高樹，陳家發(fā)，徐天海，楊永強，吳世強，劉賢俠

（1.新疆天康生物技術(shù)股份有限公司，烏魯木齊 830000； 2.新疆石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，石河子 832003）

應(yīng)用B超技術(shù)和激素測定診斷奶牛卵巢囊腫和排卵延遲的研究

高樹1，陳家發(fā)1，徐天海1，楊永強1，吳世強1，劉賢俠2

（1.新疆天康生物技術(shù)股份有限公司，烏魯木齊 830000； 2.新疆石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，石河子 832003）

本文結(jié)合奶牛生產(chǎn)實踐，通過運用B超和激素診斷對常見的兩種卵巢疾?。殉材夷[和排卵延遲）進行綜合診斷，總結(jié)出卵巢囊腫和排卵延遲常見的B超影像圖及激素數(shù)據(jù)規(guī)律，為今后兩種疾病的相關(guān)研究提供理論參考依據(jù)。

B超技術(shù)；激素測定；奶牛；卵巢囊腫；排卵延遲

目前制約奶牛場發(fā)展的“瓶頸”因素之一是奶牛的不孕癥，該病作為奶牛場的四大疾病之一，卵巢囊腫和排卵延遲是引起不孕癥發(fā)生的主要因素。據(jù)國外報道卵巢囊腫的發(fā)病率為6.7%～13.1%，排卵障礙引起的屢配不孕奶牛占整個不孕?？倲?shù)的30%～40%[1,2]。羅瑞卿等[3]對新疆857頭成年奶牛調(diào)查發(fā)現(xiàn)，卵泡囊腫發(fā)病率為2.68%。卵巢囊腫包括卵泡囊腫和黃體囊腫，前者發(fā)病率占卵巢囊腫的75%，后者為25%。卵巢囊腫和排卵延遲主要通過延長產(chǎn)犢間隔以及增加配種的次數(shù)最終影響了奶牛正常的繁殖力，給奶牛業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[4]。因此針對這兩種卵巢疾病應(yīng)及早發(fā)現(xiàn)，早診斷、早治療才能降低該病的發(fā)病率，降低對奶牛業(yè)造成的經(jīng)濟損失。臨床上診斷這兩種卵巢疾病的常規(guī)手段是臨床癥狀結(jié)合直腸檢查，但應(yīng)用直腸檢查存在兩個問題，一是卵泡囊腫和黃體囊腫通過直腸檢查準(zhǔn)確率只有50%；二是排卵延遲與不排卵診斷錯誤。B超探頭做出的是二維斷面圖像，應(yīng)用B超掃查對卵巢囊腫和黃體囊腫的診斷準(zhǔn)確率可以達到80%以上，同時也能提高排卵延遲診斷的準(zhǔn)確性。另外，通過測定患病牛血清中P4和E2的濃度也是鑒別卵泡囊腫和黃體囊腫的一種有效手段。據(jù)報道，運用B超診斷技術(shù)結(jié)合清中P4和E2的濃度可使卵泡囊腫和黃體囊腫診斷的準(zhǔn)確率達到85%左右[5,6]。本試驗通過查閱繁殖資料、觀察臨床癥狀、應(yīng)用直腸檢查結(jié)合B超檢查、激素檢測的方法對卵巢囊腫和排卵延遲進行綜合診斷，建立卵巢囊腫和排卵延遲的B超聲像圖譜，從而為今后這兩種疾病的診治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 試驗動物

選自新疆西部牧業(yè)股份有限公司牛場、奎屯澳利亞牧業(yè)有限公司牧場、克拉瑪依綠成農(nóng)業(yè)開發(fā)有限責(zé)任公司牛場未孕荷斯坦母牛。選取的試驗牛無傳染病、寄生蟲病及其他疾病（子宮炎、蹄病、乳房炎等），統(tǒng)計試驗?zāi)膛５亩?、胎次、產(chǎn)犢日期、發(fā)情與配種記錄、產(chǎn)奶量、體況評分。試驗牛場飼養(yǎng)規(guī)范，無結(jié)核、布病，牛場飼養(yǎng)方式全部為散欄飼養(yǎng)，采用全混合日糧（total mixed ration，TMR）飼喂。

1．2 試驗儀器與試劑

1.2.1 試驗儀器

50s型Tringa Vet 便攜式獸用線陣B超掃描儀，配備3.5/5.0MHz變頻凸陣探頭和5.0～7.5MHz變頻線陣探頭，荷蘭Piemed ICAL公司生產(chǎn)，配備Ni-MH 12V充電電池各1個，2215型NiCd/NiMH charger各1個，另外有配套的50s Tringa communication software version 1.0圖像處理軟件ODTCOMM和雙向紅外傳輸接口，Power Wave X32 BioTekB酶標(biāo)儀，美國BioTek公司生產(chǎn)。1.2.2 試驗試劑

