于垚垚，劉深賀，王力軍，王亞平，劉文浩，楊利國

（華中農業(yè)大學動物科技學院，農業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，武漢 430070）

抑制素基因疫苗及其在提高單胎家畜繁殖力方面的研究進展

于垚垚，劉深賀，王力軍，王亞平，劉文浩，楊利國

（華中農業(yè)大學動物科技學院，農業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，武漢 430070）

本文就抑制素基因疫苗的發(fā)展歷程、免疫效果的影響因素以及其在提高單胎動物繁殖力方面的應用研究進行文獻綜述,為促進抑制素基因疫苗的深入研究與推廣應用提供參考依據。

抑制素；基因疫苗；繁殖力；單胎家畜

抑制素主要是由雌性動物的卵巢顆粒細胞以及雄性動物睪丸支持細胞所分泌的一種糖蛋白激素，其主要生理功能是抑制促卵泡素（FSH）的合成與分泌，從而降低循環(huán)血液中的FSH水平[1]。而抑制素基因免疫是將克隆有抑制素抗原基因的真核表達載體導入宿主體內，利用宿主細胞的轉錄翻譯系統(tǒng)表達出抑制素抗原蛋白，從而激發(fā)宿主的免疫系統(tǒng)產生抗抑制素的抗體，中和外源和內源性的抑制素，釋放對FSH合成和分泌的抑制作用，促進卵泡發(fā)育，增加排卵率，并最終達到提高動物繁殖力的效果。由于抑制素基因疫苗能夠增加排卵率與雙胎率，因而在提高單胎動物雙胎率進而提高其繁殖力方面具有重大意義[2]，同時由于基因疫苗具有制備簡單、便于儲存和運輸以及能夠維持較長時間的免疫反應等優(yōu)點，因而眾多的研究者對抑制素基因免疫進行了深入的研究。

1 抑制素基因疫苗的研究進展

抑制素基因疫苗的研究始于1998年，由楊利國教授指導的兩名博士研究生王進榮和姜勛平同時開展研究。王進榮[3]綜合分析了抑制素α亞基的二級結構、兩種抗原表位、親水性曲線等，發(fā)現N端1-26或1-32、63-82、103-122可能包括抑制素α亞基的抗原表位。考慮到抗原值、親水性及較多的Pro易形成coil結構，故取N端1-32或63-82為半抗原。姜勛平等[4]在此基礎上將抑制素α亞基N端1-32肽基因克隆于真核表達載體pcDNA3.1，構建了抑制素基因疫苗pINH，免疫小鼠后抗體陽性率為30%，加強免疫后抗體陽性鼠的FSH水平顯著升高。為了提高抑制素基因疫苗的免疫效果，茆達干等[5]將抑制素基因融合于乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）的3端，并克隆于真核表達載體pcDNA3.1，構建了單拷貝的抑制素基因疫苗pcIS，用該疫苗免疫大鼠后，一次加強免疫后抗體陽性率可達到38.9%～50%，二次加強免疫后抗體陽性率可達到55.6%。隨后，曹少先等[6]利用表位串聯的原理將抑制素α亞基N端1-32肽基因插入質粒pcIS乙肝表面抗原第112～113氨基酸殘基密碼子之間構建了雙拷貝的抑制素基因疫苗pcISI，免疫大鼠后，第6、8周抗體陽性率均達到了83.3%，且抗體陽性率在第2～6周均高于pcIS組，這表明雙拷貝的抑制素基因疫苗具有更高的免疫原性。為了構建與綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP）相融合的雙抑制素基因疫苗，曹少先[7]又將雙拷貝抑制素基因疫苗pcISI中的ISI片段融合于pEGFP—N1中EGFP基因的5’端，構建了雙拷貝的抑制素基因疫苗pEGISI，這為研究抑制素基因疫苗的免疫機理提供了重要基礎，同時由于該質粒以卡納青霉素為選擇壓力，大大降低了由氨芐青霉素為選擇壓力而導致的過敏反應的風險。

