別選擇6mL、8mL、10mL進行試驗,觀察試驗結果。如圖7所示,隨著提取液體積的增加,回收率基本穩(wěn)定不變,因此選擇提取液的體積為6mL。
圖7 提取液體積對回收率的影響
2.5 標準曲線、線性范圍、檢出限、定量限、回收率、精密度
2.5.1 檢出限和定量限
2.5.2 標準曲線及線性范圍
配制一系列不同濃度的混合標準溶液,按上述分析條件進行測定,以峰面積對濃度做標準曲線。結果表明,各物質(zhì)在線性范圍內(nèi)線性關系良好,3種物質(zhì)線性相關系數(shù)(R2)均大于0.995。
2.5.3 回收率和精密度
在空白的牛奶基質(zhì)中添加高、中、低三個水平混合標準品進行回收率試驗,按照2.3.1和2.3.2的方法進行樣品制備,測定方法回收率和精密度列于表2,回收率的結果均介于90%~117%,精密度(RSD)小于14%。
2.5.4 實際樣品檢測
將本方法用于市售牛奶樣品的檢測,試驗結果表明,均未檢出上述3種頭孢菌素類抗生素。
表2 3種頭孢菌素類抗生素在牛奶基質(zhì)中的檢出限、定量限、添加回收率和相對標準偏差
本研究采用UPLC-MS/MS測定牛奶中的3種頭孢菌素類抗生素藥物殘留,并對其斷裂機理進行研究。采用pH為6.5的PBS作為提取液,經(jīng)MCX固相萃取柱凈化,運用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進行檢測,外標法定量。目前歐盟EC 2002/657/EC[13]規(guī)定頭孢氨芐在牛奶中的最大殘留限量為100μg/kg,因此該方法能夠滿足牛奶樣品中頭孢菌素類抗生素的分析要求。
[1] 蔡玉娥,蔡亞岐,牟世芬,等. 高效液相色譜-紫外光度法檢測尿液和牛奶中多種頭孢類抗生素[J].分析化學,2006,6(6):745-748.
[2] Beconi-Barker MG. et al. Determination of ceftiofur and its desfuroylceftiofur-related metabolites in swine tissues by highperformance liquid chromatography[J]. Journal of Chromatography B: Biome Appl,1995,673(2):231-244.
[3] 鐘長鳴,劉緒平,龔瑋,等. HPLC法測定頭孢羥氨芐及其有關物質(zhì)含量[J].中國抗生素雜志,2004,29(11): 648-649.
[4] 夏登寧,夏艷姣,尹佳,等. HPLC同時測定血漿中頭孢氨芐和甲氧芐啶的濃度[J].中國抗生素雜志,2008,33(11):682-684.
[5] 何文亮,羅濤,周璇,等. 表面活性劑增敏熒光分光光度法測定牛奶中頭孢拉定[J].分析試驗室,2014,33(1):92-95
[6] 郭丹,陳娜娜,晏媛,等. 高效毛細管電泳法測定注射用頭孢拉定的含量[J]. 中國藥房,2005,16(2):135-136
[7] 何東旭,孟歡歡,陳玎玎,等. 高效毛細管電泳同時測定頭孢噻肟與頭孢羥氨芐[J]. 畜牧獸醫(yī)雜志,2008,27(6):5-7.
[8] 孫艷俠.高效液相色譜在乳品抗生素殘留檢測中的應用[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學, 2010,38(3):10-13.
[9] Nasi Li, Feng Feng, Bingcheng Yang, et al. Simultaneous determination of β-lactam antibiotics and β-lactamase inhibitors in bovine milk by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B, 2014, 945-946: 110-114.
[10] 張奧博.芐星頭孢匹林和頭孢洛寧在牛奶中殘留檢測方法及其乳房灌注劑棄奶期研究[D].揚州:揚州大學, 2013.
[11] Xiao-Lin Hou, Yin-Liang Wu, Yan Lv, et al. Development and validation of an ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method for determination of 10 cephalosporins and desacetylcefapirin in milk[J]. Journal of Chromatography B, 2013, 931: 6-11.
[12] 王建鳳,劉艷,楊一帆,等. 固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶中6種頭孢菌素類抗生素[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學報, 2015,6(9): 3380-3386.
[13] European Commission Decision 2002/657/ EC[S].
Simultaneous Determination of Cefadroxil, Cephalexin and Cefradine in Milk by Ultra High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry
WANG Jian-feng1,2, SHI Jia-li3, LIU Yan2, DU Zhen-xia1, JIA Li2, FENG Yue-chao2, FAN Xiao-jing2,ZHANG Jing-hua2
(1.Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029; 2.Beijing Engineering Research Center of Food Safety Analysis, Beijing Centre for Physical and Chemical Analysis, Beijing 100089; 3.College of Tourism, Beijing Union University, Beijing 100101)
To developed a method for the detection of 3 kinds of cephalosporins in milk by solid phase extraction coupled with ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (SPE-UPLC-MS/MS). The same fracture mechanism of the three cephalosporins was investgated. The samples were extracted with 0.05 mol/L phosphate buffer solution, cleaned up by MCX solid phase extraction column, and then analyzed by UPLC-MS/MS with multiple reaction monitoring (MRM) mode. The LODs and LOQs of 3 kinds of cephalosporins were in the range of 0.1~0.5 μg/kg and 0.25~1μg/kg, respectively, with the mean recoveries varied from 90% to 117%.
MCX; UPLC-MS/MS; Cephalosporins; Milk
TS251.1
A
1004-4264(2017)05-0040-05
10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.05.011
2016-10-24
北京市科技計劃項目(Z141100002614020)。
王建鳳,助理研究員,主要研究方向為食品檢測技術。
杜振霞,教授,主要研究方向為食品及材料檢測技術。