耦合劑：天津市南開區(qū)華科醫(yī)療器械廠生產(chǎn)的AB-1型醫(yī)用超聲耦合劑，規(guī)格250g；牛雌激素ELISA試劑盒，靈敏度1pg/mL，產(chǎn)品編號E11E0023；牛孕酮ELISA試劑盒，靈敏度0.1ng/mL，產(chǎn)品編號E11P0200；以上產(chǎn)品均購自于上海藍基生物技術(shù)有限公司。

1．3 奶牛卵巢疾病B超診斷的操作方法使用頸夾對奶牛進行普通保定，B超掃查前排除直腸內(nèi)宿糞，初步判斷兩側(cè)卵巢的位置，探頭上涂抹超聲耦合劑后送入直腸，至骨盆入口前后向下呈45°～90°進行掃查；用手指將卵巢略微固定，然后將探頭輕靠在一側(cè)卵巢上方，對卵巢進行掃描，觀察實時圖像，當(dāng)顯示出卵泡或黃體的最大直徑切面圖像后，按下凍結(jié)鍵。通過B超儀內(nèi)置電子標(biāo)尺對卵泡或黃體的縱徑、橫徑等指標(biāo)進行測量，并保存圖像，之后將超聲圖像保存到電腦上備用。

1．4 血樣采集與保存

試驗?zāi)膛Ｔ贐超診斷后，每頭頸靜脈采血10mL，靜置數(shù)小時后析出血清并對應(yīng)牛號進行標(biāo)注，保存于-20℃冰箱待測，同時選取10頭正常發(fā)情奶牛作為對照組，頸靜脈采血10mL，處理同上。

1．5 奶牛卵巢囊腫血清中雌激素和孕酮測定的方法

先取出試劑盒，于室溫（2 0～2 5℃）放置15～30min。試驗過程應(yīng)在室溫（20～25℃）內(nèi)進行。然后取出酶標(biāo)板，按照標(biāo)準(zhǔn)品的次序分別加入100μL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液于空白微孔中?？瞻孜⒖字屑尤?00μL的血清，空白對照加入100μL的蒸餾水。在各孔中加入50μL的酶標(biāo)記溶液（不含空白對照孔）。將酶標(biāo)板用封口膠密封后，37℃孵育反應(yīng)1h（在孵育箱中保持穩(wěn)定的溫度與濕度）。充分清洗酶標(biāo)板5次，保持各孔有充足的水壓（濃縮洗滌液以1∶100的比例與蒸餾水稀釋）。酶標(biāo)板洗滌后用吸水紙徹底拍干。各孔加入顯色劑A、B液各50μL。20～25℃下避光反應(yīng)10min。各孔加入50μL終止液，終止反應(yīng)。

采用優(yōu)化切削工藝參數(shù)A2B3C3和A3B3C3再次進行銑削實驗，對本文優(yōu)化方法進行驗證，結(jié)果如表9所示。由表9中表面粗糙度測量結(jié)果可見，以逆銑區(qū)域或順銑區(qū)域作為優(yōu)化目標(biāo)可取得更均勻的優(yōu)化效果。

1．6 奶牛卵巢囊腫和排卵延遲的診斷方法

1.6.1 奶牛卵巢囊腫的診斷

臨床癥狀：表現(xiàn)為頻繁或持續(xù)發(fā)情或者不發(fā)情，部分發(fā)病時間長的奶牛尾根高抬，尾根與坐骨結(jié)節(jié)之間出現(xiàn)深的凹陷，陰門排出黏液[7]。

直腸檢查：囊腫卵泡壁較薄，呈單個或多個存在于一側(cè)或兩側(cè)卵巢上，卵泡有波動感。多次直腸檢查發(fā)現(xiàn)囊腫交替發(fā)育或者大卵泡持續(xù)存在，但不排卵，子宮角松軟不收縮。

B超探查：在同一卵巢相同部位上持續(xù)10d以上，聲像圖表現(xiàn)為圓形或卵圓形規(guī)則的無回聲液性暗區(qū)，暗區(qū)直徑明顯大于成熟卵泡，存在1個或多個直徑超過25mm的大卵泡，囊腫壁厚度小于3mm[8,9]。黃體囊腫壁呈現(xiàn)為高強回聲的光環(huán)或光帶，壁厚大于3mm，并且黃體囊腫組織的邊界不如卵泡囊腫的邊界規(guī)則。

