鄭造乾駱瑾瑜陳燕華王小軍

探針?biāo)幬锓ㄔu(píng)價(jià)苦碟子注射液對(duì)大鼠肝微粒體CYP3A4的體外抑制作用

鄭造乾駱瑾瑜陳燕華王小軍

目的觀察苦碟子注射液對(duì)大鼠肝微粒體CYP3A4的體外抑制作用與CYP3A4酶底物合用藥時(shí)可能產(chǎn)生的相互作用。方法采用SD大鼠肝微粒體體外孵育法，設(shè)陰性對(duì)照組、陽(yáng)性抑制劑對(duì)照組和苦碟子注射液組。利用高效液相色譜法測(cè)定底物睪酮的減少量，計(jì)算得到IC50,評(píng)價(jià)苦碟子注射液對(duì)大鼠肝微粒體CYP3A4酶的抑制活性，以酮康唑?yàn)殛?yáng)性對(duì)照藥。結(jié)果在體外人肝微粒體孵育體系中，當(dāng)Tris-HCl緩沖液濃度為0.1mol/L，pH為7.4，溫度為37℃時(shí)，睪酮最佳反應(yīng)底物濃度為100μmol/L，最佳孵育時(shí)間為40min，最佳蛋白濃度為0.5mg/mL。陽(yáng)性抑制劑酮康唑的IC50值為0.0707μmol/L，表明孵育體系滿足CYP3A4酶抑制活性的評(píng)價(jià)要求。9個(gè)不同體積終濃度（0、0.01%、0.10%、0.20%、0.50%、1.00%、2.00%、5.00%、10.00%）的苦碟子注射液對(duì)CYP3A4酶的相對(duì)抑制率分別為0，2.94%、16.44%、22.70%、31.44%、37.47%、46.37%、51.74%和60.40%，半數(shù)抑制率IC50值為3.46%，高于其日用藥量濃度。結(jié)論在體外正常劑量下，苦碟子注射液對(duì)人CYP3A4無(wú)明顯抑制作用，可以與其底物聯(lián)合用藥。

苦碟子注射液；鼠肝微粒體；CYP 3A4；抑制作用

苦碟子注射液（kudiezi injection，KDZi）是以菊科苦荬菜屬抱莖苦荬菜[ixeris sonchifolia（Bunge）Hance]的全草為原料提取精制而成的靜脈注射劑，其主要成分為黃酮、有機(jī)酸、倍半萜內(nèi)酯以及核苷類成分[1-2]，具有改善微循環(huán)、抗血小板凝聚、降血脂和抗腫瘤等作用[3]。臨床常用于冠心病、心絞痛、腦梗死治療。合并用藥非常普遍、復(fù)雜[4-5]。細(xì)胞色素P450（CYP450）酶是人體內(nèi)重要的藥物代謝酶，參與臨床約75%的藥物代謝，其中CYP3A4約占50%，其被抑制或誘導(dǎo)會(huì)影響藥物的體內(nèi)過(guò)程，從而出現(xiàn)嚴(yán)重的藥物相互作用。本研究采用大鼠肝微粒體混合酶體外代謝體系，以睪酮為探針?biāo)幬铮ㄟ^(guò)HPLC測(cè)定CY P3A4酶探針底物睪酮的減少量，評(píng)價(jià)KDZi對(duì)CYP3 A4酶活性的影響，以評(píng)估和預(yù)測(cè)其與CYP3A4底物合用時(shí)產(chǎn)生藥物相互作用的可能性和影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物雄性SD大鼠6只，由浙江省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SXCK（浙）-0010755，清潔級(jí)，體質(zhì)量（200±20）g；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，參考GB 14924.1-2001《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物配合飼料通用質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[6]；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房使用許可證號(hào)為SYXK（浙）2014-0003，溫度為23±2℃，濕度為（50±10）%；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前在動(dòng)物房中適應(yīng)7天，每籠2只，自由進(jìn)食和飲水。

