許雷來郎雅麗謝璐帆謝小紅

華蟾素注射液對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞E-cad、N-cad表達(dá)的影響

許雷來1郎雅麗1謝璐帆1謝小紅

目的觀察華蟾素注射液對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞E-cad、N-cad表達(dá)的影響，探討華蟾素注射液對乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響，探討華蟾素注射液抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制。方法采用四氮唑藍(lán)（MTT）比色法觀察高、中、低劑量華蟾素注射液（100mg/L、25mg/L、6.25mg/L）對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響；實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測法檢測MDA-MB-231細(xì)胞中E-cad/N-cad mRNA表達(dá)水平；蛋白印跡法（Westernblot）檢測MDA-MB-231細(xì)胞中E-cad/N-cad蛋白表達(dá)水平。結(jié)果高濃度組華蟾素注射液48h對MDA-MB-231細(xì)胞抑制率較中、低劑量組明顯（54.54%比50.20%、37.80%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示空白對照組、華蟾素注射液高劑量組、中劑量組、低劑量組E-cad相對表達(dá)量依次為（1.05±0.04）%、（8.77± 1.54）%、（3.74±1.56）%、（1.64±0.30）%，N-cad相對表達(dá)量依次為（1.18±0.19）%、（0.34±0.19）%、（0.79± 0.20）%、（0.84±0.07）%。華蟾素可以上調(diào)E-cad表達(dá)，下調(diào)N-cad表達(dá)，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。Westernblot結(jié)果顯示華蟾素注射液能降低N-cad蛋白的表達(dá)，上調(diào)E-cad蛋白的表達(dá)。結(jié)論華蟾素能通過上調(diào)E-cad表達(dá)和下調(diào)N-cad表達(dá)，抑制MDA-MB-231細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）轉(zhuǎn)變，從而降低乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。

乳腺癌；MDA-MB-231細(xì)胞；華蟾素注射液；E-cad/N-cad

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，乳腺癌經(jīng)手術(shù)治療后5年內(nèi)仍然有50%的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。腫瘤的轉(zhuǎn)移或侵襲是復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的主要原因，而其中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的發(fā)生起到至關(guān)重要的作用[1]。EMT過程中主要分子標(biāo)志的改變包括細(xì)胞黏附相關(guān)基因E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達(dá)下調(diào)，間葉細(xì)胞標(biāo)志物N-鈣黏蛋白（N-cadherin）表達(dá)上調(diào)[2]。華蟾素注射液主要成分是蟾毒靈和吲哚生物堿等，為干蟾皮的水化萃取物，有研究發(fā)現(xiàn)華蟾素對乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移具有抑制作用[3]，但其作用機(jī)制是否與EMT相關(guān)尚未見報導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)通過觀察華蟾素注射液對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞E-cad、N-cad表達(dá)的影響，探討華蟾素注射液抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞及試劑乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株，購自上海優(yōu)選生物科技有限公司。華蟾素注射液購自安徽金蟾生化股份有限公司，每支5mL，批號1504 08-1。鼠抗E-cad單克隆抗體、兔抗N-cad單克隆抗體購自英國Abcam公司；單克隆兔抗人β-actin抗體、二抗山羊抗兔抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自加拿大MBI Fermentas公司，實(shí)時熒光定量PCR試劑盒購自美國ABI公司。

1.2 主要儀器Realtime-PCR儀（ABI 7900型），水平電泳槽（北京君意東方儀器公司，JY-SPC），DG-Ⅲ雙穩(wěn)數(shù)顯電泳儀（北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心），高速離心機(jī)（SIGMA，1-13），蛋白質(zhì)印跡成像和定量分析系統(tǒng)（型號：FluorChem Q）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（MTT比色法）將MDA-MB-23細(xì)胞以1×104/mL濃度接種于96孔板細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液后接種至96孔板，每孔200μL，每組5個復(fù)孔，培養(yǎng)1天后吸棄培養(yǎng)液，分別用華蟾素注射液（按1:5、1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320稀釋）處理。繼續(xù)培養(yǎng)至相應(yīng)時間點(diǎn)（3h、6h、12h、24h、36h、48h、72h）后，每孔加MTT（5mg/ml）20μL，37℃繼續(xù)孵育4h后棄上清液，每孔加入150μL DMSO（二甲基亞砜）。酶標(biāo)儀測定490nm吸光度值（A490），并計算細(xì)胞相對存活率。相對存活率=實(shí)驗(yàn)組吸光度值平均值/對照組吸光度值平均值×100%。

