王冬梅， 畢可波， 周雪松， 薛友榮， 方 圓， 方希修,4*

(1. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300；2. 中國農(nóng)業(yè)廣播電視學(xué)校文登分校，山東 文登 264400；3. 江蘇濱?？h農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 濱海 224500；4.江蘇康諾農(nóng)業(yè)科技有限公司，江蘇 濱海 224500)

濱海白首烏粉發(fā)酵試驗(yàn)

王冬梅1， 畢可波2， 周雪松3， 薛友榮3， 方 圓4， 方希修1,4*

(1. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300；2. 中國農(nóng)業(yè)廣播電視學(xué)校文登分校，山東 文登 264400；3. 江蘇濱?？h農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 濱海 224500；4.江蘇康諾農(nóng)業(yè)科技有限公司，江蘇 濱海 224500)

目的：通過制備固態(tài)復(fù)合微生物制劑與白首烏粉發(fā)酵試驗(yàn)，為白首烏粉發(fā)酵飲料制備提供科學(xué)依據(jù)。方法：選用枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、保加利亞乳桿菌、乳酸菌等菌最優(yōu)培養(yǎng)基，各菌種經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)大后分別接種到以白首烏粉為原料的發(fā)酵培養(yǎng)基。分別測(cè)定固態(tài)復(fù)合微生物制劑的蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗纖維的含量，測(cè)定菌體生物量、粗蛋白含量和總蛋白得率；分析發(fā)酵白首烏粉的氨基酸變化。結(jié)果：固態(tài)復(fù)合微生物制劑的有效活菌總數(shù)為3.09×109g-1，菌體生物量為5.69 g/L，菌體總蛋白得率為0.194 g/L。發(fā)酵前白首烏粉氨基酸總量為7.119 g/100g，其中精氨酸與谷氨酸含量比較高，分別達(dá)到1.833 g/100g，1.241 g/100g；測(cè)得發(fā)酵后白首烏粉氨基酸總量為7.369 g/100g，其中精氨酸與谷氨酸含量比較高，分別達(dá)到1.591 g/100g，1.245 g/100g。發(fā)酵后，精氨酸和胱氨酸減少，其他氨基酸不同程度的增加。結(jié)論：制備的固態(tài)復(fù)合微生物制劑活細(xì)菌數(shù)量能夠保證白首烏粉的發(fā)酵，發(fā)酵后白首烏粉部分氨基酸含量增加，改善了白首烏粉的品質(zhì)，為白首烏飲料制備提供依據(jù)。

復(fù)合微生物制劑；白首烏；飲料

濱海白首烏(耳葉牛皮消)是世界上唯一生長在中國的物種，是中國傳統(tǒng)的食、藥、美容兼用植物。白首烏味甘、苦，性微溫，含有C21甾苷等生物活性物質(zhì)與多種營養(yǎng)成分，具有補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，益精血，健脾消食，解毒療瘡等功效[1]。白首烏粉是采用新鮮白首烏經(jīng)過脫皮，烘干粉碎而成。復(fù)合微生物制劑由多種微生物復(fù)合組成，性質(zhì)穩(wěn)定，功能廣泛[2-6]。目前微生物發(fā)酵技術(shù)常采用復(fù)合微生物制劑中的一種或幾種的混合發(fā)酵工藝。本研究以白首烏粉為發(fā)酵的主原料，選用枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、保加利亞乳桿菌、乳酸菌等作為發(fā)酵菌種制備固態(tài)復(fù)合微生物制劑，為生產(chǎn)發(fā)酵型白首烏乳飲料提供實(shí)驗(yàn)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 主要菌種及其來源

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)、乳酸菌(Lactobacillus)等菌種來自于江蘇康諾農(nóng)業(yè)科技有限公司與江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院營養(yǎng)研究所。

1.2 主要培養(yǎng)基

枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏4.5 g，蛋白胨9 g，NaCl 5 g，H2O 1 000 mL，pH 7.2～7.4，121 ℃，滅菌20 min。