1.2 儀器Agilent 1200高效液相色譜儀（Agilent，USA），配有在線脫氣機(jī)、四元梯度洗脫泵、柱溫箱、DAD檢測(cè)器及ChemStation化學(xué)工作站；Spectrum lab 52型紫外分光光度儀（上海棱光技術(shù)有限公司）；純水儀（PURELAB Ultra Genetic，英國(guó)ELGA公司）；超低溫冰箱（-80℃ULT Freezer，Thermo Forma公司）；渦旋震蕩儀GBL-88B（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Centrifuge 5415，Eppendorf公司）；超高速離心機(jī)（OptimaTM MAX-XP Ultracentrifuge，貝克曼庫(kù)爾特實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司）。

1.3 藥品與試劑苦碟子注射液（KDZi）（批號(hào)：140915，規(guī)格：10mL，沈陽(yáng)雙鼎制藥有限公司）；苯巴比妥鈉注射液（批號(hào)140614，規(guī)格：0.1g/mL，上海新亞藥業(yè)有限公司）；睪酮、異枸櫞酸、異枸櫞酸脫氫酶、氧化/還原型輔酶Ⅱ（β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP/β-nicotinamide adenine dinucleotide phosphatereduced form，NADPH）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；牛血清白蛋白購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，購(gòu)自上海凌峰化學(xué)試劑公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大鼠肝微粒體的制備按照文獻(xiàn)[7]方法采用差速離心法制備大鼠肝微粒體。選取雄性SD大鼠6只，連續(xù)3天腹腔內(nèi)注射102mg/（kg·d）苯巴比妥鈉注射液，于末次給藥后將大鼠禁食24h并拉頸處死，開(kāi)腹取出肝臟并用濾紙吸干水分、稱重；立即于4℃的蔗糖溶液中清洗并用剪刀剪碎，反復(fù)清洗至無(wú)血色；按1g∶4mL加入0.25mol/L蔗糖溶液，在冰浴中用組織勻漿機(jī)制成勻漿并超聲分散30s；在4℃下，9000×g離心20min，取上清液，19 000×g離心20min，然后100 000×g離心55min；去除上清液，取沉淀用0.15mol/L的KCl懸浮均勻，然后100 000×g離心45min，取沉淀（肝微粒體）；最后將所得肝微粒體懸浮于20mmol/ mL的Tris-sucrose（pH7.4）緩沖液，并置于-80℃保存?zhèn)溆?。以上操作均?℃以下進(jìn)行。用考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）測(cè)定肝微粒體的蛋白濃度[8]。

2.2 肝微粒體體外孵育體系參照文獻(xiàn)[9]方法建立終體積為200μL的孵育體系，包括終濃度為14.9 mmol/L的異枸櫞酸（isocitric acid），0.035unit/mL異枸櫞酸脫氫酶（isocitric dehydrogenase），0.15mol/L的MgCl2，0.1mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH=7.4），0.5mg/ mL的大鼠肝微粒體蛋白，100μmol/L的探針底物睪酮和20μL系列濃度的苦碟子注射液（終濃度為0，0.01%，0.10%，0.20%，0.50%，1.0%，2.0%，5.0%，10.0%）或酮康唑溶液（終濃度0.001，0.010，0.050，0.100，1.0 00，5.000，10.000，20.000μmol/L）。37℃恒溫水浴振蕩預(yù)孵育3min后，加入2μL NADP/NADPH[（0.27mmol/ L）/（0.12mmol/L）]的1%NaHCO3溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，孵育40min后，用200μL的冰乙腈終止反應(yīng)。渦旋震蕩1min，13 000r/min離心10min，取上清液用0．22μm有機(jī)微孔膜過(guò)濾，用HPLC測(cè)定探針底物睪酮的濃度。每個(gè)濃度3個(gè)平行樣品。計(jì)算KDZi對(duì)CYP 3A4的抑制率及IC50值。整個(gè)孵育體系控制有機(jī)溶劑的體積濃度在＜1%。

2.3 HPLC檢測(cè)探針底物睪酮濃度色譜條件：色譜柱：Agilent Zorbax C18（200mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-水溶液（53∶47）；流速1.0mL/min，柱溫30℃，波長(zhǎng)245nm，進(jìn)樣量50μL。