隨后吳結革等[8]又將具有免疫增強作用的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage Colony-stimulating factor, GM-CSF）分別插入雙拷貝的抑制素基因疫苗pcISI和pEGISI,成功構建了GMCSF與抑制素融合表達質粒pCGMISI和pEGMISI，為研究GM-CSF基因在抑制素基因疫苗中的免疫增強作用奠定了基礎。為了進一步提高抑制素基因疫苗的免疫效果，韓麗等[9]又將具有蛋白轉導功能的牛孢疹病毒I型（Bovine Herpesvirus 1，BHV-1）VP22基因插入雙拷貝的抑制素基因疫苗pEGISI，構建了真核表達載體pEGISI-VP22，并用該質粒免疫小鼠，結果表明VP22確實能夠增強抑制素基因疫苗的免疫原性。

為了提高疫苗的安全性，便于在生產中推廣應用，韓麗等[10]將平衡致死系統(tǒng)引入抑制素基因疫苗，將pCIS質粒中的IS序列分別插入到不含抗性基因的真核表達載體pVAX-asd與pYA3493中，構建了不含抗性基因的真核表達質粒pVAX-asd-IS與pYAIS，并轉入asd 和crp雙缺失的豬霍亂減毒沙門氏菌中，構建了重組菌C501（pVAX-asd-IS）和C501（pYAIS），這樣不但提高了抑制素基因疫苗的安全性，還為抑制素基因疫苗提供了更多的免疫途徑。

為了更有效地提高動物的繁殖力，本實驗室淡新剛等又將與抑制素具有相似功能的RF酰胺肽（RF-amide related peptide，RFRP）引入抑制素基因疫苗。他們先將豬源INH α（1-32）連接到乙肝表面抗原S基因C末端，合成SINH；又將牛源RFRP-3 基因連接到乙肝表面抗原S基因C末端，合成SRFRP。最后將SINH和SRFRP基因片段分別插入到 pIRES 真核表達載體的兩個多克隆位點，構建抑制素和促性腺激素抑制激素共表達質粒p-SINH/SRFRP。同時由于組織纖溶信號肽（tissue plasminogen activator，TPA）序列能夠增強抗原的免疫原性，誘導產生很強的體液免疫反應，因而，淡新剛等又將TPA序列插入共表達質粒目的基因的N-端，構建了信號肽共表達質粒p-TPA-SINH/TPASFRFP[11]。

2 抑制素基因疫苗免疫效果的影響因素

2．1 給藥方式

基因疫苗有多種給藥方式，如注射（肌肉、皮下、靜脈）、口服和鼻飼等[12]。但抑制素基因疫苗主要以肌肉注射方式居多，韓麗等分別采用口服和肌肉注射方式免疫小鼠，結果發(fā)現無論是肌肉注射還是口服均能誘導小鼠產生Th1和Th2型免疫反應，但肌肉注射的免疫效果更好，且能提高產仔數[10]。

2．2 免疫劑量

免疫劑量也是影響抑制素基因免疫的主要因素。用無抗性基因的抑制素真核表達質?；蛞呙?重組菌C500(pXAIS))免疫奶牛，結果發(fā)現高劑量免疫組子宮孕角復舊時間短于對照組，且達到了顯著水平[13]。而其用0.75、1.5、2.25、3.0mg的pcISI質粒免疫肉牛及南陽黃牛，結果均發(fā)現2.25mg的免疫劑量最佳[14,15]。而姜衛(wèi)星等的研究結果也證明抑制素基因疫苗pCISI的最佳免疫劑量是2.25mg[16]。

2．3 免疫佐劑

有多種免疫佐劑可以增強抑制素基因疫苗的免疫效果。王水蓮[17]比較了免疫佐劑脂質體與普魯卡因的免疫增強效果，結果表明，普魯卡因顯著優(yōu)于脂質體。隨后郭憲等[18]利用串聯抑制素重組質粒pcDNA-DPPISSDINH和pcDNA-DPPISSDINH-sC3d3分別免疫綿羊，結果表明，佐劑sC3d具有免疫增強作用，能夠提高抑制素基因疫苗的免疫效果。茆達干等[19]經研究發(fā)現細菌DNA和gm-csf能夠增強抑制素基因疫苗的免疫效果。

