張曉燕， 許海淼， 王篤軍， 王 凱， 眭丹娟， 魏 淵

(江蘇大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江，212013)

原兒茶酸與原兒茶醛對小鼠肝臟細胞色素P450表達的影響

張曉燕， 許海淼， 王篤軍， 王 凱， 眭丹娟， 魏 淵*

(江蘇大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江，212013)

目的：研究原兒茶酸和原兒茶醛對小鼠肝臟細胞色素P450酶主要亞型表達水平的影響。方法：將C57BL/6小鼠隨機分為正常對照組(0.9%生理鹽水)、原兒茶酸與原兒茶醛給藥組(6 mg/kg)，苯巴比妥誘導(dǎo)組(80 mg/kg)，每24 h給藥一次，連續(xù)給藥2周。提取肝臟中總RNA，RT-PCR技術(shù)考察藥物對CYP450主要亞型mRNA 表達的影響；制備肝微粒體，用Western blot技術(shù)考察P450酶主要亞型的表達。結(jié)果：RT-PCR結(jié)果顯示，在mRNA水平上，與正常對照組相比，原兒茶酸可誘導(dǎo)Cyp1a2基因的表達(P<0.05)，對Cyp2c37、Cyp2d9的mRNA表達無誘導(dǎo)作用。原兒茶醛對Cyp1a2的mRNA的表達有誘導(dǎo)作用(P<0.05)，對Cyp2c37和Cyp2d9的mRNA的表達無誘導(dǎo)作用。Western blot結(jié)果顯示原兒茶酸對CYP1A2，CYP2E1表達有顯著誘導(dǎo)作用，對其他幾種亞型無影響。原兒茶醛對CYP1A2表達有顯著誘導(dǎo)作用，對其他幾種亞型無影響。Western blot結(jié)果與RT-PCR結(jié)果基本一致。結(jié)論：原兒茶酸與原兒茶醛均可以顯著誘導(dǎo)CYP1A2的mRNA以及蛋白表達，并且原兒茶酸可以顯著誘導(dǎo)CYP2E1的蛋白表達。

原兒茶酸；原兒茶醛；細胞色素P450；表達水平

原兒茶酸 (Protocatechuic acid) 是天然存在于許多蔬菜和果實中的一種酚酸類物質(zhì)，并且是很多中藥中的活性成分，如四季青[1]、丹參[2]、芙蓉[3]等。大量實驗證明，原兒茶酸具有抗菌、抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗血小板凝集、降低心肌耗氧量以及神經(jīng)保護等多方面藥理作用，是一種重要的天然活性物質(zhì)[4-8]。原兒茶醛 (Protocatechuicaldehyde) 存在于四季青、丹參、鼠尾草等中藥中[9]。原兒茶醛有擴張冠狀動脈、降低心肌氧耗量、抑制血小板聚集、抗腫瘤作用、清除自由基和抗脂質(zhì)過氧化、抗炎等作用[10]。瘀血證患者單核細胞趨化游走能力增強，原兒茶醛抑制單核細胞趨化游走[11]和在趨化游走過程中產(chǎn)生的IL-8 活性[12]，因此，原兒茶醛是活血化瘀類中藥中的重要活性成分之一。

細胞色素P450(Cytochrome P450)是肝微粒體混合功能氧化酶中最重要的一族，在外源性和內(nèi)源性物質(zhì)的代謝中起著極其重要的作用[13-14]。細胞色素P450可受多種因素的影響，尤其是藥物，能夠顯著影響藥酶的活性，并引起自身或其他藥物的藥代動力學(xué)的改變，使得藥效增強(中毒)或減弱(無效)，從而導(dǎo)致藥物-藥物相互作用[15]。中藥由于其成分復(fù)雜，療程較長，長期應(yīng)用有可能對肝臟的藥物代謝酶產(chǎn)生影響，影響其他藥物的代謝，相互作用可能使毒性增加和產(chǎn)生不良反應(yīng)。藥物間相互作用引發(fā)的一系列不良反應(yīng)，已經(jīng)引起了醫(yī)藥界的極大關(guān)注[16]。因此，研究中草藥對細胞色素P450的影響及中草藥-中草藥或中草藥與有效成分并用或組方制劑的藥物相互作用及機制，對促進合理配伍用藥并最大限度地避免盲目聯(lián)合用藥所導(dǎo)致的不良后果、保證臨床用藥的有效性和安全性無疑有著重要意義[17]。酚酸類化合物原兒茶酸和原兒茶醛廣泛存在于中草藥中，然而在體內(nèi)對細胞色素P450酶表達的影響鮮有報道，了解原兒茶酸與原兒茶醛對P450酶系表達的影響，對于了解原兒茶酸與原兒茶醛與其他臨床藥物的相互作用，合理指導(dǎo)臨床用藥具有重要意義。

