程玉霜，王慧艷，肖東

(南方醫(yī)科大學腫瘤研究所，廣州510515)

慢病毒介導RNA干擾HES1鼻咽癌穩(wěn)定細胞株的建立與鑒定

程玉霜，王慧艷，肖東

(南方醫(yī)科大學腫瘤研究所，廣州510515)

目的 建立穩(wěn)定干擾Split多毛增強子1(HES1)的鼻咽癌(NPC)細胞株，為進一步探討HES1對NPC的影響奠定基礎。方法 將293T細胞接種6孔板后隨機分為A、B、C、D、E組，分別瞬時轉(zhuǎn)染慢病毒質(zhì)粒shHES1-a、shHES1-b、shHES1-c、shHES1-d及空載質(zhì)粒shSCR，分別用qRT-PCR和Western blot法檢測HES1 mRNA及蛋白，篩選出最有效干擾質(zhì)粒；將最有效干擾質(zhì)?；蚩蛰d質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，獲得含最有效干擾質(zhì)?；蚩蛰d質(zhì)粒的病毒上清(LV-shHES1/LV-shSCR)。將NPC細胞CNE2和S18隨機分為觀察組和對照組，分別將LV-shHES1、LV-shSCR以濃度梯度方式感染細胞，分別采用qRT-PCR和Western blot法檢測HES1 mRNA及蛋白。結(jié)果 C組293T細胞中HES1 mRNA及蛋白相對表達量均低于其余各組(P均<0.05)。與對照組比較，觀察組CNE2和S18細胞中HES1 mRNA及蛋白相對表達量均降低(P均<0.05)。結(jié)論 成功建立穩(wěn)定干擾HES1的NPC細胞株。

鼻咽癌；Split多毛增強子1；RNA干擾；慢病毒載體； NPC細胞株

Split多毛增強子1(HES1)基因編碼轉(zhuǎn)錄因子HES1蛋白，屬于果蠅屬發(fā)狀基因在哺乳類動物的同系物[1]。研究表明，HES1是成體干細胞(如造血干細胞[2]、小腸干細胞[3，4]、黑色素干細胞[5]和胰腺干細胞[6]等)自我更新與增殖、干性維持、存活和(或)抑制干細胞分化等所必需的，常被用作干細胞標志物。鼻咽癌(NPC)是我國南方和東南亞常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病部位隱匿，是一種低分化、高轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤。已有研究[7]報道，HES1與Oct4和Sox2在NPC細胞上共表達。本研究采用RNA干擾(RNAi)技術(shù)，建立了穩(wěn)定干擾HES1的NPC細胞株，為進一步探討HES1對NPC的影響奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 HES1-shRNA慢病毒質(zhì)粒piLenti-shHES1-GFP-a(shHES1-a)、piLenti-shHES1-GFP-b(shHES1-b)、piLenti-shHES1-GFP-c(shHES1-c)和piLenti-shHES1-GFP-d(shHES1-d)及空載質(zhì)粒piLenti-shSCR-GFP(shSCR)均購自加拿大ABM公司，慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G由瑞士日內(nèi)瓦大學Didier Trono博士惠贈。高保真Taq DNA聚合酶、dNTP、限制性內(nèi)切酶、In-Fusion克隆試劑盒均購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自QIAGEN公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑LipofectamineTM2000、高糖DMEM、Opti-MEM I Medium等購自Invitrogen公司；培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板等購自Corning公司；其余試劑為國產(chǎn)或進口化學純或分析純。人源胚胎腎細胞293T來源和培養(yǎng)方法見文獻[8]；NPC細胞株(CNE2和S18)為南方醫(yī)科大學腫瘤研究所保存。