2.4 CYP酶抑制作用的評(píng)價(jià)以IC50（50%inhibitory concentration）值為指標(biāo)，IC50為藥物在產(chǎn)生50%抑制作用時(shí)的藥物濃度。其值越小，表明藥物的抑制作用越強(qiáng)。IC50值計(jì)算如下：通過(guò)測(cè)定探針底物的剩余量確定CYP酶的抑制率。抑制率（%）=（不同體積濃度苦碟子組測(cè)得的探針底物睪酮量-陰性對(duì)照組測(cè)得的探針底物睪酮量）/陰性對(duì)照組測(cè)得的探針底物睪酮量×100%。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法每個(gè)數(shù)據(jù)為每組單獨(dú)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次的平均值。用GraphPad Prism6.0軟件將剩余活性對(duì)藥物濃度的對(duì)數(shù)值作圖計(jì)算IC50。采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以表示。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 HPLC測(cè)定睪酮的方法學(xué)考察在2.3色譜條件下，大鼠肝微粒體孵育體系按2.2項(xiàng)處理后，上清液中各物質(zhì)、KDZi中各成分與睪酮達(dá)到基線分離，不干擾測(cè)定。睪酮的出峰時(shí)間在6.064min，以睪酮濃度為橫坐標(biāo)（C），峰面積為縱坐標(biāo)（AUC），得標(biāo)準(zhǔn)曲線：AUC=46.985C+13.75，R2=0.9993（n=10），在0.2～200μmol/L的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，0.1、50、200μmol/L 3個(gè)濃度的睪酮的日內(nèi)和日間RSD分別＜8%和7%，提取回收率95.6%～103.5%，符合回收率在95%～105%的測(cè)定要求。

3.2 睪酮體外代謝條件考察及優(yōu)化最佳肝微粒體體外溫孵條件：體外肝微粒體混合酶系中，當(dāng)Tris-HCl緩沖液濃度為0.1mol/L，pH為7.4，溫度為37℃時(shí)，睪酮最佳反應(yīng)底物濃度為100μmol/L，最佳孵育時(shí)間為40min，最佳蛋白濃度為0.5mg/mL。

3.3 大鼠肝微粒體孵育體系的驗(yàn)證由酮康唑?qū)YP 3A4的抑制曲線計(jì)算得到IC50值。根據(jù)通用CYP酶抑制強(qiáng)度分級(jí)規(guī)則[10]，IC50＜1μmol/L為強(qiáng)抑制劑，1μmol/L＜IC50＜10μmol/L為中等強(qiáng)度抑制劑，IC50＞10μmol/L為弱抑制劑。首先用陽(yáng)性抑制劑酮康唑驗(yàn)證了大鼠肝微粒體孵育體系。酮康唑?qū)YP3A4表現(xiàn)出明顯的抑制作用，其IC50值為0.0707μmol/L，見(jiàn)圖1，符合參考文獻(xiàn)范圍（0.0238～0.0954）[11]，表明孵育體系滿足CYP3A4酶抑制活性的評(píng)價(jià)要求。

3.4 不同濃度苦碟子注射液對(duì)CYP3A酶活性的影響苦碟子注射液的原液分別取9個(gè)不同的體積終濃度（V/V），以陰性對(duì)照組活性為100%，計(jì)算KDZi不同體積終濃度的抑制率，相對(duì)百分活性=1-抑制率（%），用GraphPad Prism v6.0軟件按照非線性回歸計(jì)算出KDZi的IC50值為原液的3.46%，見(jiàn)圖2。KDZi對(duì)睪酮代謝的影響見(jiàn)表1。