針對上述情況，本實驗主要考察了原兒茶酸與原兒茶醛對細胞色素P450主要亞型mRNA和蛋白表達水平的影響，為闡明原兒茶酸與原兒茶醛在臨床上安全合理用藥提供更多數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗采用健康的SPF級2月齡C57BL/6小鼠購買于南京大學(xué)模式動物研究所，動物合格證號SKXK(蘇)2010-0001。雄性，30只，體質(zhì)量(20±2)g，購買后在實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后用于正式實驗，室溫22～25 ℃，相對濕度65%，12h明暗交替照明，自由進食、飲水。

1.2 主要試劑及儀器

原兒茶酸(批號：JZ140306，南京景竹 純度 ≥98%)；原兒茶醛(批號：JZ140510A，南京景竹 純度≥98%)。cDNA合成試劑盒(Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit)購于美國Thermo Fisher公司；熒光定量試劑盒購于羅氏公司(Fast Start Essential DNA Green Master)；PCR引物購于上海生工生物技術(shù)有限公司；SDS-PAGE緩沖液、蛋白分子量標準、TEMED、BCA蛋白濃度試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所；ECL發(fā)光液購于美國MILLIPORE公司；抗體：兔抗人CYP1A1(H-70)：sc-20772，鼠抗人CYP1A2 (D1tkt5)：sc-53241，兔抗人CYP2A(H-110)：sc-33214，鼠抗人CYP2B(9.14)：sc-73546，鼠抗人CYPOR(F-2)：sc-55477六種一抗購于美國Santa Cruz公司；兔抗人CYP2C(EPR6576)ab137015購于美國Abcam公司；兔抗人CYP2D(PAB19502)購于臺灣Abnova公司；兔抗人CYP2E1(BML-CR3271)購于美國Enzo公司。羊抗鼠和羊抗兔HRP二抗LgG(H+L)，購于中國碧云天生物工程公司，其他為分析純或生化級試劑。熒光定量PCR儀：羅氏Light Cycle 96熒光定量PCR儀。

2 方 法

2.1 動物分組及給藥

將C57BL/6小鼠隨機分為正常對照組(生理鹽水)、原兒茶酸和原兒茶醛(6 mg/kg)給藥組，苯巴比妥誘導(dǎo)(80 mg/kg)，每組5只。精密稱取藥品溶于生理鹽水中，給藥時間為2周，每24小時灌胃給藥1次。正常對照組采用生理鹽水按體重給予相當(dāng)量的溶劑對照液；末次給藥后，隔天禁食12 h，二氧化碳窒息法處死小鼠。

2.2 利用熒光定量PCR(RT-PCR)技術(shù)考察原兒茶酸和原兒茶醛對小鼠Cyp1a2、Cyp2c37、Cyp2d9基因表達

以TRIzol提取試劑盒說明書提取小鼠肝組織細胞總RNA，紫外分光光度計法測定RNA在A260/A280的比值，純度A260/A280在1.9～2.0，取總RNA 1 μg，分別加入逆轉(zhuǎn)錄試劑至總體積20 μL混合均勻。反轉(zhuǎn)錄條件為42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，反應(yīng)產(chǎn)物-20 ℃保存待用。取上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 (L加入RT-PCR反應(yīng)體系：Real SYBR Mixture(with ROX)10 μL，上、下游引物(10 mol/L)各2 μL，cDNA模板各1 μL，加RNase-free水至20 μL。以β-actin作為內(nèi)參基因，進行PCR擴增的實時定量分析，RT-PCR反應(yīng)條件：Preincubation：95 ℃ 300 s；3 Step Amplification：95 ℃ 15 s， 61 ℃ 20 s，72 30 s；Melting：65 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s；Cooling：37 ℃ 30 s。實驗重復(fù)3次。實驗數(shù)據(jù)采用2-ΔΔct法分析得出。RT-PCR引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成(見表1)。

