劉建方趙國強(qiáng)

當(dāng)歸對(duì)膠原性關(guān)節(jié)炎模型大鼠血清MCP-1、MMP-3的影響

劉建方趙國強(qiáng)

目的觀察當(dāng)歸對(duì)膠原性關(guān)節(jié)炎（CIA）模型大鼠血清單核細(xì)胞趨化因子-1（MCP-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）的影響。方法清潔級(jí)Wistar大鼠30只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、膠原性關(guān)節(jié)炎（CIA）模型組、甲氨蝶呤組和當(dāng)歸低、高劑量組，每組6只。除空白對(duì)照組外，采用Ⅱ型膠原免疫法制備膠原性關(guān)節(jié)炎模型。、甲氨蝶呤組每次給藥1mg/kg，每周2次，腹腔注射；當(dāng)歸低、高劑量組分別灌飼當(dāng)歸煎液0.75g（kg·d）和1.5g（kg·d），空白對(duì)照組和模型組灌飼等量生理鹽水，持續(xù)3周。觀察大鼠血清MCP-1、MMP-3及大鼠關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)。結(jié)果造模后，各藥物組大鼠血清MCP-1、MMP-3均明顯升高（P＜0.05）。與CIA模型組比較，甲氨蝶呤組、當(dāng)歸高劑量組大鼠MCP-1均有降低[（139.20±11.69）pg/mL、（151.64±13.42）pg/mL比（179.21±13.79）pg/mL，P＜0.05]；甲氨蝶呤組、當(dāng)歸高劑量組大鼠MMP-3均有降低[（1.57±0.19）ng/mL、（1.69±0.21）ng/mL比（2.04±0.27）ng/mL，P＜0.05]；甲氨蝶呤組、當(dāng)歸高劑量組的大鼠關(guān)節(jié)腫脹評(píng)分均有降低[（2.83±0.41）分、（3.33±0.52）分比（3.83± 0.41）分，P＜0.05）]。結(jié)論當(dāng)歸能不同程度降低膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠血清MCP-1、MMP-3含量，且同時(shí)減輕大鼠關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)。

大鼠；膠原性關(guān)節(jié)炎；當(dāng)歸；MCP-1；MMP-3；關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種以慢性多關(guān)節(jié)炎癥為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病，最終常致關(guān)節(jié)畸形[1-2]。單核細(xì)胞趨化因子-1（MCP-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）作為重要的細(xì)胞炎癥參與因子，在機(jī)體免疫性疾病中扮演重要的角色。筆者通過觀察當(dāng)歸煎液對(duì)大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎（CIA）血清MCP-1、MMP-3的變化，了解當(dāng)歸對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康清潔級(jí)Wistar大鼠30只，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙）2013-0180，體質(zhì)量220～250g，由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供并常規(guī)飼養(yǎng)。大鼠分籠飼養(yǎng),每籠6只，室溫20～22℃，通過自動(dòng)換氣裝置調(diào)節(jié)室內(nèi)空氣，人工調(diào)節(jié)熒光照明，每天明暗各12h，常規(guī)全價(jià)飼料喂養(yǎng)，自由飲食、飲水。

1.2 藥物及主要試劑當(dāng)歸購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，取當(dāng)歸500g，加適量蒸餾水浸30min，煮沸10min后小火再30min，過濾；殘?jiān)俅渭诱麴s水煮沸，再小火30min，反復(fù)3～4次，濃縮至100mL。最后用蒸餾水調(diào)制到1000mL，制成每毫升含0.5g生藥的當(dāng)歸煎液。依照人體單位體質(zhì)量生藥量求得大鼠的單位體質(zhì)量生藥量,4℃冰箱保存?zhèn)溆?。Ⅱ型膠原：美國sigma試劑公司，批號(hào)（060069）；不完全弗氏佐劑：美國sigma試劑公司，批號(hào)（104K8926）；MCP-1序列號(hào)（CSB-E08478r）、MMP-3ELISA序列號(hào)（CSB-E08534r）試劑盒：由美國ADL公司分裝，杭州方順生物技術(shù)有限公司提供，。