激素診斷：通過測定患病奶牛血清中E2和P4的濃度，根據(jù)相關(guān)的理論[10,11]，當(dāng)E2/P4＞1，血清中P4的濃度＜1ng/mL時一般屬于卵泡囊腫；當(dāng)E2/P4＜1，血清中P4的濃度＞1ng/mL時則屬于黃體囊腫。

1.6.2 奶牛排卵延遲的診斷查閱繁殖記錄：多次正常發(fā)情和人工授精但未妊娠。臨床癥狀[7]：外表發(fā)情癥狀和正常發(fā)情一樣，但發(fā)情的持續(xù)期延長。

直腸檢查[7]：發(fā)情期檢查卵巢和子宮無明顯的疾患，卵巢上有卵泡存在，大小正常，人工授精后次日檢查成熟卵泡未排卵。

B超檢查：人工授精后次日在同一卵巢部位成熟卵泡大小和位置基本未發(fā)生變化，聲像圖顯示低回聲液性暗區(qū)。

2 結(jié)果與分析

2．1 卵巢囊腫和排卵延遲奶牛的診斷結(jié)果

通過運用常規(guī)方法結(jié)合B超在排除子宮疾病和其他疾病的基礎(chǔ)上共診斷出卵巢囊腫奶牛70例，排卵延遲奶牛60例，其中卵泡囊腫54例，黃體囊腫16例，在診斷出卵泡囊腫奶牛中其中1例為雙側(cè)單個囊腫卵泡，1例為單側(cè)多個囊腫卵泡，詳見表1。

表1 卵巢囊腫和排卵延遲奶牛的診斷結(jié)果 單位：頭

2．2 奶牛卵巢疾病的典型B超圖像

2.2.1 奶牛卵巢囊腫的典型B超圖像

圖1 卵巢囊腫的B超聲像圖A：直徑61.1mm的卵泡囊腫聲像圖； B：直徑39mm的卵泡囊腫聲像圖C、D：直徑34.1mm、壁厚3.9mm的黃體囊腫聲像圖

圖1中A、B分別為澳利亞公司第八牧場6217號奶牛和克拉瑪依綠城牛場0586號奶牛卵泡囊腫的B超聲像圖，聲像圖顯示囊腫卵泡為無回聲液性暗區(qū)，卵泡直徑大于正常卵泡直徑，卵泡內(nèi)為一圓形無回聲液性暗區(qū)，卵泡壁較薄，厚度小于3mm，邊界整齊而光滑。

圖1中C、D為西部牧業(yè)134團牛場8125號奶牛黃體囊腫的B超聲像圖，聲像圖顯示卵巢表面回聲光滑, 囊內(nèi)出現(xiàn)液體暗區(qū)，內(nèi)部可見棉紗樣回聲或形態(tài)不規(guī)則的光團，內(nèi)壁不光滑，出現(xiàn)低淡光點，外層回聲較強，囊腫壁厚度大于3mm。

圖2 排卵延遲的B超聲像圖E～H：直徑為18.9 mm、20 mm、20.8 mm、22.7 mm的卵泡聲像圖

2.2.2 奶牛排卵延遲的典型B超聲像圖圖2中E～H為澳利亞公司第九牧場6002號、1003號奶牛和西部牧業(yè)大豐牛場080024號、03207號奶牛排卵延遲的B超聲像圖，聲像圖特征顯示卵泡壁呈強回聲，邊界清晰、光滑，卵泡呈低回聲液性暗區(qū)，本試驗中排卵延遲奶牛卵泡的直徑范圍為15.5～22.7mm。

2．3 奶牛卵巢囊腫血清中雌激素和孕酮測定的結(jié)果

表2 激素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的相關(guān)系數(shù)

圖3 P4和E2激素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 卵泡囊腫和黃體囊腫奶牛血清中E2和P4的濃度

由表3可知，本試驗中卵泡囊腫奶牛血清中E2與P4的濃度分別為1807.62±686.82pg/mL、0.89±0.25ng/ mL，E2與P4的濃度之比為2.03±2.76。黃體囊腫奶牛血清中E2與P4的濃度分別為977.56±750.73pg/mL、13.95±2.35ng/mL，E2與P4的濃度之比為0.07±2.35。以上數(shù)據(jù)均符合激素診斷的相關(guān)理論。