保加利亞乳桿菌用培養(yǎng)基：牛肉膏4.8 g，蛋白胨9.5 g，乳糖4.9 g，吐溫80(Tween 80) 1 g，L-半胱氨酸0.11 g，H2O 1 000 mL，pH 7，121 ℃，滅菌15 min。

乳酸菌用培養(yǎng)基：蛋白胨 9.5 g，牛肉膏10.5 g，酵母膏 5.3 g，K2HPO4·3H2O 2 g，乙酸鈉4.5 g，葡萄糖 19 g，吐溫80 0.8 g，檸檬酸二銨 2 g，MgSO4·7H2O 0.59 g，MnSO4·4H2O 0.28 g，瓊脂 14 g，加蒸餾水1 000 mL，pH 6.2，120 ℃，15 min滅菌備用。

1.3 主要儀器設(shè)備

CRDX-28型高壓蒸汽滅菌器(上海安亭科學(xué)儀器廠)，GNP-9050型隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn))，GZX-DH-2630A型恒溫干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠生產(chǎn))，LDZ5-2型離心機(jī)(杭州雷琪實(shí)驗(yàn)器材有限公司生產(chǎn))，ALC-110.4型電子分析天平(深圳市泰立儀器儀表有限公司生產(chǎn))，THZ-82A臺(tái)式恒溫振蕩器(常州國華電器有限公司生產(chǎn))，B-324全自動(dòng)凱氏定氮儀(瑞士BUCHI公司生產(chǎn))，HN-12A紅外線消煮爐(上海勇規(guī)分析儀器有限公司生產(chǎn))，SP-7569C紫外分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司生產(chǎn))。

1.4 固態(tài)復(fù)合微生物制劑的制備

利用厭氧發(fā)酵，按發(fā)酵培養(yǎng)基4%的量將乳酸菌二級(jí)乳酸菌菌種接種到乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，混勻，密封發(fā)酵，時(shí)間2.5 d。利用好氧發(fā)酵，按發(fā)酵培養(yǎng)基4%的量將各二級(jí)芽孢桿菌菌種分別接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，混勻，時(shí)間2.5 d。將白首烏脫皮、烘干，粉碎過40目篩，制成白首烏粉，滅菌，冷卻，備用。

1.5 白首烏粉發(fā)酵飲料的制備

固體發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度30 ℃，控制pH值為7.1，發(fā)酵時(shí)間為24 h，得到發(fā)酵白首烏粉。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵后的產(chǎn)物放入烘箱中，58 ℃烘干粉碎后過40目篩。產(chǎn)品烘干后的水分含量低于12.5%。

1.6 測(cè)定指標(biāo)

1.6.1 發(fā)酵后的活菌數(shù)

取1 mL發(fā)酵培養(yǎng)液，生理鹽水稀釋后，用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定活菌數(shù)。固態(tài)復(fù)合微生物制劑活細(xì)菌數(shù)計(jì)數(shù)采用平板計(jì)數(shù)法，用含2%瓊脂的，將含乳酸菌的菌液涂布在MRS平板上，然后覆蓋一層瓊脂，28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)[7-9]。

1.6.2 菌體生物量測(cè)定

取發(fā)酵液，4 000 r/min離心10 min，蒸餾水洗滌3次，收集菌體，冷凍干燥，稱重。

1.6.3 菌體粗蛋白質(zhì)(CP)含量測(cè)定

菌體粗蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用國標(biāo)GB 50095—2010。

1.6.4 總蛋白得率計(jì)算[10]

菌體總蛋白得率(g/L)=菌體生物量(g/L)×菌體CP含量(%)。

1.7 固態(tài)復(fù)合微生物制劑營養(yǎng)成分分析

粗蛋白：采用凱氏半微量定氮法，KJELTEC 8400全自動(dòng)定氮儀(瑞典FOSS.TECATOR公司生產(chǎn))測(cè)定；粗脂肪：SZF-06A脂肪測(cè)定儀(上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn))測(cè)定；粗纖維：按GB/T 6434—2006方法測(cè)定。

1.8 氨基酸含量的測(cè)定方法

采用柱前衍生-高效液相色譜法[11-12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 固態(tài)復(fù)合微生物制劑中活細(xì)菌數(shù)含量