1.2 方法

1.2.1 最有效干擾序列的篩選 將293T細胞接種6孔板后隨機分為A、B、C、D、E組，分別采用LipofectamineTM2000瞬時轉(zhuǎn)染慢病毒質(zhì)粒shHES1-a、shHES1-b、shHES1-c、shHES1-d及空載質(zhì)粒shSCR，以上轉(zhuǎn)染均設2個復孔。24 h后倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，初步判斷轉(zhuǎn)染效果。48 h后提取以上細胞總RNA和蛋白，qRT-PCR和Western blot法檢測HES1表達，篩選出最佳干擾序列。①qRT-PCR法檢測HES1 mRNA：按照TaKaRa試劑說明書提取細胞中RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用Primer 5.0軟件設計HES1及內(nèi)參GAPDH基因PCR引物，HES1引物：上游5′-ACGTGCGAGGGCGTTAATAC -3′,下游5′-GGGGTAGGTCATGGCATTGA-3 ′;GAPDH引物:上游5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3 ′,下游5′-TCTAGACGGCAGGTCAGGTC-3′。反應體系(20 μL)：cDNA 2.0 μL、上下游引物 各2.0 μL、Rox Reference Dye Ⅱ(50×)SYBR0.4 μL、Green PCR Master Mix 10 μL、ddH2O 5.6 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。以2-ΔΔCt法計算HES1 mRNA相對表達量。②Western blot法檢測HES1蛋白：消化、收集上述細胞，提取細胞總蛋白。將蛋白電泳分離，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜；加兔抗人單克隆HES1抗體4 ℃過夜，加二抗室溫孵育1 h；以GAPDH為內(nèi)參，觀察蛋白表達強度的變化。以上實驗均重復3次。

1.2.2 慢病毒包裝 將293T細胞接種到25 cm2培養(yǎng)瓶中，待293T細胞融合度達80%～90%時進行病毒包裝，pMD2G∶psPAX2∶目的質(zhì)粒(最有效干擾質(zhì)?；蚩蛰d質(zhì)粒)=8∶15∶20。倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光，判斷293T細胞轉(zhuǎn)染效果。72 h后收集上清，以3 000 r/min離心15 min，直徑0.45 μm濾器過濾，獲得含最有效干擾質(zhì)粒或空載質(zhì)粒的病毒上清(LV-shHES1/LV-shSCR)。

1.2.3 干擾HES1細胞株的建立及HES1表達水平檢測 將CNE2和S18細胞隨機分為觀察組和對照組，分別將LV-shHES1、LV-shSCR以濃度梯度方式感染細胞，同時加入工作濃度為2 μg/mL的促感染試劑聚凝胺(Polybrene)，8 h后換至完全培養(yǎng)基。48～72 h后倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，并用2 μg/mL嘌呤霉素(GIBCO) 篩選細胞，獲得穩(wěn)定干擾HES1的NPC細胞株。提取其總RNA和蛋白，分別用qRT-PCR和Western blot法檢測HES1 mRNA及蛋白表達，方法同1.2.1。

2 結(jié)果

2.1 各組293T細胞中HES1 mRNA及蛋白表達比較 見表1。

表1各組293T細胞中HES1 mRNA及蛋白相對表達量±s)

注：與C組比較，*P<0.05。

2.2 兩組CNE2和S18細胞中HES1 mRNA及蛋白表達比較 見表2。

3 討論

目前，NPC的主要治療手段是放療和化療。隨著適形調(diào)強放療技術(shù)的推廣，NPC患者局部控制率得到顯著改善，但仍有20%～30%的中晚期NPC患者在5年內(nèi)發(fā)生復發(fā)與遠處轉(zhuǎn)移[16～18]。因此，尋找新型NPC治療靶點，減少復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移，對提高NPC的治療效果有著十分重要的意義。

表2兩組CNE2和S18細胞中HES1 mRNA及蛋白表達比較±s)

注：與對照組同類型細胞比較，*P<0.05。

HES屬于轉(zhuǎn)錄因子的堿性螺旋-環(huán)-螺旋(b-HLH)家族，它是一個轉(zhuǎn)錄抑制子，通過bHLH起作用[9]。與其他 b-HLH 轉(zhuǎn)錄因子不同，HES基因是在堿性DNA結(jié)合功能域擁有一個脯氨酸。這個脯氨酸使HES蛋白有了結(jié)合單一DNA分子的能力[10]。研究發(fā)現(xiàn)，在PC12細胞中，HES1抑制細胞生長，阻礙神經(jīng)生長因子誘導的細胞分化[11]。作為Notch的效應蛋白，HES1是一個神經(jīng)元分化的抑制子，在肌細胞生成、眼睛形態(tài)的變化以及T細胞系中起重要作用[12]。目前研究發(fā)現(xiàn)，HES1/HES5基因可通過下調(diào)Hash1表達抑制細胞分化，促進宮頸癌細胞增殖[13]。HES1在乳腺癌細胞中表達，可抑制雌激素所刺激的細胞增殖，以及雌激素所誘導的細胞周期調(diào)控因子E2F-1表達[18]。Dumont等[18]回顧性研究了15例胃腸道間質(zhì)腫瘤，認為HES1可作為預后判斷的一個分子標志物。