2.2 實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）實(shí)驗(yàn)通過qRT-PCR檢測各組細(xì)胞N-cad、E-cad mRNA的表達(dá)水平。常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，平均分瓶，待細(xì)胞長滿時按實(shí)驗(yàn)分組加藥干預(yù)，48h時后按試劑盒說明書逐步提取總RNA，紫外分光光度儀測定RNA樣品純度，各組樣品吸光度比值均在1.8～2.1之間，按試劑盒說明書逐步合成cDNA，再以cDNA為模板，與基因特異性引物，通過PCR擴(kuò)增E-cad和N-cad。對解離曲線進(jìn)行分析，確保只有單一產(chǎn)物被擴(kuò)增。最終進(jìn)行測定分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。內(nèi)參選用GAPDH，由上海優(yōu)選生物科技有限公司設(shè)計合成引物。引物序列見表1。E-CAD、N-cad mRNA表達(dá)水平的計算方法：以GAPDH作為內(nèi)參照，以△Ct=△Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因；△△Ct=△Ct最低樣本-△Ct其他個樣本，推導(dǎo)計算相對表達(dá)量（RQ）=2-△△Ct。

表1 各基因PCR引物序列

2.3 蛋白印跡法（Westernblot）實(shí)驗(yàn)通過Westernblot檢測各組細(xì)胞N-cad、E-cad蛋白表達(dá)量。設(shè)空白對照及低、中、高濃度華蟾素注射液（6.25mg/L、25mg/L、100mg/L）處理細(xì)胞24h，裂解細(xì)胞，分別取30μg蛋白量的細(xì)胞總蛋白樣品上樣。60V電泳積聚蛋白，90V電壓使蛋白分離，110V轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2h。用單克隆兔抗人β-actin抗體（1∶400）、單克隆鼠抗人的E-cadherin（1∶50）、單克隆兔抗人的N-cadherin（1∶500）分別與膜接觸4℃孵育過夜。TBS-T洗滌6次，每次10min；羊抗兔HRP（武漢博士德，1∶1000）；Rabbit Anti-Mouse IgG H&L（HRP）（ab6728）1:5000.TBS-T稀釋至1mL，置于parafilm封口膜上，室溫孵育2h。TBST洗滌3三次，每次10min。ECL顯色液（millipor）溶液A 0.5mL溶液B 0.5mL?；旌暇鶆蚝箫@色。凝膠成像，蛋白質(zhì)印跡成像和定量分析系統(tǒng)（quantitative gel and western blot imaging system）（型號：FluorChem Q）顯色，曝光。以E-cad、N-cad與β-actin的比值代表蛋白相對表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0軟件，組間差異采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 對細(xì)胞毒性的影響MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，12、24、48h時各濃度華蟾素注射液對MDA-MB-231細(xì)胞增殖具有顯著的抑制作用。以48h時最為明顯，高劑量（1∶5稀釋，終濃度為100mg/L）組MDA-MB-231抑制率為54.54%，高于中劑量組（1∶20稀釋，終濃度為25mg/L）的50.20%和低劑量組（1∶80稀釋，終濃度為6.25mg/L）的37.80%（P<0.05）。見圖1。

圖1 各濃度華蟾素華蟾素注射液對MDA-MB-231細(xì)胞毒性作用

3.2 對E-cad、N-cad mRNA表達(dá)的影響qRTPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白對照組及華蟾素注射液高、中、低劑量組E-cad相對表達(dá)量依次為（1.05±0.04）%、（8.77±1.54）%、（3.74±1.56）%、（1.64±0.30）%，N-cad相對表達(dá)量依次為（1.18±0.19）%、（0.34±0.19）%、（0.79±0.20）%、（0.84±0.07）%。結(jié)果顯示，華蟾素上調(diào)E-cad表達(dá)，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000<0.01）；華蟾素下調(diào)N-cad表達(dá)，與空白對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002<0.01）。見圖2。

3.3 對E-cad、N-cad蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果經(jīng)灰度值分析后顯示，隨著華蟾素注射液濃度的提高，MDA-MB-231細(xì)胞中E-cad蛋白表達(dá)逐漸上調(diào)，N-cad的表達(dá)逐漸下調(diào)，見圖3。

4 討論

研究表明，華蟾素對乳腺癌細(xì)胞侵襲具有抑制作用[4]。目前以其療效確切，毒副作用小而廣泛運(yùn)用于臨床，成為我國臨床上應(yīng)用較廣的一種中藥抗腫瘤制劑[5]。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，以EMT作為研究切入點(diǎn)，進(jìn)一步觀察華蟾素注射液對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞E-cad、N-cad表達(dá)的影響，明確其對乳腺癌細(xì)胞EMT的調(diào)控作用，從而初步闡述華蟾素注射液抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制。