圖1 不同濃度酮康唑溶液對(duì)CYP3A4酶抑制活性的影響

圖2 不同濃度KDZi對(duì)CYP3A4酶抑制活性的影響

表1 不同濃度苦碟子注射液對(duì)睪酮代謝的影響

表1 不同濃度苦碟子注射液對(duì)睪酮代謝的影響

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4 討論

目前，中-西藥聯(lián)用非常普遍，但是大部分中藥安全性和有效性的科學(xué)證據(jù)非常有限[12]。同藥物-藥物相互作用（Drug-Drug interaction，DDIs）一樣，中藥與中藥之間、中藥與西藥之間也有潛在藥物相互作用，從而導(dǎo)致藥物不良反應(yīng)和藥物不良事件，包括增加肝腎毒性、不正常出血、移植排斥和心血管崩潰等[13-14]，許多中藥是CYP450酶的底物、誘導(dǎo)劑和/或抑制劑，其中CYP3A4參與了市場(chǎng)上50%左右藥物的代謝。一般而言，酶抑作用所致的代謝性相互作用的臨床意義大于酶促作用。因此，考察藥物對(duì)CYP3A4酶的抑制作用，有助于評(píng)價(jià)藥物安全性，預(yù)測(cè)潛在的藥物相互作用，指導(dǎo)臨床合理用藥。

由于中藥注射劑的成分極其復(fù)雜，不能采用計(jì)算IC50通用的μmol/L單位，但苦碟子注射液通常通過(guò)靜脈滴注給藥，我們根據(jù)文獻(xiàn)采用體積百分濃度計(jì)算IC50的方法[15]，采用將不同體積的KDZi的原液加入到微粒體孵育體系中進(jìn)行孵育，通過(guò)測(cè)定底物睪酮的剩余量，計(jì)算出苦碟子注射液對(duì)CYP3A4的IC50為3.46%。KDZi說(shuō)明書推薦劑量為10～40mL/次，1天1次，以正常人血漿容量為5000mL計(jì)算，苦碟子在人體內(nèi)的濃度為0.20%～0.80%，遠(yuǎn)低于KDZi的半數(shù)抑制濃度3.46%。以上結(jié)果顯示，在正常使用劑量下，KDZi對(duì)大鼠肝微粒體CYP3A4幾乎未顯示抑制作用。因此，我們推測(cè)KDZi對(duì)CYP3A4酶產(chǎn)生有臨床意義的抑制作用的可能性很小。

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（收稿：2016-09-01修回：2016-09-23）

In vitro Inhibition of Kudiezi Injection on Rat Liver Microsomal CYP3A4 Using A Probe Drug

ZHENG Zaoqian1,LUO Jinyu2,CHEN Yanhua1,WANG Xiaojun1.1 Department of Pharmacy,2 Division of Nephrology, Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310012),China

ObjectiveTo investigate the in vitro inhibition of kudiezi injection（KDZi）on liver microsomal CYP3A4 in rats and the potential herb-drug interaction with drugs metabolized by CYP3A4 enzyme in clinical application.MethodsThe test groups included a negative control group,an inhibitor positive control group and a KDZi group.After incubating the rat liver microsomes with testosterone,a probe substrate,the reduction of testosterone were quantitated with HPLC,and IC50 values were calculated to assess the inhibitory effect of KDZi on rat CYP3A4 enzyme.Ketoconazole was used as a positive control.ResultsIn mixture metabolic system of liver microsome enzymes,the most suitable incubation concentration of testosterone was 100μmol/L,incubation time was 40 min and concentration of microsome protein was 0.5mg/mL,when the concentration of Tris-HCl buffer was 0.1mol/L（pH7.4）at 37℃.The results showed that the IC50 value of positive inhibitors of CYP3A4 was 0.0707μmol/L, which indicated that the incubation system satisfied the demands of CYP3A4 enzyme inhibition activity evaluation. The relative inhibitory rate of CYP3A4 in 9 serial volume concentration of KDZi（0,0.01%,0.10%,0.20%, 0.50%,1.00%,2.00%,5.00%,10.00%）were 0,2.94%,16.44%,22.70%,31.44%,37.47%,46.37%,51.74%,and 60.40%,respectively.The IC50 value of KDZi on CYP3A4 inhibition was 3.46%,which was exceeded their dailydose concentration.ConclusionIn ordinary condition,no significant interaction between KDZi and CYP3A4 is detected in vitro,which indicates that KDZi might be used with CYP3A4 enzyme substrates.

kudiezi injection;rat liver microsomes;CYP3A4;inhibitory effect

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2013ZB012）

浙江省立同德醫(yī)院藥學(xué)部（鄭造乾、陳燕華、王小軍）、血液凈化中心（駱瑾瑜）（杭州310012）

鄭造乾，Tel：13857143823；E-mail：zhengzaoqian@163.com