2．4 免疫次數和免疫間隔

免疫次數對抑制素基因疫苗免疫效果的影響也不盡相同，大部分的研究結果均表明加強免疫能夠提高抑制素基因疫苗的免疫效果。但是韓麗以及梁愛心等的研究結果卻表明，免疫次數的增加并沒有提高基因疫苗的免疫效果，相反只免疫一次的效果更好[10,20]。免疫間隔也與抑制素基因疫苗的免疫效果息息相關，目前有關文獻中的免疫間隔一般為14、21及28d等，但有關免疫間隔對免疫效果的影響還未見報道。

3 應用抑制素基因免疫技術提高單胎家畜繁殖力的研究進展

3．1 應用抑制素基因免疫技術提高羊繁殖力的研究進展

郭憲等用抑制素基因疫苗首次免疫綿羊以后，FSH水平高于對照組，而后在2次和3次免疫后FSH水平達到顯著水平，且2次免疫后LH、E2、P等激素也高于對照組，3次免疫后，E2和P顯著高于對照組，最終免疫綿羊后雙羔率最高可達到30.0%，顯著高于對照組[21]。而張德坤等的研究結果卻表明，抑制素基因疫苗pCIS免疫能夠影響母羊FSH的分泌水平，而對雌激素和孕激素則無顯著影響[22]。同時，張德坤等用抑制素基因疫苗pCIS免疫母羊，雙胎率可達到39.2%，顯著高于對照組[23]。淡新剛等分別用質粒p-TPA-SINH/TPA-SRFRP、p-SINH/ SRFRP和p-SINH免疫綿羊，結果表明，三種疫苗均能誘發(fā)明顯的免疫反應，且第3次免疫后20d，p-TPASINH/TPA-SRFRP免疫組的FSH和LH水平最高。三個試驗組最終母羊的雙羔率分別為37.5%、37.5%和12.5%[11]。

3．2 應用抑制素基因免疫技術提高牛繁殖力的研究進展

姜衛(wèi)星等[16]用雙拷貝的抑制素基因疫苗pCISI免疫南陽黃牛，結果發(fā)現抑制素抗體水平與黃體發(fā)育水平息息相關，抗體陽性牛兩側黃體明顯比抗體陰性牛大。而王水蓮等[24]的研究結果表明，抑制素基因免疫可以增加大卵泡、小卵泡、成熟卵泡數量以及卵泡總數量，同時也可以增加成熟卵泡與黃體直徑，他們還發(fā)現抑制素抗體水平與成熟卵泡大小和黃體大小具有很強的相關性。崔先利等[25]的研究結果表明，抑制素基因疫苗pCISI能夠促進雙大卵泡發(fā)育、誘發(fā)排雙卵并能誘發(fā)黃牛孿生。夏迪等[26]的研究還表明，非抗性篩選的抑制素基因疫苗還能促進奶牛產后子宮復舊，同時還可以提升奶牛的泌乳性能。

4 結束語

動物的繁殖力是指動物維持其正常生殖機能，繁育后代的能力。在畜牧生產中，繁殖力的高低直接影響畜牧場的經濟效益，因而提高動物繁殖力具有十分重大的意義，特別是對于繁殖周期較長的單胎家畜如牛羊等。而抑制素基因疫苗的發(fā)展歷程是免疫原性不斷提升、安全性不斷改善以及免疫程序不斷完備的過程，隨著科技的不斷發(fā)展和眾多研究者的不懈努力，我們有理由相信抑制素基因疫苗必將大規(guī)模應用于畜牧生產實踐。

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Progress of Inhibin Gene Vaccine and Its Effects on Singletons Livestock Fertility

YU Yao-yao, LIU Shen-he, WANG Li-jun, WANG Ya-ping, LIU Wen-hao, YANG Li-guo
(Key Laboratory of Agricultural Animal Genetics, Breeding and Reproduction, Education Ministry of China, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070)

This paper elaborates on the development course of inhibin gene vaccine,the factors influencing its effects and its application on the improvement of singletons livestock fertility. And the objective of this paper is to provide basis for the better application of inhibin gene vaccine in livestock production practice.

Inhibin; Gene vaccine; Singletons livestock; Fertility

S823.3

A

1004-4264（2017）05-0016-04

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.05.005

第二屆“牛人”攝影大賽作品 《秋意下的Hamra牧場》——熊倩 利拉伐

2016-12-08

于垚垚（1991-），山西晉城人，碩士研究生，主要從事動物生殖生理與生物技術的研究。

楊利國，教授。