通過微生物發(fā)酵培養(yǎng)復(fù)配制成固態(tài)復(fù)合微生物制劑，測(cè)定其活細(xì)菌數(shù)量，固態(tài)復(fù)合微生物制劑有效活菌總數(shù)分別為3.09×109g-1，表明菌劑能在活細(xì)菌數(shù)量方面保證能在動(dòng)物機(jī)體中發(fā)揮作用。

2.2 固態(tài)復(fù)合微生物制劑中各種營養(yǎng)成分的含量

由表1可以看出：固態(tài)復(fù)合微生物制劑其營養(yǎng)成分均發(fā)生了明顯變化。固態(tài)復(fù)合微生物制劑中的各種微生物利用原料營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)生了蛋白質(zhì)、酶和氨基酸等營養(yǎng)成分。結(jié)果見表1。

表1 固態(tài)復(fù)合微生物制劑營養(yǎng)成分測(cè)定結(jié)果 g/L

2.3 氨基酸分析結(jié)果

取白首烏粉與發(fā)酵后的白首烏粉，利用Agilent 1100高效液相色譜儀分別快速測(cè)定了其水解氨基酸含量，測(cè)得未發(fā)酵白首烏粉氨基酸總量為7.119 g/100 g，其中精氨酸與谷氨酸含量比較高，分別達(dá)到1.833 g/100 g，1.241 g/100 g；測(cè)得發(fā)酵后白首烏粉氨基酸總量為7.369 g/100 g，其中精氨酸與谷氨酸含量比較高，分別達(dá)到1.591 g/100 g，1.245 g/100 g。發(fā)酵后，精氨酸和胱氨酸減少，其他氨基酸不同程度的增加。結(jié)果見表2。

表2 白首烏粉發(fā)酵前后氨基酸成分分析結(jié)果比較

氨基酸名稱發(fā)酵前含量(g/100g)發(fā)酵后含量(g/100g)含量變化(%)天門冬氨酸0.6740.7095.19谷氨酸1.2411.2450.32絲氨酸0.1620.1670.50組氨酸0.1480.1772.90甘氨酸0.2920.32310.62蘇氨酸0.1950.22113.33精氨酸1.8331.591-13.20丙氨酸0.4260.48814.55酪氨酸0.1310.1444.52胱氨酸0.0160.015-6.25纈氨酸0.2800.32817.14蛋氨酸0.0650.07515.38苯丙氨酸0.2640.29712.50異亮氨酸0.2360.27014.41亮氨酸0.3000.35618.67賴氨酸0.2950.34215.93脯氨酸0.5610.62110.70總氨基酸7.1197.3693.51

3 討 論

復(fù)合微生物制劑是由兩種或多種微生物按合適比例共同培養(yǎng)，充分發(fā)揮群體的聯(lián)合作用優(yōu)勢(shì)，取得最佳應(yīng)用效果的一種微生物制劑[13]。用于工業(yè)發(fā)酵的微生物主要包括枯草芽孢桿菌、乳酸桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌等。其適宜生長溫度是30～37℃，適宜pH為7.0～7.2。芽孢桿菌是一類好氧菌，能在一定條件下產(chǎn)生芽孢，具有耐高溫，耐酸堿和耐壓等特點(diǎn)。枯草芽孢桿菌能夠產(chǎn)生蛋白酶、α-淀粉酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、果膠酶和木聚糖酶等十幾種酶[14]。蠟樣芽孢桿菌是一種常用的益生菌。蠟狀芽孢桿菌通過產(chǎn)生各種酶類抑制、降解、水解其他的病原體，也是表現(xiàn)在生物防治應(yīng)用上的一種途徑。蠟狀芽孢桿菌產(chǎn)生的酶類包括溶菌酶[15]、氨基酸轉(zhuǎn)氨酶[16]、酰胺酶[17]、纖溶酶[18]等。蠟樣芽孢桿菌進(jìn)入腸道后，主要消耗腸道內(nèi)氧氣，創(chuàng)造厭氧環(huán)境，促進(jìn)厭氧菌生長，能夠調(diào)整腸道菌群失調(diào)，改善微生態(tài)環(huán)境，能有效地抑制有害好氧菌，促進(jìn)有益厭氧菌生長。乳酸菌對(duì)胃酸性環(huán)境有一定的耐受性，在動(dòng)物體內(nèi)可以通過生物拮抗、降低pH值來阻止和抑制致病菌的進(jìn)入和定植，減少有害物質(zhì)的產(chǎn)生。