目前研究發(fā)現(xiàn)，HES1在NPC組織中高表達，可以使NPC上皮細胞發(fā)生間充質(zhì)樣轉(zhuǎn)化,并可以通過激活PTEN/AKT通路促進NPC的侵襲和轉(zhuǎn)移[19]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，HES1在NPC細胞株CNE2和S18中較永生化鼻咽上皮細胞NP69高表達；并且，與非癌鼻咽組織相比，HES1在NPC組織中高表達；通過RNA干擾下調(diào)NPC細胞中HES1表達，會導致NPC細胞中干性相關(guān)基因表達下調(diào)。本研究在此研究基礎上，利用RNAi技術(shù)建立了穩(wěn)定干擾HES1的NPC細胞株。今后，可通過沉默HES1的表達觀察其對NPC細胞株生物學特性的影響并探討其相關(guān)機制，為深入了解NPC發(fā)病的分子機制和篩選新的分子治療靶點奠定良好的基礎。

[1] Feder JN, Li L, Jan LY, et al. Genomic cloning and chromosomal localization of HRY, the human homolog to the Drosophila segmentation gene, hairy[J]. Genomics, 1994,20(1):56-61.

[2] Kunisato A, Chiba S, Nakagami-Yamaguchi E, et al. HES-1 preserves purified hematopoietic stem cells ex vivo and accumulates side population cells in vivo[J]. Blood, 2003,101(5):1777-1783.

[3] Kayahara T, Sawada M, Takaishi S, et al. Candidate markers for stem and early progenitor cells, Musashi-1 and HES1, are expressed in crypt base columnar cells of mouse small intestine[J]. FEBS Lett, 2003,535(1-3): 131-135.

[4] Riccio O, van Gijn ME, Bezdek AC, et al. Loss of intestinal crypt progenitor cells owing to inactivation of both Notch1 and Notch2 is accompanied by derepression of CDK inhibitors p27Kip1 and p57Kip2[J]. EMBO Rep, 2008,9(4):377-383.

[5] Moriyama M, Osawa M, Mak SS, et al. Notch signaling via HES1 transcription factor maintains survival of melanoblasts and melanocyte stem cells[J]. J Cell Biol, 2006,173(3):333-339.

[6] Stanger BZ, Stiles B, Lauwers GY, et al. Pten constrains centroacinar cell expansion and malignant transformation in the pancreas[J]. Cancer Cell, 2005,8(3):185-195.

[7] Zhang Y, Peng J, Zhang H, et al. Notch1 signaling is activated in cells expressing embryonic stem cell proteins in human primary nasopharyngeal carcinoma[J]. J Otolaryngol Head Neck Surg, 2010,39(2):157-166.

[8] Caulin C, Nguyen T, Lang GA, et al. An inducible mouse model for skin cancer reveals distinct roles for gain- and loss-of-function p53 mutations[J]. J Clin Invest, 2007,117(7):1893-1901.

[9] 趙璐晴,陳雪,曹亞. miRNA與鼻咽癌發(fā)病機制[J].科學通報,2011,56(1):9-15.

[10] 劉求真,姚開泰.腫瘤干細胞與腫瘤轉(zhuǎn)移[J]. 腫瘤學雜志,2008,14(1):10-15.

[11] 齊菲菲,賀福初,姜穎.腫瘤轉(zhuǎn)移研究的現(xiàn)狀與趨勢[J].生物化學與生物物理進展,2009,36(10): 1244-1251.