表1 RT-PCR引物

2.3 Western blot法分別測定細胞色素P450酶中主要亞型的表達

隨機抽取正常對照組，原兒茶酸，原兒茶醛和苯巴比妥劑量組各3只小鼠，將小鼠肝臟取出稱量，用冰冷的0.15 mol/L的KCl沖洗干凈，并用吸水紙吸干，稱取適量肝組織剪碎，加入50 mmol/L PBS溶液(含KCl 150 mmol/L，蔗糖250 mmol/L，pH 7.5)，制成5%的組織勻漿。9000×g冷凍離心20 min，上清液100000×g冷凍高速離心60 min，沉淀為肝微粒體。將肝微粒體蛋白中加入80 mmol/L PBS，重懸微粒體，手動勻漿器研磨，-80 ℃保存待用。BCA法準確測定蛋白濃度，微粒體蛋白提取方法采用的是差速離心法，無法采用GAPDH和β-actin作為內(nèi)參。按照Western blot法測定細胞色素P450酶亞型的表達，采用Quantity One軟件對免疫熒光條帶進行光密度值分析，比較細胞色素P450酶亞型表達的相對變化。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析

3 實驗結(jié)果

3.1 小鼠肝臟中細胞色素P450酶主要亞型mRNA表達結(jié)果

實驗采用RT-PCR法考察了原兒茶酸和原兒茶醛對小鼠肝臟中細胞色素P450酶主要亞型mRNA的表達，如圖1中A所示，原兒茶酸對Cyp1a2的mRNA表達有上調(diào)作用，說明原兒茶酸能夠誘導(dǎo)Cyp1a2的mRNA表達增加，對Cyp2c37、Cyp2d9的mRNA表達無調(diào)節(jié)作用(圖1 B、C所示)。

圖1 原兒茶酸對C57BL/6小鼠肝臟中細胞色素P450 酶主要亞型mRNA的表達l.)

如圖2中A所示，原兒茶醛對Cyp1a2的mRNA的表達有上調(diào)作用，但作用不顯著，說明原兒茶醛也可能誘導(dǎo)Cyp1a2的mRNA表達增加，原兒茶醛對Cyp2c37、Cyp2d9的mRNA表達無調(diào)節(jié)作用(圖2B、C所示)。

圖2 原兒茶醛對C57BL/6小鼠肝臟中細胞色素P450 酶主要亞型mRNA的表達l.)

圖3 原兒茶酸對C57BL/6小鼠肝臟細胞色素P450 酶亞型蛋白表達的影響± S，n=3)

圖4 原兒茶醛對C57BL/6小鼠肝臟細胞色素P450 酶亞型蛋白表達的影響± S，n=3)

3.2 細胞色素P450酶主要亞型表達的結(jié)果

通過免疫熒光結(jié)果結(jié)合吸光度值分析發(fā)現(xiàn)，如圖3中1A2，2E1所示，原兒茶酸對CYP1A2與CYP2E1蛋白的表達有誘導(dǎo)作用，且能誘導(dǎo)CYP1A2與CYP2E1表達顯著升高，說明原兒茶酸能夠顯著誘導(dǎo)CYP1A2與CYP2E1蛋白的表達，對其他蛋白亞型均無誘導(dǎo)或者抑制作用。

如圖4中1A2所示，原兒茶醛對1A2蛋白的表達有誘導(dǎo)作用，能使CYP1A2蛋白顯著增高，說明原兒茶醛能夠顯著誘導(dǎo)1A2蛋白的表達，對其他幾種蛋白亞型無誘導(dǎo)或抑制作用。

4 討 論

本實驗通過蛋白質(zhì)印記和定量PCR的手段探究藥物對CYP450酶表達水平的影響。mRNA的表達對酶的含量有影響同時對酶的活性有一定的作用，通過mRNA表達結(jié)果可以間接了解P450酶的活性。實驗結(jié)果表明原兒茶酸與原兒茶醛對CYP450酶幾種主要亞型的mRNA表達的影響的結(jié)果與其對蛋白表達影響的結(jié)果基本一致。原兒茶酸與原兒茶醛對CYP1A2蛋白的誘導(dǎo)作用明顯，CYP1A2 參與約8.9%臨床藥物的代謝，有咖啡因、非那西丁、氯氮平、茶堿、他克林、丙米嗪、多環(huán)芳烴類致癌物以及咪唑喹啉哌等20多種藥物[18]。實驗結(jié)果提示與該類藥物聯(lián)合使用時應(yīng)該注意原兒茶酸與原兒茶醛可能導(dǎo)致肝藥酶含量增加，從而降低了藥物半衰期，應(yīng)該適當(dāng)增加給藥劑量。