1.3 動(dòng)物模型建立SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用Ⅱ型膠原誘導(dǎo)法制備CIA模型[3]：將Ⅱ型膠原溶解于0.1mol/L的冰乙酸中制備Ⅱ型膠原溶液（終濃度為2g/L），將Ⅱ型膠原溶液滴加至冷的等體積不完全弗氏佐劑中，充分乳化。于第1天及第7天下午3時(shí)進(jìn)行Ⅱ型膠原乳化劑注射，醫(yī)用酒精消毒后每只大鼠尾部多點(diǎn)注射，每點(diǎn)約0.1mL，注射總量0.5mL。術(shù)后注意創(chuàng)面消毒，保持清潔。空白對(duì)照組給予生理鹽水注射，其他操作同造模組。

1.4 動(dòng)物分組與給藥SD大鼠30只按數(shù)字隨機(jī)表法隨機(jī)分為空白對(duì)照組、膠原性關(guān)節(jié)炎（CIA）模型組、甲氨蝶呤組、當(dāng)歸低劑量組和當(dāng)歸高劑量組，每組6只。CIA造模成功后1周開始給藥。空白對(duì)照組及CIA模型組每日給予等量生理鹽水；甲氨蝶呤組每周周一、周四上午9時(shí)給予甲氨蝶呤1mg/kg，腹腔內(nèi)注射；當(dāng)歸低劑量組每日上午9時(shí)予0.5g/mL當(dāng)歸煎液0.75g灌飼；當(dāng)歸高劑量組每日9時(shí)和16時(shí)灌飼當(dāng)歸煎液0.75g/d，各1次。各組均連續(xù)給藥3周。

1.5 標(biāo)本制備與指標(biāo)檢測（1）給藥前及給藥過程中記錄各組大鼠的關(guān)節(jié)腫脹部位及程度，采用腫脹指數(shù)評(píng)分系統(tǒng)[4]進(jìn)行評(píng)價(jià)。0分：無關(guān)節(jié)炎；1分：小趾關(guān)節(jié)輕度腫脹；2分：小趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹；3分：踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；4分：包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)全部關(guān)節(jié)腫脹。（2）血清標(biāo)本制備：予2%戊巴比妥鈉（40mg/ kg）腹腔麻醉，仰臥固定，乙醇消毒后，緩慢抽取大鼠頸動(dòng)脈血1mL，置于PE管中，3000r/min離心l0min，分離血清，于-70℃凍存，待全部實(shí)驗(yàn)結(jié)束后采用ELISA法測定血清MCP-1、MMP-3含量，操作嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均數(shù)比較用單因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸煎液對(duì)大鼠關(guān)節(jié)腫脹的影響與空白對(duì)照組比較，余四組大鼠關(guān)節(jié)腫脹評(píng)分增高（P＜0.05）；與CIA模型組比較，甲氨蝶呤組、當(dāng)歸高劑量組大鼠關(guān)節(jié)腫脹評(píng)分均明顯降低（P＜0.05）；當(dāng)歸低劑量組大鼠關(guān)節(jié)腫脹評(píng)分與CIA模型組比較有降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。當(dāng)歸低、高劑量組關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)均高于甲氨蝶呤組（P＜0.05）；低、高劑量當(dāng)歸組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 四組大鼠給藥前后關(guān)節(jié)腫脹評(píng)分比較

表1 四組大鼠給藥前后關(guān)節(jié)腫脹評(píng)分比較

注：與CIA模型組比較，*P＜0.05；與甲氨蝶呤組比較，▲P＜0.05；與空白對(duì)照組比較；△P＜0.05；CIA：膠原性關(guān)節(jié)炎

?