圖2 各組細(xì)胞E-cad及N-cad表達(dá)情況

圖3 各組細(xì)胞E-cad、N-cad蛋白表達(dá)

E-cadherin和N-cadherin都屬于鈣黏附素(Cadherin）家族，E-cad分子之間通過胞外的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域相互形成鏈接，并通過胞漿內(nèi)的α、β連接素與肌動蛋白骨架相連，從而形成穩(wěn)定的細(xì)胞間接觸，因此E-cad水平的下降可以導(dǎo)致細(xì)胞黏附力降低[6-7]。N-cad可以克服E-cad介導(dǎo)的細(xì)胞間牢固的黏附而影響上皮細(xì)胞的形態(tài)和行為，誘導(dǎo)其向間質(zhì)轉(zhuǎn)化，直接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤，使癌細(xì)胞轉(zhuǎn)為具有浸潤性的惡性表型[8]。EMT中E-cad表達(dá)下降而N-cad表達(dá)上升的過程被稱為鈣黏蛋白轉(zhuǎn)化，這可能是癌細(xì)胞向間質(zhì)侵襲轉(zhuǎn)移的原因[9]。

本研究通過實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測和蛋白印跡法（Westernblot）檢測結(jié)果表明，華蟾素注射液可以通過上調(diào)E-cad的表達(dá)和下調(diào)N-cad的表達(dá)，增加細(xì)胞的黏附，抑制鈣黏蛋白轉(zhuǎn)化的發(fā)生，從而延緩EMT的發(fā)生，與文獻(xiàn)報道相符[10]。

綜上所述，華蟾素注射液可以通過上調(diào)E-cad的表達(dá)和下調(diào)N-cad的表達(dá)從而延緩乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞發(fā)生EMT，在抑制乳腺癌細(xì)胞的基礎(chǔ)上降低乳腺癌細(xì)胞的侵襲力和遷移力。但華蟾素抑制EMT現(xiàn)象的實(shí)現(xiàn)是否與現(xiàn)在正在研究的TGF-β信號通路、Wnt信號通路、Notch信號通路等相關(guān)[11]仍需要進(jìn)一步的研究，這也為我們后續(xù)的研究提供了良好的研究思路。

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（收稿：2016-08-28修回：2016-10-10）

Effect of Huachansu Injection on E-cad and N-cad in Breast Cancer Cell Line MDA-MB-231

XU Leilai1, LANG Yali1,XIE Lufan1,XIE Xiaohong2.1 Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China;2 Department of Breast Surgery,the First Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006), China

ObjectiveTo investigate the effect of huachansu injection on the expressions of E-cad and N-cad in breast cancer cell line MDA-MB-231,in order to explore the inhibiting effect of huachansu injection on the metastasis of breast cancer.MethodsMTT assay was applied to observe the proliferation of MDA-MB-231 cells after treatment with high,medium and low doses of huachansu injection（100mg/L,25mg/L and 6.25mg/L）.The expressions of E-cad and N-cad mRNA and protein in test cells were detected by qRT-PCR and western blot,respectively.ResultsThe high dose group of huachansu injection had a higher cell inhibition effect at 48 hours compared with the medium dose group and low dose group（54.54%vs 50.20%,37.80%,P<0.05）.qRT-PCR results showed that the expressions of E-cad mRNA in high,medium and low doses of huachansu injection groups were up-regulated and the expression of N-cad mRNA was up-regulated compared with those in blank control group[E-cad:（8.77±1.54）%,（3.74±1.56）%,（1.64±0.30）%vs（1.05±0.04）%,P<0.01;N-cad:（0.34±0.19）%,（0.79±0.20）%,（0.84±0.07）%vs（1.18±0.19）%,P<0.01]and the similar results in E-cad and N-cad proteins were observed by western blot（P<0.05）.ConclusionHuachansu injection can inhibit the EMT transition of MDA-MB-231 cells through down-regulating N-cad and up-regulating E-cad,so as to decreasing the migration and invasive ability of the cancer cells.

breast cancer;MDA-MB-231 cells;huachansu injection;E-cad/N-cad

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.LY12H16008)；浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動計劃暨新苗人才計劃（No.2015R410026）

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)（杭州310053）；2浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院乳腺外科（杭州310006）

謝小紅，Tel：15990149351；E-mail：xxh666857@163.com