同時，原兒茶酸對CYP2E1蛋白的誘導(dǎo)作用明顯，CYP2E1的外源性底物超過70 余種, 大部分具有中性、相對分子質(zhì)量低(< 100)及親脂性較高的特點。CYP2E1也參與代謝和糖異生相關(guān)的多種內(nèi)源性物質(zhì)(酮體和脂肪酸)。CYP2E1酶功能活性可被其底物或非底物的內(nèi)、外源性化合物調(diào)控，如胰島素和乙醇等。CYP2E1被認為是機體對環(huán)境和工業(yè)毒物或致癌物敏感程度的重要決定因素[19]。此外，一些鹵化麻醉劑包括氟烷，恩氟烷、異氟醚和七氟醚，以及對乙酰氨基酚、氯唑沙宗、三甲雙酮等多種藥物也主要通過CYP2E1代謝[20]。實驗結(jié)果提示與該類藥物聯(lián)合使用時應(yīng)該注意原兒茶酸可能導(dǎo)致肝藥酶含量增加，從而降低了藥物半衰期，應(yīng)該適當(dāng)調(diào)整給藥劑量。

綜上所述，原兒茶酸與原兒茶醛可顯著誘導(dǎo)CYP1A2的mRNA和蛋白表達，且原兒茶酸使CYP2E1的蛋白表達量升高。兩種化合物對小鼠細胞色素P450酶的表達影響，為后續(xù)研究與這兩種化合物相關(guān)的藥物間的相互作用提供了實驗數(shù)據(jù)。由于藥物對肝臟代謝酶的影響存在種屬差異等問題, 有關(guān)研究還待繼續(xù)深入。

[1] 南京藥學(xué)院四季青科研小組.心季青的藥理研究[J]. 中草藥通訊,1971, 2(3): 33.

[2] 張秀麗, 李亞晨, 牛新華, 等.原兒茶酸對帕金森模型鼠腦組織抗氧化能力的影響[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展, 2011, 11(17): 3248-3251.

[3] CHAN K, CHUI S H, WONG D Y L, et al. Protective effects of Danshensu from the aqueous extract of Salvia miltiorrhiza (Danshen) against homocysteine-induced endothelial dysfunction[J]. Life Sciences, 2004, 75(26): 3157-3171.

[4] TSENG T H, WANG C J, KAO E S. Hibiscus protocatechuic acid protects against oxidative damage induced by tert-butylhydroperoxide in rat primary hepatocytes[J]. Chemico-Biological Interactions, 1996, 101(2): 137-148.

[5] TSENG T H, KAO T W, CHU C Y, et al. Induction of apoptosis by hibiscus protocatechuic acid in human leukemia cells via reduction of retinoblastoma (RB) phosphorylation and Bcl-2 expression[J]. Biochemical Pharmacology, 2000, 60(3): 307-315.

[6] TANAKA T, KAWAMORI T, OHNISHI M, et al. Chemoprevention of 4-nitroquinoline 1-oxide-induced oral carcinogenesis by dietary protocatechuic acid during initiation and postinitiation phases[J]. Cancer Research, 1994, 54(9): 2359-2365.

[7] GUAN S, GE D, LIU T Q, et al. Protocatechuic acid promotes cell proliferation and reduces basal apoptosis in cultured neural stem cells[J]. Toxicology in Vitro, 2009, 23(2): 201-208.

[8] ZHANG H N, AN C N, ZHANG H N, et al. Protocatechuic acid inhibits neurotoxicity induced by MPTP in vivo[J]. Neuroscience Letters, 2010, 474(2): 99-103.

[9] 韓純潔, 林蓉, 劉俊田, 等.原兒茶醛對ox-LDL 損傷的血管內(nèi)皮細胞保護作用[J]. 中藥材, 2007, 30(12): 1541-1544.

[10] 徐宗佩, 張伯禮, 李尚珠, 等.中藥單體原兒茶醛對瘀血證患者單核細胞趨化游走能力的影響[J]. 天津中醫(yī), 2002, 19(1): 49-49.