2.2 當(dāng)歸煎液對(duì)大鼠血清MCP-1、MMP-3的影響與空白對(duì)照組比較，CIA模型組、甲氨蝶呤組及不同劑量當(dāng)歸組大鼠血清MCP-1、MMP-3均明顯升高（P＜0.05）。與CIA模型組比較，甲氨蝶呤組、當(dāng)歸高劑量組大鼠血清MCP-1、MMP-3明顯降低（P＜0.05）。當(dāng)歸低劑量組血清MCP-1、MMP-3較CIA模型組降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與甲氨蝶呤組比較，當(dāng)歸高、低劑量組血清MCP-1、MMP-3均升高（P＜0.05）。當(dāng)歸低、高劑量組血清MCP-1、MMP-3比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

3 討論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎為難治性自身免疫性疾病，如沒有有效治療，往往造成關(guān)節(jié)畸形和強(qiáng)直[5]。研究表明，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病程中，MCP-1等趨化因子在炎性細(xì)胞遷移、浸潤過程中起了重要作用[6]。大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎模型，能夠很好模擬類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的臨床特點(diǎn)和病理改變，因此常用它來證實(shí)某些臨床藥物對(duì)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療機(jī)制和臨床效果[3]。

表2 各組大鼠給藥前后血清MCP-1、MMP-3水平比較

表2 各組大鼠給藥前后血清MCP-1、MMP-3水平比較

注：與空白對(duì)照組比較，△P<0.05；與CIA模型組比較，*P<0.05；與低劑量當(dāng)歸組比較，#P<0.05；與甲氨蝶呤組比較，▲P<0.05；MCP-1：單核細(xì)胞趨化因子-1；MMP-3：基質(zhì)金屬蛋白酶-3

?

MCP-1是機(jī)體內(nèi)一種常見的細(xì)胞趨化因子，主要通過促使炎性細(xì)胞特別是單核細(xì)胞等的遷移、浸潤，造成局部關(guān)節(jié)軟骨破壞、病變[7]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明[8-9]，將MCP-1注射到兔的關(guān)節(jié)內(nèi)，滑膜上出現(xiàn)顯著的巨噬細(xì)胞浸潤；從類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑膜液中也可檢測到高滴度的MCP-1，兩者均提示MCP-1是風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎重要的致病性細(xì)胞因子。本研究顯示，CIA模型組在制模后3周血清MCP-1濃度明顯增加，說明MCP-1參與了膠原性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）能使細(xì)胞外基質(zhì)的所有蛋白成分降解，從而導(dǎo)致韌帶、軟骨及骨的破壞。MMPs的活化被認(rèn)為是細(xì)胞外基質(zhì)降解的限速環(huán)節(jié)[10]，機(jī)體組織內(nèi)的金屬蛋白酶組織抑制劑可抑制MMPs的活性，從而保持一種動(dòng)態(tài)平衡，一旦平衡打破，多種病理過程就會(huì)隨之產(chǎn)生[11]。MMP-3為基質(zhì)金屬蛋白酶組的一種，與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎關(guān)系最為密切，在晚期類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)滑膜中，MMP-3的基因和蛋白均有過度表達(dá)，滑膜液中含有大量MMP-3，血清中濃度也明顯升高[12-14]。研究發(fā)現(xiàn)，CIA模型組在制模后3周，MMP-3血清平均值較空白對(duì)照組升高近一倍，提示MMP-3可能是疾病作用機(jī)制中的一個(gè)因子。而通過甲氨蝶呤和高劑量當(dāng)歸的持續(xù)應(yīng)用，大鼠MMP-3平均濃度均有明顯下降，說明當(dāng)歸煎液能夠明顯減少膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠中血清MMP-3的產(chǎn)生，從而抑制MMP-3對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的進(jìn)一步破壞。