[12] Feder JN, Li L, Jan LY, et al. Genomic cloning and chromosomal localization of HRY, the human homolog to the Drosophila segmentation gene, hairy[J]. Genomics, 1994,20(1):56-61.

[13] Kageyama R, Ohtsuka T, Kobayashi T. The Hes gene family: repressors and oscillators that orchestrate embryogenesis[J]. Development, 2007,134(7):1243-1251.

[14] Muller P, Kietz S, Gustafsson JA, et al. The anti-estrogenic effect of all-trans-retinoic acid on the breast cancer cell line MCF-7 is dependent on HES-1 expression[J]. J Biol Chem, 2002,277(32):28376-28379.

[15] Kunnimalaiyaan M, Yan S, Wong F, et al. Hairy enhancer of Split-1 (HES-1), a Notch1 effector, inhibits the growth of carcinoid tumor cells[J]. Surgery, 2005,138(6):1137-1142.

[16] Liu J, Lu WG, Ye F, et al. HES1/Hes5 gene inhibits differentiation via down-regulating Hash1 and promotes proliferation in cervical carcinoma cells[J]. Int J Gynecol Cancer, 2010,20(7):1109-1116.

[17] Strom A, Arai N, Leers J, et al. The Hairy and Enhancer of Split homologue-1 (HES-1) mediates the proliferative effect of 17beta-estradiol on breast cancer cell lines[J]. Oncogene, 2000,19(51):5951-5953.

[18] Dumont AG, Yang Y, Reynoso D, et al. Anti-tumor effects of the Notch pathway in gastrointestinal stromal tumors[J]. Carcinogenesis, 2012,33(9):1674-1683.

[19] Messner AH, Lalakea ML.The effect of ankyloglossia on speech in children[J]. Otolaryngol Head Neck Surg, 2002,127(6):539-545.

Establishment and identification of NPC cell line for silencing HES1 gene by RNA interference

CHENGYushuang,WANGHuiyan,XIAODong

(CancerResearchInstitute,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China)

Objective To establish a nasopharyngeal carcinoma (NPC) cell line for silencing hairy and enhancer of split homolog-1 (HES1), and it will lay a foundation for further study on the effect of HES1 on NPC.Methods cell 293T inoculated on a 6-well plate were divided into groups A, B, C, D and E, which were instantaneously transfected with the recombinant lentiviruses (shHES1-a, shHES1-b, shHES1-c, shHES1-d and empty vector shSCR). The expression of HES1 was analyzed by qRT-PCR and Western blotting to identify the LV-shHES1 vector that had the highest gene knockdown efficiency. cell 293T were co-transfected with the most effective interference plasmid or no-load plasmid and lentiviral packaging plasmid to obtain the virus supernatant (LV-shHes1/LV-shSCR) containing the most effective interference plasmid or no-load plasmid.NPC cells CNE2 and S18 were randomly divided into the observation group and control group. LV-shHes1 and LV-shSCR were used to infect the cells in a concentration gradient manner, and the mRNA and protein of HES1 was detected by qRT-PCR and Western blot.Results The relative expression of HES1 mRNA and protein in 293T cells in the group C was lower than that in the other groups, and the difference was statistically significant (allP<0.05). Therefore, the shHES1-c interference efficiency was the best. Compared with the control group, the relative expression of HES1 mRNA and protein in both CNE2 and S18 cells of the observation group was decreased (allP<0.05). Conclusion NPC cell line for silencing HES1 gene by RNA interference was successfully established.

nasopharyngeal carcinoma; hairy and enhancer of split homolog-1; RNA interference; lentivirus expression vector; NPC cells

國家自然科學基金資助項目(81172587, 81372896，81672689)；廣東省自然科學基金資助項目(2014A030313294)。

程玉霜(1991-)，女，碩士研究生，主要研究方向為腫瘤干細胞與腫瘤誘導分化治療。E-mail： 1121089678@qq.com

肖東(1968-)，男，博士，研究員，博士生導師，主要研究方向為腫瘤干細胞與腫瘤誘導分化治療。E-mail： Xiao_d@hotmail.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.18.003

R739.62

A

1002-266X(2017)18-0009-03

2016-11-14)