[11] 楊東明, 蘇世文, 李銑, 等.五靈脂活性成分的研究[J]. 藥學(xué)學(xué)報, 1987, 22(10): 756-760.

[12] 陳克奇, 李尚珠, 周宇, 等.原兒茶醛對血瘀證患者外周血單個核細胞趨化游走能力變化的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2001, 17(11): 1064-1066.

[13] MEYER U A. Overview of enzymes of drug metabolism[J]. Journal of Pharmacokinetics and Biopharmaceutics, 1996, 24(5): 449-459.

[14] WRIGHTON S A, VANDENBRANDEN M, RING B J. The human drug metabolizing cytochromes P450[J]. Journal of Pharmacokinetics and Biopharmaceutics, 1996, 24(5): 461-473.

[15] 王丹, 張振清, 阮金秀. 中藥對細胞色素 P450 誘導(dǎo)或抑制作用的影響因素[J]. 解放軍藥學(xué)學(xué)報, 2008, 24(3): 242-244.

[16] 謝瑞芳, 周昕. 中藥對細胞色素 P450代謝影響的研究進展[J]. 中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué), 2009, 14(6): 697-701.

[17] 張家劍. 中藥有效成分對細胞色素 P450 酶基因表達的影響[D]. 長春：吉林大學(xué), 2008.

[18] OR P M Y, LAM F F Y, KWAN Y W, et al. Effects of Radix Astragali and Radix Rehmanniae, the components of an anti-diabetic foot ulcer herbal formula, on metabolism of model CYP1A2, CYP2C9, CYP2D6, CYP2E1 and CYP3A4 probe substrates in pooled human liver microsomes and specific CYP isoforms[J]. Phytomedicine International Journal of Phytotherapy & Phytopharmacology, 2012, 19(6):535-544.

[19] GONZALEZ F J. Role of cytochromes P450 in chemical toxicity and oxidative stress: studies with CYP2E1[J]. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 2005, 569(1): 101-110.

[20] VIOLETTA K K, HANNA S, WANDA B D. Modulation of cytochrome P450 and phase II enzymes by protocatechuic acid in mouse liver and kidney[J]. Toxicology, 2005, 216(1):24-31.

Effects of Protocatechuic Acid and Protocatechualdehyde on the Expression of Mouse Hepatic Cytochrome P450s

Zhang Xiaoyan, Xu Haimiao, Wang Dujun, Wang Kai, Sui Danjuan, Wei Yuan*

(School of Pharmacy, Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China)

Objective: To investigate the modulatory effects of protocatechuic acid and protocatechualdehyde on the expression of mouse hepatic cytochrome P450s in both mRNA and protein levels. Methods: C57BL/6 mice were randomly divided into control (0.9% saline), protocatechuic acid and protocatechualdehyde (6 mg/kg), and phenobarbital (80 mg/kg) groups. The mice were administered by oral gavage every 48 hours for two weeks. Total mRNA was extracted from liver tissue and reverse transcript for RT-PCR analysis. Liver microsome was also prepared for protein analysis. Results: RT-PCR results showed that theCyp1a2 mRNA was significantly induced by protocatechuic acid and protocatechualdehyde compared with control group (P<0.05). Western blot results showed that CYP1A2 protein was significantly induced by protocatechuic acid and protocatechualdehyde. CYP2E1 protein was also induced by protocatechuic acid. No effects were observed on other P450s. Conclusion: Mouse hepatic CYP1A2 expression could be significantly induced by protocatechuic acid and protocatechualdehyde in mRNA and protein expression. CYP2E1 protein expression was also induced by protocatechuic acid.

potocatechuic acid; protocatechualdehyde; cytochrome P450; expression levels

10.3969/j.issn.1006-9690.2017.01.006

2016-03-18

國家自然科學(xué)基金項目(81102522，811373480，81202793)；江蘇省自然科學(xué)基金項目(BK2011473)。

張曉燕(1990—)，女，碩士生，研究方向：中藥藥理和毒理學(xué)研究。E-mail：991066470@qq.com

*通訊作者： 魏淵(1981—)，男，博士，副教授，研究方向：細胞色素P450酶系相關(guān)的藥物代謝與毒理，藥物基因組學(xué)。

R963

A

1006-9690(2017)01-0018-04

E-mail：ywei@ujs.edu.cn