本研究制備的固態(tài)復(fù)合微生物制劑主要菌種均為通常認(rèn)為是安全的可直接食用的微生物菌種，包括枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)、乳酸菌(Lactobacillus)等。研究發(fā)現(xiàn)，固態(tài)復(fù)合微生物制劑的有效活菌總數(shù)分別為3.09×109g-1，菌體生物量分別為5.69 g/L，菌體總蛋白得率別為0.194 g/L。測(cè)得未發(fā)酵白首烏粉氨基酸總量為7.119 g/100 g，其中精氨酸與谷氨酸含量比較高；測(cè)得發(fā)酵后白首烏粉氨基酸總量為7.369 g/100 g，其中精氨酸與谷氨酸含量比較高。發(fā)酵后，精氨酸和胱氨酸減少，其他氨基酸不同程度的增加。制備的固態(tài)復(fù)合微生物制劑活細(xì)菌數(shù)量能夠保證白首烏粉的發(fā)酵，發(fā)酵后白首烏粉部分氨基酸含量增加，提高了白首烏粉的品質(zhì)，為白首烏飲料制備提供了技術(shù)依據(jù)。

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Fermentation Test of BinhaiCynanchumbungeiPowder

Wang Dongmei1,Bi Kebo2, Zhou Xuesong3, Xue Yourong3, Fang Yuan4, Fang Xixiu1,4 *

(1. Jiangsu Agricultural and Husbandry College , Taizhou 225300, China; 2.Wendeng Branch School of China Agricultural Broadcasting and Television School, Wendeng 264400, China;3. Binhai Institute of Agricultural Science and Technology of Jiangsu, Binhai 224500, China;4. Jiangsu Kangnuo Agricultural Science and Technology Co., Ltd., Binhai 224500, China)

Objective: The production parameters was provided byCynanchumbungeipowder drink by preparation of complex microorganisms and fermentation test ofCynanchumbungeipowder. Method:Bacillussubtilis,Bacilluscereus,Lactobacillusbulgaricus,Lactobacillusand other bacteria optimal medium were selected, each cultured bacteria were inoculated inCynanchumbungeipowder. The protein, crude fat, crude fiber of solid-state complex microbial agents , the amount of biomass, crude protein content and total protein percentage were measured, the fermentationCynanchumbungeipowder amino acid was analyzed. Results: The total effective viable solid-state complex microbial agents was 3.09 × 109g, the amount of the biomass was 5.69 g/L and total bacterial proteins percentage was 0.194 g/L of solid compound microbial agents.Total amino acids of the pre-fermentationCynanchumbungeipowder was 7.119 g/100g, and arginine and glutamic acid content were relatively high, reached 1.833 g/100g, 1.241 g/100g; the total amount of flour amino acid fermentationCynanchumbungeipowder was 7.369 g/100g, and arginine and glutamic acid content were relatively high, reached 1.591 g/100g, 1.245 g/100g. The arginine and cystine content was reduced and other amino acids increased in varying degrees after fermentation. Conclusion: TheCynanchumbungeipowder fermentation can be guaranteed, because sufficient solid compound microbial preparation of live bacteria.Some amino acids was increased inCynanchumbungeipowder after fermentation and the qualityCynanchumbungeipowder is improved. It provided the evidence ofCynanchumbungeipowder beverage preparation.

complex microbial agents;Cynanchumbungei; drink

10.3969/j.issn.1006-9690.2017.01.007

2016-05-18

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新項(xiàng)目[CX(14)2139]。

TS26

A

1006-9690(2017)01- 0022-04

*通訊作者： 方希修(1965—)，男，博士，教授，研究方向：分子免疫與分子營養(yǎng)代謝調(diào)控。