3 討論

3．1 卵巢囊腫奶牛的診斷

卵巢囊腫主要包括卵泡囊腫和黃體囊腫，卵泡囊腫是指卵巢卵泡直徑大于25mm，持續(xù)存在時間超過10d或更長時間，同時卵巢上無正常黃體結(jié)構(gòu)的一種病理性狀態(tài)，主要由于卵泡上皮變性、卵泡壁結(jié)蹄組織增生變厚，卵母細胞死亡，卵泡液未被吸收或者增多引起，黃體囊腫是由于未排卵的卵泡壁上黃體化而引起[7]。一般情況下卵泡囊腫和黃體囊腫很難通過直腸檢查做出準(zhǔn)確的判斷，研究顯示直腸檢查的準(zhǔn)確率只有50%[12,13]。B超診斷技術(shù)是一項診斷卵泡囊腫與黃體囊腫值得信賴的手段，主要根據(jù)卵泡囊腫與黃體囊腫的B超聲圖像進行鑒別診斷：（1）卵泡囊腫腔內(nèi)液體聲像圖為均勻的液性暗區(qū)，而黃體囊腫腔內(nèi)部可見棉紗樣回聲或形態(tài)不規(guī)則低淡光點。（2）卵泡囊腫壁呈線狀或環(huán)狀中等回聲或強回聲，卵泡壁薄，厚度小于3mm，黃體囊腫壁呈現(xiàn)為高強回聲的光環(huán)或光帶，壁厚大于3mm，并且黃體囊腫組織的邊界不如卵泡囊腫的邊界規(guī)則[9,14]。（3）黃體囊腫內(nèi)有特殊的結(jié)構(gòu)——小梁，小梁超聲影像為線狀強回聲，有時是單一的一條白線，有時是交織的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可以從結(jié)構(gòu)上進行區(qū)別卵泡囊腫和黃體囊腫[11]。根據(jù)卵泡囊腫和黃體囊腫黃體化的程度不同，本研究測定的病牛血清中E2與P4的濃度之比，和Braw-Tal[10]等報道的E2與P4的濃度之比10.8±2.3存在一定的差距，可能和激素測定的方法、試劑盒的選擇有關(guān)；黃體囊腫奶牛E2與P4的濃度之比和Braw-Tal[10]等報道的0.07±0.02基本一致。

3．2 排卵延遲奶牛的診斷

排卵延遲屬于卵巢機能不全或排卵障礙，指在發(fā)情時有外表癥狀，但不出現(xiàn)排卵，在牛上時有發(fā)生。動物的正常排卵是在下丘腦-垂體-卵巢軸的相互調(diào)節(jié)下進行的[15]，排卵前成熟卵泡分泌大量的雌激素通過正反饋誘發(fā)排卵前LH峰的出現(xiàn)。所以排卵延遲往往與LH脈沖釋放減少或不及時有關(guān)，也可能與雌激素合成受阻及某些排卵活性降低有關(guān)。本文中的患牛產(chǎn)奶量平均為26.24±3.16kg/d，多數(shù)為高產(chǎn)奶牛，泌乳產(chǎn)生大量催乳素，造成腦垂體前葉抑制LH的分泌，同時降低了卵巢LH的正常反應(yīng)，進而影響卵泡的正常排卵。另外，飼養(yǎng)管理不當(dāng)、應(yīng)激和遺傳也是導(dǎo)致奶牛排卵延遲的重要原因。該疾病主要通過直腸檢查和B超診斷，和其他卵巢疾病相比，排卵延遲奶牛外部發(fā)情癥狀正常，直腸檢查卵巢和子宮無異常，但發(fā)情持續(xù)的時間比正常奶牛要長，通過查閱繁殖記錄對發(fā)情配種正常但未受孕的奶牛在下次實施人工授精后10～12h進行直腸檢查和B超掃查，如卵泡仍然存在并且B超聲像圖上顯示為低回聲液性暗區(qū)，卵泡直徑大小和位置也基本未變，連續(xù)跟蹤檢查最終卵泡會發(fā)生排卵，由此可診斷為排卵延遲。但需要與不排卵進行鑒別診斷[7]，雖然二者都屬于排卵障礙范疇，并且臨床癥狀比較相似，不排卵的奶牛是在卵泡發(fā)育到最大體積時不發(fā)生排卵[16]。據(jù)Bat對排卵延遲的診斷是指奶牛出現(xiàn)發(fā)情后，發(fā)情卵泡存在的時間超過4d，并且在下一發(fā)情周期的中期有成熟的黃體生成，可診斷為排卵延遲。而不排卵是指在奶牛出現(xiàn)發(fā)情后，發(fā)情的卵泡存在的時間超過4d以上，但在下一發(fā)情周期的中期無成熟的黃體生成，即可診斷為不排卵[17]。

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2017-03-20