當(dāng)歸為多個(gè)中藥湯劑的主要成分，如當(dāng)歸芍藥湯劑、當(dāng)歸補(bǔ)血湯等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)歸對(duì)機(jī)體多個(gè)系統(tǒng)有明顯的保護(hù)作用[15-17]，當(dāng)歸水浸出液可顯著增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能；其次，它還有非特異性的抗炎作用，包括對(duì)關(guān)節(jié)的急、慢性炎癥有顯著的抑制作用，降低炎性因子的含量，減少毛細(xì)血管的通透性，減輕水腫。以當(dāng)歸為主的湯劑治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎可能正是通過以上途徑來阻止關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)展，從而減輕和改善關(guān)節(jié)及全身癥狀。本組CIA制模后給予不同劑量的當(dāng)歸煎液持續(xù)3周，不同程度減少大鼠關(guān)節(jié)腫脹，減輕組織水腫，關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)較CIA模型組減少，能夠明顯減少參與關(guān)節(jié)炎癥的細(xì)胞趨化因子如MCP-1濃度。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高劑量當(dāng)歸煎液組用藥后3周血清平均MCP-1較CIA模型組明顯下降（P＜0.05），提示高濃度當(dāng)歸煎液能夠顯著減少M(fèi)CP-1的產(chǎn)生。然而當(dāng)歸高低劑量組與甲氨蝶呤組相比，MCP-1血清濃度還是明顯升高，顯示通過單一的當(dāng)歸作用機(jī)制，很難完全控制住膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠體內(nèi)某些細(xì)胞因子水平，也不能阻斷疾病的繼續(xù)發(fā)展。但當(dāng)歸作為湯劑的一個(gè)有效成分，是否能夠與中藥湯劑中的其他成分一起發(fā)揮作用，從而通過減少機(jī)體內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶、細(xì)胞趨化因子等方法控制疾病，值得進(jìn)一步研究。

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（收稿：2016-08-14修回：2016-10-09）

Effect of Chinese Angelica on MCP-1 and MMP-3 in Rats with Collagen-induced Arthritis

LIU Jianfang, ZHAOGuoqiang.DepartmentofOrthopedics,Children'sHospital,SchoolofMedicine,ZhejiangUniversity, Hangzhou(310051),China

ObjectiveTo investigate the effect of Chinese angelica on the expression of serum monocyte chemotactic protein 1（MCP-1）and matrix metalloproteinase-3（MMP-3）in collagen-induced arthritis（CIA）model rats.MethodsThirty Wistar rats were randomly divided into blank control group,CIA model group, methotrexate group,and low and high doses of Chinese angelica groups,with 6 rats in each group.Except for blank control group,CIA models were established in other four groups.Methotrexate group

methorexate intraperitoneally twice a week,1mg/kg.Chinese angelica decoction was given to rats by gavage at dose of 0.75g（kg· d）and 1.5g（kg·d）in low and high doses of Chinese angelica groups,respectively.Blank control group and model group were administered with equivalent volume of saline.The treatment course lasted for 3 weeks.The serum levels of MCP-1 and MMP-3 were observed and the swelling scores of rats'joints were calculated.ResultsThe serum MCP-1 and MMP-3 increased in all CIA rats（P<0.05）.Compared with model group,methotrexate group and high dose of Ch-inese angelica group had decreased serum MCP-1（139.20±11.69pg/mL,151.64±13.42pg/mL vs 179.21±13.79pg/mL,P<0.05）and serum MMP-3（1.57±0.19ng/mL,1.69±0.21ng/mL vs 2.04±0.27ng/mL,P< 0.05）,and lower swelling score of the joints（2.83±0.41,3.33±0.52 vs 3.83±0.41,P<0.05）.ConclusionChinese angelica can reduce the serum level of MCP-1 and MMP-3 and alleviate the swelling of the joints in rats with CIA.

rats;collagen-induced arthritis;Chinese angelica;MCP-1;MMP-3;joint swelling index

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2013ZA085）

浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院骨科（杭州310051）

趙國強(qiáng)，Tel：13858020847；E-mail：friendlongzju@163.com